王 益 萬遠太 劉 蓓 吳瑞喬 張 晶 嚴(yán)燕國

趨化因子受體CcR5在結(jié)腸癌中的表達及臨床意義

王 益 萬遠太 劉 蓓 吳瑞喬 張 晶 嚴(yán)燕國

目的 探究趨化因子受體CcR5在結(jié)腸癌中的表達及臨床意義。方法 收集經(jīng)結(jié)腸癌根治術(shù)切除且經(jīng)病理學(xué)檢查證實為結(jié)腸癌組織標(biāo)本94例，選取50例距離腫瘤邊緣>5 cm,且經(jīng)病理學(xué)檢查為正常的癌旁組織作為對照，采用實時定量PCR和免疫組化的方法，分別檢測結(jié)腸癌組織和正常癌旁組織中CcR5的 mRNA表達水平及陽性表達率，分析其與結(jié)腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果 結(jié)腸癌組織中CcR5 mRNA水平和陽性表達率明顯高于正常癌旁組織的，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CcR5 mRNA 表達水平和陽性表達率與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期均有關(guān)，腫瘤大小>5 cm、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者CcR5的mRNA 表達水平和陽性表達率均相應(yīng)高于腫瘤大小≤5 cm、未發(fā)生轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。LMVD與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期和分化程度有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CcR5的mRNA 表達水平與LMVD呈明顯正相關(guān)(γ=0.9176,P=0.0099)。結(jié)論

趨化因子受體CcR5；結(jié)腸癌；轉(zhuǎn)移；臨床意義

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:214～217)

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，近幾年的發(fā)病趨勢明顯上升，患者常因出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移而死亡[1]。本文就趨化因子受體CcR5和微淋巴管密度在結(jié)腸癌中的表達情況進行研究，分別分析其與結(jié)腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，同時分析CcR5的表達水平與微淋巴管密度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

在2012年5月至2015年12月期間,收集我院普外科經(jīng)結(jié)腸癌根治術(shù)切除且經(jīng)病理學(xué)檢查證實為結(jié)腸癌組織標(biāo)本94例，組織標(biāo)本保存于我院中心實驗室-80冰箱。其中男性37例，女性57例，平均年齡為(63.2±12.1)歲，腫瘤大小>5 cm 60例，腫瘤大小≤5 cm 34例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ～Ⅳ期38例，其中46例結(jié)腸癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例結(jié)腸癌伴肝轉(zhuǎn)移。術(shù)后病理組織學(xué)類型包括：管狀乳頭狀腺癌49例，黏液腺癌、未分化癌45例；高分化結(jié)腸癌35例，中低分化結(jié)腸癌59例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①接受結(jié)腸癌根治術(shù)且經(jīng)病理組織學(xué)檢查診斷為結(jié)腸癌；②手術(shù)前未接受放化療和生物治療；③TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期。選取50例距離腫瘤邊緣>5 cm,且經(jīng)病理學(xué)檢查為正常的癌旁組織作為對照。

1.2 研究方法

1.2.1 實時定量PCR檢測CcR5 mRNA的表達水平

采用實時定量PCR檢測CcR5 mRNA的表達水平。具體過程如下：采用QIAquick RNA Extraction Kit(購自QIAGEN公司,德國)抽提結(jié)腸癌及癌旁組織的總RNA。濃度及純度符合要求的RNA進行合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成按照First Strand cDNAsynthesis Kit操作說明(Takara公司，日本)，反應(yīng)條件為：42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一鏈放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)CcR5基因序列，在Oligo7.5軟件上設(shè)計CcR5熒光定量引物,引物序列為：CcR5-F:5’-CCCTTGACCAGAGTCGAGTTG-3’，CcR5-R:5’-CAAGACTGTGGTCAGGAC-3’,擴增片段長度為115 bp,以GAPDH作為參考基因，引物序列為：5’-CGACGTAGTCTCATCT GACTT-3’,5’-GTT GCAGTCGACATAATCGTTGA-3’，片段長度為112bp，引物均由上海生工有限公司合成。實時熒光定量PCR20 μl反應(yīng)體系為：cDNA第一鏈1 μl,2x Trans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl,引物1(10uM)0.6 μl,引物2(10uM)0.6μl,Passive Reference Dye 0.4 μl,ddH2O 7.4 μl(試劑購于北京全式金有限公司)，反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀中進行，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃10 s；58 ℃20 s；72 ℃30 s，35個循環(huán)，同時進行溶解曲線的分析，程序為：60 ℃1 min;95 ℃30 s。應(yīng)用ABI7500分析軟件分析CcR5及GAPDH基因的Ct值，采用2-Ct法計算正常癌旁組織及結(jié)腸癌組織中CcR5的相對表達量，采用公式Ct=Ct(CcR5基因)-Ct(GAPDH基因)。

1.2.2 免疫組化染色檢測CcR5在結(jié)腸癌組織中的表達 CcR5抗體按1∶200稀釋，采用SP法對結(jié)腸癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)染色，PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照，以出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，顯微鏡下選取5個視野進行觀察。

1.2.3 微淋巴管密度(LMVD)計數(shù) 參照Weidner的標(biāo)準(zhǔn)進行LMVD計數(shù)：依據(jù)D2-40染色以陽性染色的單個內(nèi)皮細胞分別計為一個陽性微淋巴血管，在低倍鏡(×40)下選取陽性染色微淋巴管最豐富區(qū)域，然后在高倍鏡下(×200)觀察選定區(qū)域的5個視野，計算淋巴管數(shù)，計算2個最豐富區(qū)域、10個視野的平均淋巴管數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件上進行統(tǒng)計分析，計量資料進行t檢驗，計數(shù)資料進行卡方檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CcR5的mRNA表達水平和LMVD與臨床病理特征的關(guān)系

CcR5的mRNA表達水平與結(jié)腸癌患者年齡、性別、組織學(xué)類型、分化程度均無相關(guān)性(P>0.05)；但與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，其中腫瘤大小>5 cm的結(jié)腸癌患者CcR5的mRNA 表達水平明顯高于腫瘤大小≤5 cm的結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計意義(P=0.003)；同時，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移患者CcR5 mRNA表達水平明顯高于無轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，結(jié)腸癌患者CcR5 mRNA表達水平也增高，Ⅰ～Ⅱ期患者CcR5 mRNA 表達水平明顯低于Ⅲ～Ⅳ期患者(P<0.05)，見表1。

LMVD與結(jié)腸癌患者年齡、性別、組織學(xué)類型無相關(guān)性(P>0.05)，但與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期和分化程度有關(guān)，見表1。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CcR5的mRNA 表達水平與LMVD呈明顯正相關(guān)(γ=0.9176,P=0.0099)。

2.2 免疫組化檢測結(jié)果

結(jié)腸癌組織中CcR5陽性表達65例，而正常癌旁組織中CcR5陽性表達12例，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.742,P<0.0001)，見表2。CcR5陽性表達與結(jié)腸癌患者年齡、性別、組織學(xué)類型、分化程度均無相關(guān)性(P>0.05)；但與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，見表3。

表1 CcR5的mRNA 表達水平與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系±s)

表2 CcR5在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中陽性表達/例

3 討論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與許多因素有關(guān)，有研究指出[2]，趨化因子及其受體可控制免疫細胞趨化、刺激新血管形成、刺激釋放炎癥細胞因子，還可通過自分泌或旁分泌方式誘導(dǎo)癌細胞的增殖和輔助間質(zhì)細胞進行侵襲和轉(zhuǎn)移。趨化因子受體 CcR5具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，作為G蛋白偶聯(lián)因子超家族成員的中的1種細胞膜蛋白，CcR5是HIV-1入侵機體細胞的主要輔助受體之一，也是細胞內(nèi)β趨化因子的受體，具有調(diào)控T細胞和單核細胞/巨嗜細胞系的遷移、增殖與免疫的功能，主要在記憶性的靜止期T淋巴細胞、單核細胞、未成熟的樹突狀細胞等細胞膜上表達。CcR5的表達水平與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及復(fù)發(fā)均有關(guān)，據(jù)報道[3]，在非小細胞肺癌組織中，CcR5在腫瘤組織外周和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高內(nèi)皮微靜脈的內(nèi)皮細胞中呈高表達，而在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，CcR5則在淋巴結(jié)濾呈高表達。結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，易通過淋巴結(jié)向肝、肺等遠處發(fā)生轉(zhuǎn)移，有研究指出[4]，CcR7、CXCR4、CcR1等多種趨化因子均被認(rèn)為與結(jié)腸癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)具有相關(guān)性。然而關(guān)于CcR5在結(jié)腸癌中的表達及臨床意義的研究報道甚少。腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是評價惡性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[5],LMVD與癌癥的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。鑒于此，本文就CcR5和LMVD在結(jié)腸癌中的作用進行探究。

表3 CcR5的mRNA 表達水平與結(jié)腸癌臨床病理 特征的關(guān)系/例

本文采用實時熒光定量PCR對結(jié)腸癌中組織和正常癌旁組織CcR5的mRNA表達水平進行檢測，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織CcR5 mRNA水平明顯高于正常癌旁組織的CcR5 mRNA水平，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示CcR5高表達水平與結(jié)腸癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。進一步對CcR5的mRNA表達水平與臨床病理特征的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，CcR5的mRNA 表達水平與腫瘤大小和TNM分期均有關(guān)，腫瘤大小>5 cm和Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者CcR5的mRNA 表達水平均相應(yīng)高于腫瘤大小≤5 cm、Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌患者(P<0.05)。目前，有研究指出[6]，CcR5可能參與了結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移過程，通過淋巴結(jié)選擇性高表達配體與高表達CcR5的結(jié)腸癌細胞的結(jié)合，進一步輔助腫瘤細胞通過淋巴系統(tǒng)向遠處發(fā)生轉(zhuǎn)移，本研究中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CcR5的mRNA 表達水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的水平，進一步說明了CcR5在結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移過程中的作用，同時出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移患者CcR5的mRNA 表達水平明顯高于未出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移患者，且出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移患者CcR5的mRNA 表達水平明顯高于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示高表達的CcR5水平會促進結(jié)腸癌細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。同時采用免疫組化的方法檢測CcR5在結(jié)腸癌組織和正常癌旁組織中表達，結(jié)果顯示CcR5在結(jié)腸癌組織陽性表達明顯高于正常癌旁組織中的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.742,P<0.0001)，與CcR5的mRNA 表達水平分析結(jié)果一致。對LMVD的分析結(jié)果顯示，LMVD與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期和分化程度均有關(guān)，與研究報道相符[7]。相關(guān)性的分析結(jié)果顯示，CcR5的mRNA 表達水平與LMVD呈明顯正相關(guān)(γ=0.9176,P=0.0099)，進一步說明CcR5在結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移過程中的作用。

綜上所述，趨化因子受體CcR5在結(jié)腸癌組織中呈高表達，其高表達與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移均有關(guān)，檢測CcR5的水平對于結(jié)腸癌的診斷、預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移情況具有指導(dǎo)意義。

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(編輯：吳小紅)

Expression of Chemokine Receptor CcR5 in Colorectal Cancer and Its Clinical Significance

WANGYi,WANYuantai,LIUBei,etal.

TianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430064

Objective To explore the expression of chemokine receptor CcR5 in colorectal cancer and clinical significance.Methods 94 cases of colorectal cancer specimens treated with colorectal cancer resection surgery confirmed by pathology examination were selected.Meanwhile,50 specimens of cancer adjacent normal tissues from the edge of the tumor>5 cm were the control group.The mRNA level of CcR5 and positive case of CcR5 in colorectal cancer tissues and normal adjacent tissues were detected using real-time quantitative PCR and immunohistochemistry method.The relationship of CcR5 mRNA level and positive case of CcR5 with clinicopathological features in colorectal cancer were analyzed.Results The mRNA level of CcR5 and positive case of CcR5 in colorectal cancer tissues were significantly higher than that in normal adjacent tissues,there showed statistically significant difference(P<0.05).mRNA expression level of CcR5 and positive case of CcR5 were both related with tumor size,lymph node metastasis,liver metastasis,TNM stage,which showed that CcR5 mRNA level and positive case of CcR5 in patients with tumor size>5 cm,lymph node metastasis and liver metastasis,Ⅲ～Ⅳ period were markedly higher than that in patients with tumor size ≤5 cm,no transfer,Ⅰ～Ⅱ period(P<0.05).LMVD related to tumor size,lymph node metastasis,liver metastasis,TNM stage and differentiation degree.Correlation analysis showed that the expression level of mRNA was positively correlated with LMVD(γ=0.9176,P=0.0099).Conclusion The high expression of chemokine receptors CcR5 is related to the occurrence and metastasis of colorectal cancer.Detection of CcR5 has instructive value for diagnosis and metastasis prediction of colorectal cancer.

Chemokine receptor CcR5;Colorectal cancer;Metastasis;Clinical significance

430064 武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.012

R735.3+5

A

1001-5930(2017)02-0214-04

2016-04-21

2016-11-15)

趨化因子受體CcR5的高表達與結(jié)腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移均有關(guān)，檢測CcR5對于結(jié)腸癌的診斷和預(yù)測轉(zhuǎn)移情況具有指導(dǎo)意義。