王 燕,張志琪,徐紅穎,張 爽,王飛娟,蘇文香
(1.陜西國際商貿學院,陜西咸陽 712046;2.陜西師范大學化學化工學院,藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室,陜西西安 710062;3.內蒙古化工職業(yè)學院,內蒙古呼和浩特 010070)
貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)選及抑菌活性研究
王 燕1,張志琪2,徐紅穎3,張 爽1,王飛娟1,蘇文香1
(1.陜西國際商貿學院,陜西咸陽 712046;2.陜西師范大學化學化工學院,藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室,陜西西安 710062;3.內蒙古化工職業(yè)學院,內蒙古呼和浩特 010070)
采用水蒸氣蒸餾法對貫葉連翹花中揮發(fā)油進行提取,以揮發(fā)油提取率為響應值,通過單因素實驗對影響提取工藝的參數(浸泡時間、提取時間和料液比)進行考察,并利用三因素三水平響應曲面實驗法確定了貫葉連翹花中揮發(fā)油的最優(yōu)提取工藝,即浸泡時間19 h,液固比9∶1 mL/g,提取時間10 h,該條件下貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取率為1.03 mL/100 g,與理論值1.10 mL/100 g僅相差2.73%。同時測試了該揮發(fā)油的抑菌活性,其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為9、10、12 mm,表明貫葉連翹花中揮發(fā)油有一定的抑菌活性。
貫葉連翹花,揮發(fā)油,水蒸氣蒸餾提取法,響應曲面法,抑菌活性
貫葉連翹(HypericumperforatumL.)為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物,藥用歷史達兩千年之久,具有清熱利濕、疏肝解郁、抑菌止血等功效[1-2]。貫葉連翹含有多種活性成分如蒽醌類和黃酮類等,在抗抑郁、鎮(zhèn)痛、抗氧化等方面具有廣譜的藥理活性,研究亦表明金絲桃屬植物中揮發(fā)油均具有明顯的抗菌作用[3-4],因此貫葉連翹的抑菌等活性疑與含有的揮發(fā)油成分相關。
關于揮發(fā)油的提取、分析及應用已成為研究熱點[5],目前已有關于貫葉連翹全草和地上部分揮發(fā)油的化學成分和藥理作用研究,且不同方法和不同藥源揮發(fā)油的提取效率、化學組成、含量和藥效等有所差異[6-7]。貫葉連翹花中含有豐富的揮發(fā)油,而關于花中揮發(fā)油的提取與抑菌活性研究還尚未見報道。
水蒸氣蒸餾法具有操作簡單、節(jié)約成本、產品純度高及無有機溶劑殘留等特點[8-9],廣泛用于揮發(fā)油的提取研究。本研究擬采用該方法對貫葉連翹花中揮發(fā)油進行提取,結合響應面實驗法對工藝過程進行優(yōu)化,以提高產率;同時對貫葉連翹花中揮發(fā)油抑菌活性進行研究,為貫葉連翹花資源在日用、食品、醫(yī)藥、化工等領域的開發(fā)提供有力的理論依據和實驗基礎。
1.1 材料與儀器
貫葉連翹花 購自陜西漢中勉縣,經陜西國際商貿學院生藥學教研室雷國蓮教授鑒定,清洗后晾干、粉碎至40目,避光陰涼處保存,備用;無水乙醚和無水硫酸鈉等 均為國產分析純;LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 10 g,加水至1000 mL,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g,于121 ℃滅菌20 min。
9FZ-15B型多用粉碎機 富強機械制造有限公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器 陜西泰康生物科技有限公司;FA2204B型電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;YXQ-LS-50S型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海訊博實業(yè)有限醫(yī)療公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 揮發(fā)油的提取方法 稱取20 g粉碎的貫葉連翹花于合適的圓底燒瓶中,加入一定量的蒸餾水密封,浸泡一定時間后,連接揮發(fā)油提取器和冷凝管,置于集熱式恒溫磁力攪拌器上,于125 ℃油浴加熱一定時間。揮發(fā)油提取完全后,以無水乙醚收集揮發(fā)油,并加入少量無水硫酸鈉(以不結晶為宜),蒸發(fā)乙醚可得到一定量亮黃色油狀液體,揮發(fā)油提取得率計算如下:
R=V/m×100
式中,R為揮發(fā)油提取得率,mL/100 g;V:揮發(fā)油體積,mL;m:藥材質量,g。
1.2.2 揮發(fā)油提取的單因素實驗
1.2.2.1 浸泡時間的影響 按照1.2.1揮發(fā)油提取方法,當液固比為10∶1 mL/g,提取時間為12 h的條件下,研究不同浸泡時間(6、10、14、18、22、26 h)對貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響。
1.2.2.2 液固比的影響 按照1.2.1揮發(fā)油提取方法,當浸泡時間為18 h,提取時間為12 h的條件下,研究不同液固比(4∶1、7∶1、10∶1、13∶1、16∶1、19∶1 mL/g)對貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響。
1.2.2.3 提取時間的影響 按照1.2.1揮發(fā)油提取方法,當浸泡時間為18 h,液固比為10∶1 mL/g的條件下,研究不同提取時間(3、6、9、12、15、18 h)對貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響。
1.2.3 響應曲面實驗優(yōu)化 在單因素實驗基礎上,選取浸泡時間(A)、液固比(B)和提取時間(C)三個因素為影響揮發(fā)油提取率的主要因素,以-1、0和1分別表示因素的高中低三個水平。按照響應曲面實驗方法(RSM)進行因素水平安排和實驗設計,見表1。
表1 響應曲面實驗設計與因素水平Table 1 Variables and levels of RSM
1.2.4 揮發(fā)油抑菌活性研究 采用濾紙片法初步測定水蒸氣蒸餾法提取的貫葉連翹花的揮發(fā)油對不同菌種(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)的活性,即將菌種接種到液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),至對數生長期時進行計數。取100 μL菌懸液于9 cm平板上涂布均勻,向平板中央打3 mm的孔,向孔內滴加5 μL揮發(fā)油,對照板加5 μL滅菌水,置于培養(yǎng)箱中(37 ℃,24 h)。觀察菌種的生長情況并進行數據的記錄,測量抑菌圈的直徑,重復3次[10]。
1.3 數據處理
采用Design-Expert 8.0軟件對數據進行分析,實驗結果以平均值±標準誤差(mean±SE)進行表示。
2.1 單因素實驗結果與分析
2.1.1 浸泡時間對貫葉連翹花揮發(fā)油提取率的影響 考察浸泡時間對貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響,結果見圖1。當浸泡時間低于10 h時,揮發(fā)油提取率相對較低;隨著浸泡時間延長至18 h時,揮發(fā)油提取率呈現明顯上升趨勢;隨后隨著時間的增加,揮發(fā)油提取率呈現下降趨勢。原因可能是剛開始時,藥材組織細胞尚未充分膨脹,當浸泡時間達18 h時,藥材組織細胞膨脹,加速了細胞內外物質交換的速率,促進了揮發(fā)油的提取。揮發(fā)油得率下降的原因,也可能與實驗過程溫度較高和實驗季節(jié)的環(huán)境溫度偏高,揮發(fā)油分子運動速率加快易于散失到空氣中相關。因而選18 h為合適的浸泡時間。
圖1 浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of soaking time on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil
2.1.2 液固比對貫葉連翹花揮發(fā)油提取率的影響 由圖2可知,隨著液固比的增加,揮發(fā)油提取率增大,液固比為10∶1 mL/g時提取率最大;當繼續(xù)增加液固比,揮發(fā)油提取率出現明顯下降的趨勢,即溶劑(水量)的變化對揮發(fā)油提取率有一定影響。原因可能為水量少不能充分浸泡藥材原料,隨著水量的增加,藥材與水充分接觸,提取率增加;但當加水量過多,加熱時溶液沸騰原料和揮發(fā)油沾壁,影響提取效果。因此,最適液固比選為10∶1 mL/g。
圖2 液固比對揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of solvent to material ratio on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil
2.1.3 提取時間對貫葉連翹花揮發(fā)油提取率的影響 從圖3可以看出,當提取時間為3~9 h時,貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取率出現快速增加的趨勢,9 h時提取率達到最大值,這與提取剛剛開始時,由于溶劑與物料中揮發(fā)油濃度不同導致的擴散驅動力增大有關;當繼續(xù)延長提取時間,提取率的變化趨勢較為平緩,即揮發(fā)油基本提取完全,這可能與提取貫葉連翹花中揮發(fā)油的過程,溶液體系達到了動態(tài)平衡而致揮發(fā)油提取率變化不大有關。說明9 h是理想的揮發(fā)油提取時間。
圖3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil
2.2 響應曲面優(yōu)化實驗結果與分析
2.2.1 二次回歸模型方程的建立及方差分析 以貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取率為考察指標,在單因素實驗基礎上,對浸泡時間、液固比和提取時間等三個因素按照響應曲面法三因素三水平,五個中心點的方法,即十七個實驗點的實驗設計及結果,見表2。
經過擬合的三元二次回歸方程為:
Y=-2.61125+0.093750A+0.14425B+0.42792C+1.25000E-003 AB+4.30556E-003AC-6.66667E-004BC-3.95833E-003A2-8.20000E-003B2-0.026667C2
二次方程回歸模型的方差分析結果見表3。
表2 貫葉連翹花中揮發(fā)油提取工藝響應曲面優(yōu)化實驗結果Table 2 RSM design arrangement and corresponding of volatile oil yield
2.2.2 響應曲面優(yōu)化結果與分析 根據模型方程繪制的響應曲面圖與標準殘差曲線等,結果見圖4。圖4為影響貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的因素之間交互作用的關系圖,可直觀的反映出因素交互作用對提取率的影響大小。圖4a中浸泡時間的曲線較為平緩,表明浸泡時間對提取率的影響較弱,液固比較浸泡時間對提取率的影響較強,呈現先上升后減小的趨勢,等高線圖反映出浸泡時間與液固比交互作用對提取率的影響較為顯著,與方差分析結果一致。圖4b中浸泡時間的曲線仍比較平緩,但隨著提取時間的增加提取率呈現大幅度增加,浸泡時間和提取時間的交互作用極為顯著。圖4c中,僅液固比對提取率的影響極為顯著,提取時間和交互作用對提取率無顯著性影響。從圖4可獲得因素的合理水平范圍為:浸泡時間16~19 h;液固比8∶1~12∶1 mL/g;提取時間8~10 h。
表3 響應曲面實驗擬合方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model
注:**表示差異性極顯著(p<0.01);*表示差異性較為顯著(p<0.05)。
求導得到響應曲面法優(yōu)化貫葉連翹揮發(fā)油提取工藝的條件為:浸泡時間18.50 h,液固比9.39∶1 mL/g,提取時間9.83 h,由于實際操作條件的限制,故將參數修訂為浸泡時間19 h,液固比9∶1 mL/g,提取時間10 h,該條件下貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率達1.03 mL/100 g,與理論值1.10 mL/100 g僅相差2.73%。
2.3 揮發(fā)油的抑菌活性研究
抑菌實驗發(fā)現,加入貫葉連翹花中揮發(fā)油的平板上形成了抑菌圈,其直徑大小見表4所示,即該揮發(fā)油對供試菌種:金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有一定的抑制活性,其抑菌活性大小順序為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。
表4 貫葉連翹花中揮發(fā)油對菌種的抑菌圈直徑Table 4 Antimicrobial cycle diameter of volatile oil from Hypericum perforatum L. flowers
本研究采用響應曲面優(yōu)化法對水蒸氣蒸餾法提取貫葉連翹花中揮發(fā)油的工藝進行優(yōu)化,確定的最佳工藝條件為:浸泡時間19 h,液固比9∶1 mL/g,提取時間10 h,該條件下揮發(fā)油的提取率為1.03 mL/100 g,與理論值1.10 mL/100 g較為接近,則響應曲面實驗模型可用于貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取。貫葉連翹花中揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌實驗測試中,其對應的抑菌圈直徑分別為9、10、12 mm,即該揮發(fā)油對供試菌有一定的抑制作用,這與揮發(fā)油中化合物含有的羥基和不飽和鍵的存在有關。
貫葉連翹花中揮發(fā)油具有潛在的抑菌活性,與揮發(fā)油中多成分協同、多靶點作用的有關。進一步對貫葉連翹花中揮發(fā)油成分進行分析和鑒定,成為本課題組下階段研究目標。
[1]吳敏,王霞,許平.貫葉連翹的研究進展[J].中成藥,2004,9:74-77.
[2]傳娟娟,李燕.貫葉金絲桃(圣約翰草)的國內外研究概況[J].西北藥學雜志,2016(3):330-332.
[3]謝婷婷,孫隆儒,婁紅祥,等. 金絲桃屬植物抗菌作用的研究進展[J].中藥材,2010(1):146-149.
[4]尹興斌,翟玉靜,曹颯麗,等.貫葉金絲桃藥理作用研究進展[J].中華中醫(yī)藥學刊,2013(8):1634-1637.
[5]任君安,楊麗娜,王雁,等.響應面分析法優(yōu)化保加利亞玫瑰揮發(fā)油提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2013(15):196-200.
[6]王燕,高潔,崔建強,等. 陜產貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及GC-MS分析[J].化學與生物工程,2016(3):28-32.
[7]孫建勛,楊飛,王金梅,等.固相微萃取-氣質聯用法分析貴州產貫葉連翹葉揮發(fā)性成分[J].中國實驗方劑學雜志,2011(11):96-99.
[8]肖炳坤,楊建云,黃榮清,等.貫葉金絲桃揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中國實驗方劑學雜志,2016(11):64-67.
[9]韓勝男,李妍,張曉杭,等.花椒揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及抗腫瘤活性分析[J].食品科學,2014(18):13-16.
[10]張曉蓉,彭光花,陳功錫,等.黃花蒿殘渣揮發(fā)油化學成分及其抑菌活性分析[J].中草藥,2011(12):2418-2421.
Extraction and antibacterial activity of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers
WANG Yan1,ZHANG Zhi-qi2,XU Hong-ying3,ZHANG Shuang1,WANG Fei-juan1,SU Wen-xiang1
(1.Shaanxi Institute of International Trade&Commerce,Xianyang 712046,China;2.Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry,Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China;3.Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering,Hohhot 010070,China)
To study steam distillation extraction technology of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers,the type of parameters soaking time,solvent to solid sample ratio and extraction time were investigated in single factor experiments with extraction yield of volatile oil as evaluation index. The best extraction processes were obtained with three factors and three levels of response surface methodology as follows:soaking time 19 h,solvent to solid sample ratio 9∶1 mL/g and extraction time 10 h respectively,leading to an extraction yield of volatile oil 1.03 mL/100 g,and the experimental value are basically close to the theoretical expectation value 1.10 mL/100 g,with only 2.73% deviation. Combining with the antibacterial activity tests,the antimicrobial cycle diameter of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers were 9,10,12 mm forEscherichiacoli,StaphyloccocusaureusandBacillussubtilis,which suggested volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers has a certain antibacterial effect.
HypericumperforatumL. flowers;volatile oil;steam distillation;response surface method;antibacterial activity
2016-04-18
王燕(1982-),女,碩士研究生,講師,主要從事天然藥物有效成分方面的研究,E-mail:370749824@qq.com。
陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術研究項目(15ZY034);陜西國際商貿學院校級課題(SMXY201631);陜西省教育廳項目(16JK2031);陜西省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2516)。
TS201.2
B
1002-0306(2017)02-0273-05
10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.044