李軍漢蘇全生孫君志張仲陽(yáng)

1成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系（四川 成都 610041）2北京體育大學(xué)研究生院（北京 100081）

運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠模型肝細(xì)胞凋亡的影響

李軍漢1，2蘇全生1孫君志1張仲陽(yáng)1

1成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系（四川 成都 610041）2北京體育大學(xué)研究生院（北京 100081）

目的：探討運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠模型肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法：70只雄性SD大鼠中隨機(jī)抽取20只為對(duì)照組，其余50只為模型組，對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第8周，對(duì)照組和模型組各取10只做肝臟病理切片。確定NAFLD模型成功后，模型組隨機(jī)分為4組：模型組（M組）、運(yùn)動(dòng)組（EM組）、飲食調(diào)整組（FM組）和運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整組（EFM組），每組各10只，對(duì)照組剩余10只大鼠編為C組。C組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，M組和EM組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，F(xiàn)M組和EFM組由高脂飼料改為普通飼料喂養(yǎng)；EM組、EFM組給予有氧游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，每周運(yùn)動(dòng)6 d，每天1次，每次60 min，連續(xù)8周，直至第16周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。油紅O染色觀察肝臟病理形態(tài)變化，TUNEL法測(cè)肝細(xì)胞凋亡，western blot檢測(cè)C/EBP同源蛋白（CHOP）、C-Jun氨基末端激酶（JNK）和Caspase12蛋白表達(dá)，免疫組化檢測(cè)CHOP、JNK和Caspase12蛋白陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果：（1）M組肝細(xì)胞脂滴數(shù)量顯著高于C組，各干預(yù)組脂滴數(shù)量介于C組和M組之間；（2）M組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)高于C組，CHOP、Caspase12、JNK蛋白表達(dá)及陽(yáng)性表達(dá)較C組高；各干預(yù)組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)低于M組，CHOP、Caspase12、JNK蛋白表達(dá)及陽(yáng)性表達(dá)較M組低；（3）M組、EM組、FM組、EFM組4組雙因素方差結(jié)果示：運(yùn)動(dòng)和飲食對(duì)CHOP、Caspase12、JNK蛋白表達(dá)具有主效應(yīng)，且二者具有疊加交互效應(yīng)。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與NAFLD的發(fā)展，運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整可延緩NAFLD的發(fā)展，且二者聯(lián)合作用效果更佳，其機(jī)制與運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CHOP、JNK和Caspase12在肝細(xì)胞的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；非酒精性脂肪肝；運(yùn)動(dòng)；飲食調(diào)整

非酒精性脂肪肝（non-alcoholicfattyliver disease，NAFLD）是由酒精和其他明確的肝損傷以外因素所致的臨床病理綜合征，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變?yōu)橹饕卣?，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化等[1]。近年來(lái)，NAFLD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人們健康，但其發(fā)生機(jī)制仍不清楚[2]。

研究表明肝細(xì)胞凋亡在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中扮演了非常重要的角色[3]。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡包括三條途徑：死亡受體途徑、線粒體介導(dǎo)途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的核心內(nèi)容是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[5]。ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑是由ERS引發(fā)的完全獨(dú)立于死亡受體途徑和線粒體途徑之外的另一條細(xì)胞凋亡途徑[6]。隨著對(duì)ERS的研究深入，ERS在細(xì)胞凋亡中起著重要作用已明確。ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑日益受到人們的重視。

NAFLD在臨床治療上尚無(wú)特效藥物[7]。目前，NAFLD的治療主要采用體重控制、飲食調(diào)整、胰島素致敏劑、降脂藥、腎素血管緊張素阻斷劑、熊去氧膽酸、肉堿藥物和運(yùn)動(dòng)治療等方法[8]。文獻(xiàn)[9，10]認(rèn)為改變生活方式可以改善肝脂肪病變，生活方式干預(yù)為治療NAFLD的首選方法。飲食調(diào)整被認(rèn)為是治療NAFLD的基本方法，也是預(yù)防和控制NAFLD進(jìn)展的重要措施之一[11]。有研究[12]報(bào)道NAFLD與活動(dòng)量少呈正相關(guān)。但迄今為止，運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)NAFLD的細(xì)胞分子機(jī)制還不明確。本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠NAFLD動(dòng)物模型，并采用運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)，探討運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)NAFLD細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SD雄性大鼠70只，SPF/VAF級(jí)，體重196. 16±6.96克，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCCD（川）2012-0001。SD大鼠在成都體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心小動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)和訓(xùn)練。分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，室溫18～22℃，相對(duì)濕度45%～55%，12小時(shí)光照和12小時(shí)熄燈模擬晝夜交替。

1.2 動(dòng)物分組

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，按體重編號(hào)，隨機(jī)抽取20只為對(duì)照組，其余50只為模型組。對(duì)照組予以普通飼料喂養(yǎng)，模型組予以高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第8周，對(duì)照組和模型組各取10只做肝臟冰凍切片，油紅O染色觀察肝臟脂滴生成情況，確定NAFLD模型造模成功后，模型組剩余大鼠隨機(jī)分為4組：模型組（M組）、運(yùn)動(dòng)組（EM組）、飲食調(diào)整組（FM組）和運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整組（EFM組），每組各10只，對(duì)照組剩余大鼠編為C組。C組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，M組和EM組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，F(xiàn)M組和EFM組由高脂飼料改為普通飼料喂養(yǎng)；EM組、EFM組給予有氧游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，連續(xù)8周，直至第16周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 飼料及配方

高脂飼料[13]配方：基礎(chǔ)飼料71.8%、豬油18%、膽固醇2.0%、膽鹽0.2%、蛋黃粉8%。基礎(chǔ)飼料和高脂飼料均由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司配制?；A(chǔ)飼料供能3.1 kcal/g，其中脂肪供能占12.5%；高脂飼料供能4.74 kcal/g，其中脂肪供能占50.95%。

1.4 運(yùn)動(dòng)方法

運(yùn)動(dòng)方式參照文獻(xiàn)報(bào)道[14]，干預(yù)前，EM、EFM組先進(jìn)行3 d適應(yīng)性游泳練習(xí)，每天1次，每次15 min，每天遞增10～20 min，經(jīng)1周增加至60 min，以后各周都維持此運(yùn)動(dòng)量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。訓(xùn)練時(shí)驅(qū)趕不游泳大鼠，以防漂浮水面。正式運(yùn)動(dòng)期間每周運(yùn)動(dòng)6 d，每天1次，每次60 min。運(yùn)動(dòng)條件：長(zhǎng)150 cm×寬60 cm×高70 cm的游泳池，水溫31±1℃，水深60 cm，超過(guò)大鼠身長(zhǎng)的2倍。

1.5 樣本采集與處理

對(duì)照組、模型組各取10只在實(shí)驗(yàn)第8周取材，C組、M組、EM組、FM組和EFM組在實(shí)驗(yàn)第16周取材。大鼠處死前先禁食12 h，稱體重后以2%戊巴比妥鈉溶液4 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，新潔爾滅消毒皮膚，以腹部正中切口打開(kāi)腹腔，肉眼觀察肝臟情況，迅速取出肝臟，置于4℃ 生理鹽水中反復(fù)漂洗。在肝左葉中部切取1 cm×1 cm×1 cm，放置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱儲(chǔ)存，用于Western bolt檢測(cè)。取肝右葉一部分用4%多聚甲醛固定，用于免疫組化及TUNEL檢測(cè)，另一部分固定包埋，用于冰凍切片和油紅O染色。

1.6 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.6.1 油紅 OO染色觀察肝組織脂滴分布

油紅O染色方法：肝臟冰凍切片（5 μm厚度）用于脂質(zhì)染色。脂滴為紅色，每張切片在200倍光鏡顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Image-Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算每個(gè)視野下紅色脂滴光密度，每張切片5個(gè)視野下紅色脂滴光密度相加后取平均值，用每組平均光密度表示紅色脂滴的多少，單位以AIOD.μm2表示。

1.6.2 TTUUNNEELL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。石蠟切片常規(guī)脫蠟，用流水沖洗，以20 μg/ml蛋白酶K在37℃ 下20 min孵育，去除組織蛋白。3次PBS浸洗，每次3 min；在樣本區(qū)域上滴加100 μl的Equilibration Buffer，5～10 min室溫平衡；于樣本區(qū)域上滴加100 μl的TdT酶反應(yīng)液，37℃，60 min避光孵育；將100 μl的2倍SSC溶液終止反應(yīng)滴加在反應(yīng)樣本區(qū)域，15 min室溫放置。3次PBS浸洗，每次3 min；滴加DAPI復(fù)染，5 min避光孵育；3次PBS洗，每次3 min；緩沖甘油封片后，在熒光顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞胞核顯示綠色熒光，復(fù)染DAPI的所有細(xì)胞胞核為藍(lán)色。從每張切片上隨機(jī)選擇3個(gè)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，取平均值，拍照。凋亡指數(shù)（AI%）=肝細(xì)胞凋亡數(shù)/肝細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6.3 western bblloott法測(cè)CCHHOOPP、Cassppaassee1122、JJNNKK蛋白的表達(dá)

將50 mg的冰凍肝組織置于勻漿器中，用剪刀盡量將組織塊剪碎，加入500 ml組織裂解液，反復(fù)研磨使組織盡量碾碎，30 min的裂解后，以2000 r/min，4℃離心組織勻漿10 min，取上清液，再以12，000 r/min，4℃ 離心30 min，回收上清液，取小部分上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白樣品（50 μg）經(jīng)12.5% SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔單抗CHOP（1∶4000，abcam公司）、兔單抗Caspase12（1∶2000，abcam公司）、兔單抗JNK（1：1000，abcam公司）和兔單抗β-actin（1∶1000，abcam公司）室溫孵育1 h后，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入相應(yīng)的HRP結(jié)合的羊抗兔IgG（1∶2000，abcam公司）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光液，1 min后于暗室內(nèi)進(jìn)行膠片曝光、顯影、定影、晾干。βactin作為內(nèi)參，并用Gelpro32圖像分析軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)量用光密度比值（OD ratio）表示，蛋白表達(dá)量用“目的蛋白/β-actin”計(jì)算。

1.6.4 免疫組化方法測(cè)CCHHOOPP、Cassppaassee1122、JJNNKK蛋白的平均光密度

免疫組化實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照SABC免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。切片脫蠟至水，PBS清洗，3% H2O2浸泡10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉液37℃孵育30 min，甩去血清，滴加兔單抗Caspase12（1∶200，abcam公司）、CHOP（1∶200，abcam公司）、JNK（1∶100，abcam公司）于組織上，37℃ 下45 min孵育；孵育結(jié)束后，3次PBS沖洗切片，每次3 min，4℃過(guò)夜，次日室溫復(fù)溫30 min，滴加二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒中的A液50-100 μl于組織上，37℃下45 min孵育，3次PBS沖洗切片，每次3 min，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體，37℃下30 min孵育，滴加SABC復(fù)合物，37℃ 孵育30 min，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性，每張切片最少20個(gè)高倍視野觀察陽(yáng)性顆粒的染色程度，用IPP6.0免疫組化分析軟件將圖片陽(yáng)性區(qū)域轉(zhuǎn)換為平均光密度值進(jìn)行定量分析。

1.7 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析（One way ANOVA）對(duì)多組樣本均數(shù)進(jìn)行比較，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，用Dunnett T3法進(jìn)行兩兩比較。M組、EM組、FM組和EFM組4組比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 各組肝組織病理形態(tài)比較

肝臟肉眼形態(tài)觀察：C組肝臟無(wú)異常變化，呈紅褐色或紅黃相間，被膜光滑，邊緣銳利，質(zhì)地中等，切面光潔；M組大鼠肝臟包膜緊張，邊緣圓鈍，呈淡黃色，體積增大，質(zhì)地變軟，切面油膩，EM組、FM組、EFM組肝臟形態(tài)介于C組和M組之間。

油紅O染色結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1）：C組肝細(xì)胞見(jiàn)少量脂滴，其余各組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增加；M組脂滴數(shù)量最多，大小不一，以小泡性脂肪滴為主；EM組和FM組脂滴數(shù)量其次，EFM組脂滴數(shù)量最少。油紅O脂滴光密度值（見(jiàn)表1）結(jié)果顯示：與C組比較，M組、EM組和FM組油紅O脂滴光密度值明顯升高，具有非常顯著性差異（P＜0.01）；EFM組不具顯著性差異（P＞0. 05）；與M組比較，各干預(yù)組油紅O脂滴光密度降低，具有非常顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 第16周各組油紅O染色病理變化（×200）

表1 第16周各組大鼠肝細(xì)胞油紅O脂滴光密度值和凋亡指數(shù)比較

2.2 各組肝細(xì)胞凋亡比較

TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡（如圖2）顯示：熒光顯微鏡下觀察正常肝細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡肝細(xì)胞細(xì)胞核呈明亮黃綠色。C組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，M組凋亡細(xì)胞明顯增多，EM組、FM組凋亡細(xì)胞數(shù)量較少，EFM組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少。肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（如表1）結(jié)果顯示：與C組比較，M組和FM組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，具有非常顯著性差異（P＜0.01）；EM組、EFM組不具顯著性差異（P＞0.05）；與M組比較，各干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，具有非常顯著性差異（P＜0. 01）。M組、EM組、FM組、EFM組4組雙因素方差分析結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)或飲食調(diào)整對(duì)肝細(xì)胞凋亡具有主效應(yīng)（P＜0.01），運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)肝細(xì)胞凋亡具有交互作用（P＜0.01）。

圖2 各組肝細(xì)胞凋亡變化（×200）

2.3 各組大鼠肝臟CCHHOOPP、Cassppaassee1122和JJNNKK蛋白表達(dá)比較

2.3.1 Westernnbblloott法測(cè)各組大鼠肝臟CCHHOOPP、Cassppaassee1122和JJNNKK蛋白表達(dá)比較

Western blot結(jié)果顯示（見(jiàn)表2）：與C組比較，其余各組CHOP、Caspase12和JNK蛋白表達(dá)升高，M組、EM組、FM組具有非常顯著性差異（P＜0.01），EFM組不具顯著性差異。與M組比較，各干預(yù)組CHOP、Caspase12和JNK蛋白表達(dá)降低，具有非常顯著性差異（P＜0. 01）。M組、EM組、FM組、EFM組4組采用雙因素方差分析結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)CHOP、Caspase12和JNK蛋白表達(dá)變化具有主效應(yīng)（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)CHOP、Caspase12和JNK蛋白表達(dá)變化具有交互作用（P＜0.01）。

表2 各組大鼠肝臟CHOP、Caspase12和JNK蛋白表達(dá)比較

2.3.2 免疫組化法測(cè)各組大鼠肝臟CCHHOOPP、Cassppaassee1122和JJNNKK陽(yáng)性表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3～5）：光鏡下觀察胞漿陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色者，CHOP、Caspase12和JNK在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)。C組可見(jiàn)各蛋白少量表達(dá)，范圍小，著色淺；M組各蛋白表達(dá)范圍廣，著色深；EM組、FM組各蛋白表達(dá)比C組多，較M組少；在干預(yù)組別中，EFM組各蛋白表達(dá)數(shù)量最少。各蛋白平均光密度值結(jié)果（見(jiàn)表3）顯示：與C組比較，其余各組CHOP、Caspase12和JNK蛋白平均光密度增加，具有非常顯著性差異（P＜0.01），與M組比較，各干預(yù)組CHOP、Caspase12和JNK蛋白平均光密度減少，具有非常顯著性差異（P＜0.01）。M組、EM組、FM組、EFM組4組采用雙因素方差分析結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)各蛋白平均光密度的影響具有主效應(yīng)（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)各蛋白平均光密度具有交互作用（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠肝臟CHOP蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

圖4 各組大鼠肝臟Caspase12蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

圖5 各組大鼠肝臟JNK蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

表3 各組大鼠肝臟CHOP、Caspase12和JNK平均光密度比較

3 討論與分析

3.1 EERRSS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在NNAAFFLLDD中的作用

ERS是指機(jī)體功能紊亂時(shí)，大量錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）腔內(nèi)聚集導(dǎo)致細(xì)胞平衡紊亂的狀態(tài)[15]。適度的ERS可維持細(xì)胞存活，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白的能力；但ERS程度過(guò)大或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，ERS介導(dǎo)的一系列細(xì)胞信號(hào)通路將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑尚不明確。目前已知的凋亡途徑有C-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑、C/EBP同源蛋白（CCAAT enhancerbinding protein homologous protein，CHOP）途徑和半胱天冬酶12（Caspase-12）途徑3種[16]。故本實(shí)驗(yàn)選取了CHOP、JNK和Caspase12三個(gè)反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。

3.1.1 CCHHOOPP與NNAAFFLLDD

CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員，過(guò)量表達(dá)的CHOP激活細(xì)胞凋亡途徑。目前，CHOP蛋白的過(guò)表達(dá)多見(jiàn)于對(duì)心肌凋亡[17]和大腦海馬細(xì)胞凋亡[18]的文獻(xiàn)報(bào)道，也有少量與肝臟相關(guān)的報(bào)道。研究[19]報(bào)道，肝臟脂代謝紊亂與CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，CHOP參與脂代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。CHOP蛋白過(guò)表達(dá)在誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用得到研究證實(shí)，有學(xué)者[20]用酒精喂養(yǎng)CHOP-/-大鼠和CHOP+/+野生大鼠發(fā)現(xiàn)，CHOP+/+野生大鼠肝細(xì)胞凋亡顯著增多，而CHOP-/-大鼠未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞凋亡，因此，CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)是細(xì)胞凋亡發(fā)生的顯著特征。本研究中，模型組CHOP蛋白表達(dá)升高，提示ERS可能通過(guò)上調(diào)CHOP蛋白表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，參與NAFLD的發(fā)展。

3.1.2 JJNNKK與NNAAFFLLDD

JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族在應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。有研究[21]報(bào)道2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡增加與JNK表達(dá)升高有關(guān)，因此，我們推測(cè)JNK可能參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)JNK在NAFLD中發(fā)揮作用，研究[22]報(bào)道JNK1上調(diào)α-SMA表達(dá)，在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化中起著重要的作用。JNK1基因敲除的肥胖大鼠在高脂喂養(yǎng)后，脂肪肝程度明顯減輕，JNK介導(dǎo)了高脂喂養(yǎng)大鼠脂肪肝的發(fā)展[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組JNK蛋白表達(dá)增加，提示ERS可能通過(guò)上調(diào)JNK蛋白表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，從而參與高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)展，與以往研究報(bào)道一致。

3.1.3 Cassppaassee1122與NNAAFFLLDD

Caspase12在正常生理狀態(tài)下以無(wú)活性的酶原Procaspase12存在，當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，Procaspase12特異性水解，形成有活性的Caspase12，一系列Caspases酶原被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[24]。研究[25]報(bào)道，Caspase12僅特異性地與ERS密切相關(guān)，而與其他途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。Di Sano[26]的研究也證實(shí)，Caspase12不是線粒體介導(dǎo)凋亡途徑所必需，它是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性蛋白。有學(xué)者[27]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟Caspase12蛋白表達(dá)升高，與腎細(xì)胞凋亡增加密切相關(guān)。Caspase12在肝臟損傷中的作用，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道。研究[28]報(bào)道Caspase12過(guò)表達(dá)與肝衛(wèi)星細(xì)胞凋亡有關(guān)，抑制Caspase12活性可有效減少鼠肝細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示，模型組肝臟Caspase12蛋白表達(dá)增加，提示ERS可能通過(guò)上調(diào)Caspase12蛋白表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，從而參與高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)展。

3.2 運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整對(duì)非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用

有研究[30]證實(shí)，耐力運(yùn)動(dòng)可較好地預(yù)防和延緩脂肪肝。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組肝臟脂滴數(shù)量明顯減少，提示運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD具有較好的干預(yù)作用。有學(xué)者[31]研究報(bào)道短期運(yùn)動(dòng)減少NAFLD細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡蛋白CHOP、JNK和Caspase-12表達(dá)均明顯降低，這與研究中TUNEL法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞凋亡較模型組明顯減少的結(jié)果一致，提示在NAFLD形成后，采用運(yùn)動(dòng)干預(yù)，運(yùn)動(dòng)在一定程度上可延緩高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)展。其機(jī)制可能與其減少ERS，降低CHOP、JNK和Caspase-12蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。

調(diào)整飲食被認(rèn)為是治療NAFLD的基本方法，也是預(yù)防和控制NAFLD進(jìn)展的重要措施之一。譚鶯等[32]報(bào)道，高脂飲食喂養(yǎng)8周能夠構(gòu)建SD大鼠NAFLD模型，恢復(fù)正常飲食對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD有一定的治療作用。有研究[33]報(bào)道，成年肥胖人在飲食調(diào)整后，其胰島素抵抗和心血管疾病等危險(xiǎn)因素得到顯著改善。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，飲食調(diào)整組肝臟脂滴數(shù)量減少，ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CHOP、JNK、Caspase-12表達(dá)降低，這與研究中TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)飲食調(diào)整組肝細(xì)胞凋亡較模型組顯著減少的結(jié)果一致，提示在NAFLD形成后，采用停止高脂飲食喂養(yǎng)、恢復(fù)正常飲食的方法對(duì)NAFLD具有較好的治療作用，其機(jī)制可能與飲食調(diào)整可降低CHOP、JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

飲食調(diào)整和有氧運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是治療NAFLD最基本而有效的方法[34]。對(duì)于運(yùn)動(dòng)與飲食調(diào)整對(duì)NAFLD治療的交互作用，國(guó)內(nèi)外有少量文獻(xiàn)報(bào)道。臨床隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)[35]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整對(duì)NAFLD患者肝臟病理組織學(xué)改變顯著。國(guó)外學(xué)者[36]實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比藥物羅格列酮、二甲雙胍和運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整對(duì)NAFLD的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整在一定程度上優(yōu)于藥物羅格列酮、二甲雙胍的療效。本研究結(jié)果也證實(shí)，與模型組比較，運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整組肝細(xì)胞凋亡及CHOP、JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)的影響具有交互效應(yīng)，提示運(yùn)動(dòng)結(jié)合飲食調(diào)整對(duì)NAFLD具有較好的治療作用，聯(lián)合作用優(yōu)于單獨(dú)作用。

4 結(jié)論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與NAFLD的發(fā)展，運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整可延緩NAFLD的發(fā)展，且二者聯(lián)合作用效果更佳，其機(jī)制與運(yùn)動(dòng)和飲食調(diào)整降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CHOP、JNK和Caspase12在肝細(xì)胞的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Exercise and Diet Modification Delays Liver Cell Apoptosis of Rats with Endoplasmic Reticulum Stress Mediated Nonalcoholic Fatty Liver Disease

Li Junhan1，2，Su Quansheng1，Sun Junzhi1，Zhang Zhongyang1
1 Chengdu Sport University，Sichuan 610041，China 2 Beijing Sport University，Beijing 100084，China Corresponding Author：Su Quansheng，Email：sqs111@163.com

ObjectiveTo explore the effect of exercise and diet modification on liver cell apoptosis of rats with endoplasmic reticulum stress mediated nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）.Methods20 of 70 rats were randomly chosen as control group（C，fed with ordinary diet），the remaining 50 were fed with high-fat diet and finally suffered from NAFLD 8 weeks after the experiment，thereafter they were randomly regrouped into model group（M，n=10），exercise model group（EM，n=10），diet modification model group（FM，n=10）and exercise combined with diet modification model group（EFM，n=10）.Rats in group C were continuously fed with ordinary diet and in groups M and EM were continuously fed with high fat diet.The rats in groups FM and EFM was shift from high fat to ordinary diet.Rats in groups EM and EFM participated in aerobic swimming for 8 weeks until the end of experiment.Liver pathological changes were observed by oil red O staining and hepatocyte apoptosis was observed by Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling assays. The expression of CCAAT enhancer-binding homologous protein（CHOP），c-Jun n-terminal kinase（JNK）and caspase-12 gene were determined by Western blot，and the expression rate of CHOP and JNK and caspase-12 by immunohistochemical staining.Results（1）The number of lipid droplets in liver cells of group M significantly increased as compared with group C and the number of lipid droplets in liver cells of intervention groups was situated between the number of group C and M.（2）Compared to group C，the liver cell apoptosis，the protein expressions of CHOP，Caspase12 and JNK gene increased in group M.Compared to group M，the liver cell apoptosis and the protein expressions of CHOP and Caspase12 and JNK gene decreased in intervention groups.（3）There was main effect of exercise and diet on the protein expressions of CHOP and Caspase12 and JNK gene，and they were interacted each other.ConclusionsEndoplasmicreticulumstressmediatedlivercellapoptosisparticipatedinthe development of NAFLD，which could be delayed by exercise and diet modification through decreasing the protein expression of endoplasmic reticulum stress，especially the combination of exercise and diet modification.

endoplasmicreticulumstress，cellapoptosis，non-alcoholicfattyliverdisease，exercise，diet modification

2015.08.28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目子課題（2012BAK21B01-4）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目（2015JY0155）；國(guó)家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助基金（CTYY2015018）

蘇全生，Email：sqs111@163.com