趙會(huì)庚 權(quán)廣前 潘耀振 尹家俊

磁性載藥微球聯(lián)合反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌裸鼠模型的療效觀察

趙會(huì)庚 權(quán)廣前 潘耀振 尹家俊

目的 探討輻射促細(xì)胞轉(zhuǎn)染的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)基因mdr1反義寡核苷酸(ASON)聯(lián)合5-氟尿嘧啶磁性載藥微球(PEG-5-FU-MAMS)治療裸鼠人胰腺癌的效果。方法 通過(guò)構(gòu)建裸鼠人胰腺癌耐藥腫瘤模型基礎(chǔ)上，腫瘤局部以2 Gy60Coγ輻射，瘤內(nèi)注射陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)的mdr1反義寡核苷酸(ASON)，經(jīng)磁導(dǎo)下利用磁性載藥微球(PEG-5-MAMS)聯(lián)合化療。結(jié)果 聯(lián)合輻射組與未聯(lián)合輻射組及對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)曲線腫瘤生長(zhǎng)曲線差異有顯著性(P<0.01)。聯(lián)合組能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，聯(lián)合組腫瘤重量抑制率為85.00%,腫瘤體積抑制率為87.74%。結(jié)論 輻射促轉(zhuǎn)染的mdr1ASON聯(lián)合磁性載藥微球?qū)δ[瘤細(xì)胞具有較好的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

電離輻射；反義寡核苷酸；轉(zhuǎn)染；多藥耐藥；PEG-5-FU-MAMS

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:181～184)

胰腺癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，病情進(jìn)展較快，病死率較高，西方國(guó)家的發(fā)病率為12.5/10萬(wàn)，患者病死率超過(guò)97%[1]。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因。2015年3～11月，我們?cè)诮⒙闶竽[瘤耐藥模型后，采用輻射促轉(zhuǎn)染的方法，將多藥耐藥(mdr1)基因逆轉(zhuǎn)劑反義寡核苷酸(ASON)片段導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，在磁性載藥微球的作用下，探討體內(nèi)對(duì)腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人胰腺癌細(xì)胞系sw1990/Fu(自制)。

1.1.2 主要試劑 5-Fu(Acros,Belgium)；磁性載藥微球(天津倍思樂(lè)有限公司)；mdr1反義寡核苷酸(ASON)(上海生工生物有限公司)；弧形磁鐵(磁感強(qiáng)度3000GS)(北京?？湛萍奸_(kāi)發(fā)中心)BALB/c；裸鼠4～6周齡裸鼠20只，體重20～23 g/只，均為雌性，在標(biāo)準(zhǔn)合格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠皮下胰腺癌模型的建立 構(gòu)建胰腺癌細(xì)胞株SW1990用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，待細(xì)胞至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，細(xì)胞消化，傳代。連續(xù)傳代3次后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶壁約80%面積時(shí)，改用含5-Fu的培養(yǎng)基培養(yǎng)，起始濃度為30 mmom/L,24 h后更換無(wú)藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液，去除死亡的大部分細(xì)胞，以后每2天更換細(xì)胞培養(yǎng)基，待細(xì)胞與含藥物的培養(yǎng)基中穩(wěn)定的生長(zhǎng)并鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)瓶，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，一瓶在含原濃度的5-Fu培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，另一瓶逐漸增加5-Fu濃度至60 mmom/L。繼續(xù)如上培養(yǎng)，并不斷增加藥物濃度(一般2周左右增加藥物濃度),連續(xù)6個(gè)月左右，最后建立耐200 mmom/L的5-Fu的胰腺癌細(xì)胞株模型表示為SW1990/Fu。

1.2.2 腫瘤的接種 取制備好的人胰腺癌細(xì)胞SW1990/Fu懸液0.2 ml,混合0.2 mlPBS分別接種于20只裸鼠的右后腿背側(cè).觀察有無(wú)腫瘤形成及注射點(diǎn)有無(wú)破潰紅腫，按規(guī)定測(cè)量腫瘤體積，經(jīng)過(guò)3～5天潛伏期，接種部分出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)，逐漸腫大，形成圓形或橢圓形，突出體表，待腫瘤長(zhǎng)到4～5 mm時(shí)，將20只裸鼠隨機(jī)分4組，每組5只。A組：空白對(duì)照組，腫瘤注射磁性載藥微球混合懸液。B組：輻射組(2 Gy60Coγ輻射)同時(shí)在腫瘤基底部注射磁性載藥微球混合懸液。C組：lipo-ASON轉(zhuǎn)染組，腫瘤內(nèi)注射100 μl的lipo-ASON，同時(shí)在腫瘤基底部注射磁性載藥微球混合懸液。D組：聯(lián)合組(輻射+lipo-ASON) 2 Gy60Coγ輻射1 h后，向腫瘤內(nèi)注射100 μl的lipo-ASON，同時(shí)在腫瘤基底部注射磁性載藥微球混合懸液(lipo-ASON的濃度是100 mg/L)。

各組注射藥后用施加與腫瘤外形相符的弧形磁場(chǎng)，磁場(chǎng)強(qiáng)度3 000 GS，持續(xù)時(shí)間2 h，以上治療與藥物及輻射同時(shí)進(jìn)行，間隔5天做1次治療，連續(xù)觀察20天，記錄腫瘤的大小和宿主變化情況，于治療后30天頸椎脫臼法處死裸鼠，剝離腫瘤，測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、短徑，在電子天平上稱(chēng)質(zhì)量m,計(jì)算各組腫瘤體積V、質(zhì)量和抑制率。

腫瘤體積=3.14/6a2b。

腫瘤體積抑制率(%)=(對(duì)照組腫瘤體積-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積)/對(duì)照組腫瘤體積×100%體重減輕率(%)=(對(duì)照組腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量)×100%向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加1 ml的Trizol后，室溫放置5 min,使其充分裂。轉(zhuǎn)入1.5 ml Eppedndorf管中(RNase-free)12 000 rpm 離心5 min,棄沉淀。向Eppedndorf管中加入200 μl氯仿，震蕩均勻后室溫放置15 min。(禁用漩渦振蕩器，避免基因斷裂)；加入1 ml的75%乙醇(高壓的DEPC水配制)，溫和震蕩離心管懸浮沉淀。4 ℃，5 000 rmp離心5 min，棄上清。室溫晾干。溶于20 μlDEPC水中測(cè)OD值定量RNA的濃度。

1.3 RT-PCR

在冰浴的無(wú)RNase得離心管加入以下成分：Total RNA 1ugOligo(dT)18，2 μl離心后向離心管中加入下列各組成分：5×M-MLV Buffer 4 μl，dNTPs 1 μl，Rnasin 0.5 μl，M-MLV1 μl，42 ℃溫浴60 min，95 ℃加熱5 min 終止反應(yīng)；-20 ℃保存(或直接PCR)。mdr1基因引物(擴(kuò)增片段 bp310)：上游引物序列 5-ˊCCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3ˊ；下游引物序列，5-ˊGTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3ˊ；內(nèi)參β2MG基因引物 (擴(kuò)增片段bp120)上游引物序列 5-ˊCCA CTG AAA AAG ATG AGT AT-3ˊ下游引物序列 5-ˊCTT CAA CCT CCA TGA TGC TG-3ˊ反義體系：10×PCR Buffer10 μl；上游引物1 μl；下游引物1 μl；內(nèi)參上游引物1 μl，內(nèi)參下游引物1 μl；RT反應(yīng)產(chǎn)物 2 μl；Taq Polymerase1 μl；ddH2O 3 μl；Total Volume 20 μl。PCR的反應(yīng)條件：95 ℃5 min，50 ℃30 S,72 ℃ 1 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72 ℃ 10 min后4 ℃保溫。

1.4 電泳鑒定

加樣：① PCR Marker II 5 μl 加入孔中;② PCR樣品:1 μl樣品DNA:4 μl 10 x Loading Buffer 混合均勻后依次加入相應(yīng)的孔中,接通電源，電壓110 V 20 min進(jìn)行電泳;凝膠成像儀成像檢測(cè)、拍照、定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 裸鼠胰腺癌模型的成功建立

腫瘤細(xì)胞皮下注射后7～10天腫瘤直徑達(dá)4～5 mm,成瘤率80%。

2.2 腫瘤體積及腫瘤重量變化(表1)

經(jīng)PEG-5-FU-MAMS及輻射+lipo-ASON聯(lián)合治療后，腫瘤體積明顯小于lipo-ASON組(P<0.05)和輻射組(P<0.01)及NS對(duì)照組(P<0.01)。磁性載藥微球及輻射+ lipo-ASON聯(lián)合組在外磁場(chǎng)誘導(dǎo)固定下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，腫瘤沒(méi)有呈現(xiàn)快速的增長(zhǎng)期，到治療結(jié)束時(shí)，PEG-5-FU-MAMS及輻射+ lipo-ASON聯(lián)合組腫瘤的體積抑制率達(dá)到85%,腫瘤重量的抑制率達(dá)到87.74%，磁性載藥微球及輻射+lipo-ASON組聯(lián)合組腫瘤的體積小于輻射組及l(fā)ipo-ASON和對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 各組腫瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組中的mdr1的mRNA RT-PCR 結(jié)果進(jìn)行分析顯示：①A組中mdr1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為1.94±0.04；②組中mdr1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.83±0.07；③C組中mdr1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為1.22±0.11。D組mdr1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.10；④D組與A組相比，mdr1mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了64.94%；C組與A組相比，mdr1mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了37.11%。A組與C組、D組間差異非常顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.49，P<0.01；t=13.4,P<0.01)；而C組與D組之間，差異也有顯著性(t=15.15，P<0.05)。

3 討論

胰腺癌是1種惡性程度高，進(jìn)程快的惡性腫瘤，具有發(fā)現(xiàn)完、病程短、轉(zhuǎn)移較早、預(yù)后差等特點(diǎn)，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升的趨勢(shì)，已經(jīng)成為腫瘤患者的主要死亡原因之一。由于胰腺本身的結(jié)剖學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué)特性，導(dǎo)致胰腺癌早期診斷困難，易于侵犯周?chē)拇笱芎蜕窠?jīng)，腫瘤很早時(shí)就發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)臨床上常規(guī)化療、放療和免疫學(xué)治療均不敏感，因此在腫瘤的治療過(guò)程中，胰腺癌是腹部腫瘤中預(yù)后最差的惡性腫瘤。在過(guò)去的20年中，雖然影像學(xué)診斷、手術(shù)技術(shù)、圍手術(shù)期處理及綜合治療等方面均有一定的進(jìn)展，但胰腺癌5年總的生存率并未提高，仍在的5%以下[2]。臨床上化療作為治療胰腺癌的重要手段之一，但化療過(guò)程中逐漸產(chǎn)生不敏感、耐藥。腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生嚴(yán)重阻礙了化療藥物在胰腺癌治療中的應(yīng)用，腫瘤的多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞接觸某一種抗癌藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)也對(duì)其它結(jié)構(gòu)和功能不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥，從而導(dǎo)致化療的失敗。其中主要是多藥耐藥基因(MDR1)及其表達(dá)產(chǎn)物糖蛋白(P-gp)介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，從而導(dǎo)致化療的失敗，mdrl基因定位于第7號(hào)染色體的q21.1，其編碼的膜糖蛋白(P-gp)是相對(duì)分子質(zhì)量為170 kD的跨膜磷脂糖蛋白，具有能量依賴(lài)的跨膜藥物外輸泵功能，可將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物濃度降低，產(chǎn)生耐藥。反義寡核苷酸(ASON)作為一種治療腫瘤的基因逆轉(zhuǎn)藥物，主要是通過(guò)堿基配對(duì)原則與靶基因結(jié)合，特異性與靶基因mRNA結(jié)合，阻斷其mRNA的翻譯，使該蛋白表達(dá)受阻。由于經(jīng)硫代修飾的反義寡核苷酸(ASON)在體內(nèi)有穩(wěn)定而較長(zhǎng)的半衰期，能主動(dòng)代謝，保持與MDR1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，能提高化療的療效，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[3]。Nicolas Skrypek等[4]應(yīng)用針對(duì)mdr1起始密碼AUG的反義聚硫代磷寡核苷酸，以陽(yáng)性脂質(zhì)體為載體作用肝癌耐藥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)反義硫代寡核苷酸可增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療細(xì)胞的敏感性部分逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的耐藥性，但同時(shí)也要找到1種高效的轉(zhuǎn)染方法，把反義硫代寡核苷酸轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。同樣隨著新型化療藥物磁性載藥微球的研制成功,也為實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療帶來(lái)新的希望。磁導(dǎo)向下載藥微球靶向治療腫瘤的作用機(jī)理是將微球注入瘤體或血管內(nèi)同時(shí)在腫瘤外部施加有效強(qiáng)度和梯度的外磁場(chǎng)，使磁性載藥微球相對(duì)集中聚集于腫瘤組織內(nèi)，并停留較長(zhǎng)的時(shí)間，緩慢釋放藥物，達(dá)到靶向腫瘤治療目的。由于磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞有穿透作用，腫瘤細(xì)胞在磁場(chǎng)的作用下，膜表面的帶電粒子由于受到洛侖磁力的影響，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞膜上的電子和離子不能正常的運(yùn)動(dòng)和傳遞，引起了腫瘤細(xì)胞膜微觀結(jié)構(gòu)的變化，從而影響了細(xì)胞膜的通透性和有序性[5]，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。也有人認(rèn)為，磁場(chǎng)作為1種物理場(chǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA會(huì)產(chǎn)生一定程度的損傷和抑制，此外癌細(xì)胞與正常的區(qū)別在于不進(jìn)入細(xì)胞的的正常的凋亡程序而出現(xiàn)惡性增值，磁場(chǎng)作用于癌細(xì)胞后，它產(chǎn)生的感性電流會(huì)先作用與細(xì)胞膜，影響其跨膜電位，導(dǎo)致鈣濃度升高，從而激活DNA內(nèi)切酶,使逃離細(xì)胞凋亡程序的癌細(xì)胞凋亡。這使逆轉(zhuǎn)試劑(反義的寡核苷酸)及新型化療藥物(磁性載藥微球)在磁導(dǎo)下分子更快、更多穿透細(xì)胞膜提供了條件，這可能是磁場(chǎng)與化療藥物協(xié)同作用抑制其多藥耐藥基因的表達(dá)原因之一[6]。鑒于胰腺癌臨床常用的化療藥物是5-FU和鹽酸吉西他濱等，而研究最多是5-FU 該藥主要作用細(xì)胞周期S期，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，對(duì)細(xì)胞增殖期腫瘤有明顯的抑制作用，由此我們制備了5-FU磁性載藥微球作為化療藥物與輻射逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)合治療胰腺癌。

表1 四組裸鼠治療后腫瘤體積及重量抑制情況

在腫瘤動(dòng)物模型復(fù)制方面，我們采取先種后處理的方式。大量研究表明，人體腫瘤/裸鼠系統(tǒng)是研究人體腫瘤的一種較為理想的模型系統(tǒng)，因異體移植后的人體腫瘤在裸鼠體內(nèi)人保持原有的組織形態(tài)、免疫學(xué)特點(diǎn)及特有的染色體組型以及對(duì)抗癌藥盒電離輻射原有的特征[7]。

可見(jiàn)磁性載藥微球(PEG-5-FU-MAMS)聯(lián)合輻射反義寡核苷酸(ASON)基因逆轉(zhuǎn)染劑(lipo-ASON)不僅在耐藥腫瘤的治療方面要顯著優(yōu)于單一的輻射及反義寡核苷酸(ASON)基因逆轉(zhuǎn)劑(lipo-ASON)，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存質(zhì)量的影響也明顯低于單一輻射及逆轉(zhuǎn)劑(lipo-ASON)組。

同時(shí)在腫瘤的治療效果上，也存在一些缺陷和不足，合成的反義寡核苷酸(ASON)基因逆轉(zhuǎn)染劑(lipo-ASON)轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞的量對(duì)腫瘤的抑制存在一定的影響[8]，我們僅是參考說(shuō)明書(shū)配置反義寡核苷酸(ASON)與轉(zhuǎn)染劑陽(yáng)性脂質(zhì)體的比例，這在不同細(xì)胞之間會(huì)造成一定差異，從而影響療效，此外合成的磁性載藥微球(PEG-5-FU-MAMS)中5-FU的載藥量對(duì)腫瘤的治療也存在一定的影響，本實(shí)驗(yàn)磁性載藥微球的合成是通過(guò)天津倍思樂(lè)色譜技術(shù)中心制備，5-FU在載藥量?jī)H有3.2%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的5-FU的載藥量為5.37%有一定的差異，這也是影響腫瘤治療效果的原因之一[9]。

實(shí)驗(yàn)研究表明，作為新型抗癌磁性藥物磁性載藥微球聯(lián)合輻射及聯(lián)合反義寡核苷酸(ASON)基因逆轉(zhuǎn)劑對(duì)人胰腺癌耐藥的治療有很好的研究和臨床應(yīng)用前景,為臨床治療胰腺癌提供新的治療思路。

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(編輯：吳小紅)

Reversal of Multidrug Resistance Antisense Oligodeoxynucletedes and PEG-5-FU-MAMS for Human Pancreatic Carcinoma Model in Nude Mice

ZHAOHuigeng,QUANGuangqian,PANYaozhen,etal.

AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian,116001

Objective To investigate the efficacy of reversal of multidrug resisitance(MDR) by MDR gene mdrl antisense oligodeoxynucletdes(ASON) and Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) for the human pancreatic cancer cell line in SW1990/Fu,and realize magnetic targeted therapy the human pancreatic cancer in nude mouse model.Methods dr1 ASON was injected into the tumor 1 hour after local 2 Gy60 Coγirradition.The tumor-suppressing rate and tumor-suppressing curve were observed in the 2 groups of cells after treatment with Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS).Results Significant differences in tumor weight and tumor volume were also observed between the 2 different treat group(P<0.01).The suppressing rates of tumor volume and weight were 87.74%and 85.00% respectively in grouop accepted combined radiation.Conclusion The reversal effect of mdr1 ASON and ionizing radiation plus Polyethy-lene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) is stronger on resistant cell than that of mdr1 ASON and Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) alone.

Ionizing radition;Antisense Oligodeoxynuce-letides;Gene transfection;Multidrug resistance;PEG-5-FU-MAMS

遼寧省自然科學(xué)基金(編號(hào)：201102006)

116001 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院

尹家俊

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.003

R735.9

A

1001-5930(2017)02-0181-04

2016-03-20

2016-11-15)