張黎麗，馬夢琳，李晨熙，常允康

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東日照276800）

蛋清溶菌酶的分離純化及其抑菌活性研究

張黎麗，馬夢琳，李晨熙，常允康*

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東日照276800）

本文以新鮮雞蛋為原材料，從中高效地提取溶菌酶并對其抑菌性能進(jìn)行研究。采用等電點(diǎn)沉淀、熱沉淀和陽離子交換的方法對溶菌酶進(jìn)行分離純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測，純度達(dá)到80%以上。通過抑菌圈法檢測溶菌酶對白色念珠菌、表皮葡萄球菌、球狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，白色念珠菌的抑菌圈直徑為18.35mm，其余6種菌的抑菌圈直徑均小于7mm。由此可見，該溶菌酶僅對白色念珠菌有抑菌作用，對其他6種菌無明顯的抑菌作用。雖然溶菌酶抑菌譜并不是很廣泛，但仍有較高的研究價(jià)值。

溶菌酶；蛋清；等電點(diǎn)沉淀；陽離子交換；抑菌圈

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，能選擇性地催化某些細(xì)菌的細(xì)胞壁多糖的水解，因而具有殺菌、抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞等功效。其廣泛存在于鳥、家禽的蛋清，哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿和組織細(xì)胞中[1]，其中以雞蛋的蛋清中含量最為豐富，約為2‰。目前，以動(dòng)物的內(nèi)臟和霉菌為原料生產(chǎn)溶菌酶，在國外已經(jīng)開始工業(yè)化生產(chǎn)。但我國現(xiàn)在生產(chǎn)規(guī)模較小，還需要進(jìn)口。近幾年來，國內(nèi)以雞蛋清和雞蛋殼為原料提取溶菌酶已經(jīng)開始有小規(guī)模的生產(chǎn)。溶菌酶在醫(yī)藥、化工、食品和發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。目前，多數(shù)商品溶菌酶是從蛋清中提取出來的[2-4]，但由于蛋清中雜蛋白的含量很高，使得在制取高純度溶菌酶的過程中操作比較復(fù)雜，成本也相對較高。目前，溶菌酶分離純化的方法主要包括直接提取法、結(jié)晶法、膜色譜、沉淀法、離子交換法、反膠團(tuán)萃取、電泳法、雙水相萃取和親和沉淀等[5]。本文擬通過等電點(diǎn)沉淀、熱沉淀和陽離子交換法對蛋清中溶菌酶進(jìn)行分離純化，并通過抑菌圈法研究其抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白色念珠菌、表葡萄球菌、球狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；鮮雞蛋，市售；磷酸氫二鈉、氯化鈉、酵母粉、蛋白胨等試劑，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；sp陽離子交換樹脂，GE；10kD超濾管，密理博。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備

將雞蛋外殼洗凈，擦干蛋殼外部水分，輕輕地將雞蛋外殼敲破，保證在雞蛋蛋黃部分完好無損的狀態(tài)下，收集蛋清液，pH值應(yīng)為8.1左右（25℃），再用2層紗布過濾掉蛋清中的臍帶塊和碎蛋殼，最后加入2倍體積的pH7.5磷酸鹽緩沖液。

采用等電點(diǎn)沉淀法，向蛋清溶液中逐滴滴加1 mol/L HCl，調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至4.5，7 000rpm離心15min，取上清。

根據(jù)熱沉淀方法，將上清液于70℃水浴鍋中加熱15min，7 000rpm離心20min，取上清，并再次通過等電點(diǎn)沉淀法，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5，再次以7 000rpm離心20min，取上清液，即為粗酶液。

1.2.2 陽離子交換法純化溶菌酶

①試驗(yàn)前處理，用蒸餾水以一定流速平衡陽離子交換柱至基線穩(wěn)定；②柱平衡，調(diào)節(jié)系統(tǒng)壓力，確定流速為2.5mL/min，用20mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液平衡陽離子交換柱至基線穩(wěn)定，基線歸0；③上樣，將得到的粗酶液以1mL/min的流速上樣于陽離子交換柱；④平衡，用20mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液再次平衡陽離子交換柱至基線穩(wěn)定；⑤洗脫并收集，用0.5%～5.0%硫酸銨溶液進(jìn)行分步洗脫，收集洗脫液，每管1mL，當(dāng)洗脫液中無明顯蛋白質(zhì)時(shí)停止洗脫，選擇蛋白峰較高的幾管合并，使用截留分子量12kD以下的超濾管，用20mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液，4 500rpm離心洗滌多次，進(jìn)行脫鹽和濃縮。

1.2.3 溶菌酶純度檢測

采用SDS-PAGE對溶菌酶進(jìn)行檢測，濃縮膠和分離膠采用的濃度和電壓分別為3%、80V和12%、120V，考馬斯亮蘭染色。

1.2.4 溶菌酶的含量測定

將商品溶菌酶用20mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液稀釋成不同梯度濃度（0.0、0.2、0.4、0.8mg/mL和1.6mg/mL），以溶菌酶濃度為橫坐標(biāo)，281nm波長吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。

純化所得的溶菌酶用20mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液稀釋，281nm波長吸光度測定其吸光度，用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算制備的溶菌酶含量。

1.2.5 溶菌酶的抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)所用7種菌（白色念珠菌、表葡萄球菌、球狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌），劃線于固體LB平板，35℃培養(yǎng)16h左右，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，35℃ 200rpm培養(yǎng)12h左右，得到活化后菌液。

用打孔器制作出直徑50mm的濾紙片，121℃高壓滅菌20min，烘干。將濾紙片浸泡于所得的溶菌酶液中，即得藥敏紙片。

在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行以下無菌操作：用移液槍分別吸取7種活化好的菌液50μL，涂布于LB平板上，待培養(yǎng)基充分吸收菌液后，用無菌的鑷子將藥敏紙片貼在涂好菌液的平板上，35℃培養(yǎng)16h，游標(biāo)卡尺測量其抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶的分離純化

對等電點(diǎn)沉淀、熱沉淀、離子交換前后的溶菌酶留樣，用于后續(xù)的SDS-PAGE檢測。其中，陽離子交換層析采用0.5%、1.7%、5.0%的硫酸銨溶液進(jìn)行分步洗脫。層析條件如下，流速為2.5mL/min，1min收集1管，結(jié)果見圖1。

圖1 陽離子交換層析圖譜

如圖1所示，峰1為上樣時(shí)的穿透峰，其成分主要是雜蛋白；峰2為0.5%硫酸銨溶液的洗脫峰，該峰中的主要成分是帶少量正電荷的雜蛋白；峰3為1.7%硫酸銨溶液的洗脫峰，此峰為目的蛋白峰。經(jīng)純度檢測后，選取純度較高的幾管進(jìn)行合并。

使用10kD的超濾管，通過多次離心洗滌，對純酶液進(jìn)行脫鹽和濃縮，最終將酶液濃縮至4mL。

2.2 SDS-PAGE檢測溶菌酶純度

對純化步驟前后留樣的溶菌酶酶液進(jìn)行SDSPAGE檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 各純化步驟前后溶菌酶酶液的SDS-PAGE分析

從圖2可以看出，4、6、7號(hào)泳道經(jīng)等電點(diǎn)和熱沉淀步驟后，明顯較1號(hào)泳道的雜蛋白含量降低。通過5號(hào)和7號(hào)泳道，發(fā)現(xiàn)在等電點(diǎn)沉淀和熱沉淀過程中，溶菌酶亦有損失。8號(hào)泳道穿透液中全部為雜蛋白，溶菌酶在該陽離子交換柱中被吸附的效果較好，且未到其最大吸附容量。9號(hào)泳道為0.5%的硫酸銨溶液洗脫下來的蛋白條帶，該蛋白可能是非特異性吸附或是表面可能帶有少量正電荷從而被吸附，經(jīng)較低濃度的硫酸銨即可洗脫下來。10～12號(hào)泳道為1.7%硫酸銨溶液洗脫下來的條帶，11、12泳道中，溶菌酶含量可達(dá)80%以上，純度較高。

2.3 溶菌酶的含量測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得所提取的溶菌酶含量為5.4mg/mL（見圖3）。

圖3 商品溶菌酶含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 溶菌酶的抑菌試驗(yàn)

采用抑菌圈法，考察純化所得的溶菌酶對白色念珠菌、表葡萄球菌、球狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌7種菌的抑菌效果，結(jié)果見表1。

表1 蛋清溶菌酶對不同菌種的抑菌效果

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》，抑菌圈直徑大于7mm，可判定為有抑菌效果。由此可以看出，所提取溶菌酶僅對白色念珠菌有抑菌作用，對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌無明顯的抑菌作用。這可能是因?yàn)椴煌?xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的差異[6]，這種差異不僅是肽聚糖和非肽聚糖的比例，而且肽聚糖層的結(jié)構(gòu)組成也很大程度上影響著細(xì)菌對于溶菌酶的敏感性。

3 結(jié)論

本文通過等電點(diǎn)沉淀、熱沉淀、陽離子交換3步純化方法，高效率地從雞蛋清中純化出了溶菌酶，而且所得溶菌酶純度可達(dá)80%以上，具有非常好的應(yīng)用前景。對其進(jìn)行抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所提取溶菌酶僅對白色念珠菌有抑菌作用，而對其他幾種普通革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌無明顯的抑菌作用。雖然雞蛋清來源的溶菌酶抑菌譜不夠廣泛，但是針對性地開發(fā)某一種抗菌消炎藥物或者與其他成分聯(lián)合使用，仍能獲得良好效果。如今，抗生素的濫用已經(jīng)造成了嚴(yán)重后果，而溶菌酶綠色、安全、不會(huì)帶來抗藥性后果的特點(diǎn)，也使其成為研究的熱點(diǎn)。

[1]戴清源.溶菌酶的研究進(jìn)展[J].山東食品發(fā)酵,2005,35(3):23-25.

[2]劉慧,王鳳山,楚杰.蛋清溶菌酶部分酶學(xué)性質(zhì)及酶活性的影響因素研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(6):385-391.

[3]常凱,邸海洋,何昭陽.溶菌酶的提取及其在焙烤食品中的應(yīng)用[J].食品科技,2008,33(10):167-169.

[4]石軍英,郭雄軍,陳勁春.雞蛋溶菌酶生產(chǎn)過程活力動(dòng)態(tài)監(jiān)控[J].食品科技,2008,33(11):10-13.

[5]鳳權(quán),湯斌.溶菌酶分離純化方法的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2006,23(1):5-7.

[6]曹濤,劉同軍,王艷君.微生物溶菌酶的研究及應(yīng)用[J].中國調(diào)味品,2011,36(3):23-26.

Isolation, Purification and Antibacterial Activity of Lysozyme from Egg White

Zhang Li-li, Ma Meng-lin, Li Chen-xi, Chang Yun-kang*
(Jining Medical University, Shandong Rizhao 276800)

In this paper, fresh egg was used as raw material to extract lysozyme efficiently and study its antibacterial activity. The lysozyme was isolated and purified by isoelectric precipitation, thermal precipitation and cation exchange. The purity was above 80% by SDS-PAGE. The antibacterial activity of lysozyme against Candida albicans, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Bacillus proteus and Pseudomonas aeruginosa was detected by the method of bacteriostasis circle. The results showed that the bacteriostatic circle diameter of Candida albicans was 18.35 mm, and the diameter of the other six strains were less than 7 mm. It can be seen that the lysozyme has antibacterial effect on Candida albicans, and has no obvious inhibitory effect on the other six kinds of bacteria. Although the antibacterial spectrum of lysozyme is not very extensive, it still has high research value.

Lysozyme; Egg white; Isoelectric precipitation; Cation exchange; Bacteriostatic ring

TQ464.8

A

2096-0387（2017）01-0013-04

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目（JYQ14KJ14）。

張黎麗（1987-），女，山東淄博人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：生物資源與環(huán)境。

常允康（1987-）,男，山東榮成人，碩士，講師，研究方向：生物資源與環(huán)境。