程珍霞 胡海濤 楊 莉 王長(zhǎng)春 郭衛(wèi)東 楊 玲

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 金華 321004)

超表達(dá)牛奶子EutPDS提高番茄果實(shí)番茄紅素含量*

程珍霞 胡海濤 楊 莉 王長(zhǎng)春 郭衛(wèi)東 楊 玲

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 金華 321004)

【目的】 牛奶子果實(shí)中富含番茄紅素，八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)是番茄紅素生物合成上游的重要酶。特異性超表達(dá)牛奶子EutPDS基因(GenBank登錄號(hào)：GQ254067)，以期提高番茄果實(shí)中的番茄紅素含量?！痉椒ā?通過RT-PCR方法從牛奶子果實(shí)中分離EutPDS基因cDNA及基因組全長(zhǎng)，Southern雜交分析基因的拷貝數(shù)，專用軟件分析此基因及蛋白結(jié)構(gòu)。采用番茄2A11啟動(dòng)子構(gòu)建果實(shí)特異性超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101后，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化至‘中蔬四號(hào)’番茄。半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)EutPDS基因的表達(dá)，高效液相色譜儀、實(shí)時(shí)定量PCR分別用于分析轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)主要類胡蘿卜素組分含量和內(nèi)源類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化?！窘Y(jié)果】 從牛奶子中克隆的EutPDS基因長(zhǎng)度為1 920 bp，含有1 749 bp ORF。其基因組序列無內(nèi)含子，單拷貝。EutPDS編碼1個(gè)582個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白與其他植物PDS有很高的同源性，具有典型的二核苷酸結(jié)合域、類胡蘿卜素結(jié)合域。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化番茄葉盤，PCR檢測(cè)，潮霉素篩選，成功獲得了2個(gè)EutPDS轉(zhuǎn)基因番茄株系，其果實(shí)顏色較對(duì)照更紅。半定量分析顯示外源EutPDS基因在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中超表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR分析表明番茄紅素生物合成上游2個(gè)內(nèi)源基因SlPSY和SlZDS受影響顯著上調(diào)，同時(shí)1個(gè)下游基因SlLCY-e的表達(dá)則顯著下調(diào)，使得轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中番茄紅素含量為野生型的2倍，但β-胡蘿卜素含量無顯著變化?！窘Y(jié)論】 在番茄果實(shí)中特異性超表達(dá)牛奶子EutPDS基因可有效促進(jìn)番茄果實(shí)中番茄紅素的合成和積累。

牛奶子； 番茄； 番茄紅素； 八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)； 載體構(gòu)建； 遺傳轉(zhuǎn)化

番茄紅素是一種具有11個(gè)共軛雙鍵的類胡蘿卜素化合物，其抗氧化能力極強(qiáng)，通過清除游離的氧自由基延緩細(xì)胞的衰老，對(duì)人體健康有著至關(guān)重要的作用(Dimascioetal., 1989; Mülleretal., 2016)。但人體自身無法合成番茄紅素，必須通過飲食從食物中攝取，其85%來源于番茄果實(shí)。隨著人們對(duì)番茄紅素的需求日益上升，有必要通過生物技術(shù)手段增加番茄中番茄紅素含量，提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

植物類胡蘿卜素生物合成途徑已基本闡明，始于八氫番茄紅素合成酶(PSY)催化2分子牻牛兒牻牛兒基焦磷酸向八氫番茄紅素的轉(zhuǎn)化，八氫番茄紅素經(jīng)過4步脫氫形成番茄紅素，中間物番茄紅素分2條支路在環(huán)化酶、羥化酶和加氧酶的作用下生成種類多樣的類胡蘿卜素(Direttoetal., 2007; Guoetal., 2009)。其中八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase, PDS)催化八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的2步脫氫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱鶜浞鸭t素(鄒禮平等， 2012； Liuetal., 2010)。許多植物的PDS基因已被克隆，但研究多限于序列比對(duì)及組織表達(dá)分析。近年來，應(yīng)用類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)基因改良作物品質(zhì)性狀的研究取得了較大進(jìn)展，積累β-胡蘿卜素的“黃金稻米”(Beyeretal., 2002; Paineetal., 2005)和“黃金馬鈴薯”(Direttoetal., 2007)就是最著名的例子。理論上，超表達(dá)PDS基因促進(jìn)八氫番茄紅素向下游代謝反應(yīng)可以提高番茄紅素的含量，但由于對(duì)番茄紅素生物合成的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，在應(yīng)用遺傳工程技術(shù)提高植物靶器官番茄紅素含量時(shí)，存在較大的盲目性(Dattaetal., 2014)。在小麥(Triticumaestivum)胚乳中特異性表達(dá)玉米(Zeamays)基因y1(編碼PSY)和細(xì)菌crtI(編碼PDS)，轉(zhuǎn)基因小麥的總類胡蘿卜素含量上升了10.8倍(Congetal., 2009)； 在小麥中同時(shí)表達(dá)細(xì)菌CrtB(編碼PSY)和CrtI基因，其種子干質(zhì)量的總類胡蘿卜素含量提高了近8倍，β-胡蘿卜素含量提高了65倍，維生素A前體含量提高了76倍(Wangetal., 2014)。同樣，在水稻(Oryzasativa)種子中超表達(dá)PSY和crtI基因，轉(zhuǎn)基因稻米中β-胡蘿卜素而非番茄紅素大幅增加(Dattaetal., 2014)。超表達(dá)PSY的轉(zhuǎn)基因黃金稻米之所以富含β-胡蘿卜素而非番茄紅素，是因?yàn)榕呷橹蠵DS基因的表達(dá)水平太低(Schaubetal., 2005)。在番茄(Solanumlycopersicum)中超表達(dá)SlPDS基因，獲得的轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)中的番茄紅素含量提高了1.4倍(鄒禮平等， 2012)。這些研究結(jié)果說明，PDS基因可能參與調(diào)控番茄紅素生物合成與積累。

牛奶子(Elaeagnusumbellata)為胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬植物，起源于我國(guó)，其成熟紅色果實(shí)番茄紅素含量高達(dá)0.54 mg·g-1，為番茄的5～18倍(Guoetal., 2009)，很可能成為工廠化生產(chǎn)番茄紅素的原料。前期的研究結(jié)果顯示，牛奶子EutPDS基因表達(dá)在果實(shí)成熟早期的黃果期就大幅上調(diào)，可能與其番茄紅素含量高有關(guān)(Guoetal., 2009)。本文在分析EutPDS基因結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，構(gòu)建果實(shí)特異性超表達(dá)載體，利用番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系使其在番茄果實(shí)中穩(wěn)定表達(dá)，顯著提高了番茄紅素含量，證實(shí)了EutPDS基因在番茄紅素生物合成及積累中的重要功能，為今后的利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛奶子定植于浙江師范大學(xué)生物園內(nèi)，以成熟紅色果實(shí)為試驗(yàn)材料(Guoetal., 2009)。番茄‘中蔬四號(hào)’種子由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，種植在盆中，正常管理。采摘破色期后10天的番茄果實(shí)作為成熟果，去除種子后將果肉切成小塊，液氮速凍后-80 ℃保存，種子曬干后保存。TRIzol試劑、限制性內(nèi)切酶、KOD高保真酶、Mix酶、T4 DNA連接酶、潮霉素等購(gòu)自北京科百奧生物技術(shù)有限公司； 引物由Invitrogen上海生物技術(shù)公司合成； M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、載體PMD 18-T購(gòu)于大連寶生物生物技術(shù)有限公司。色譜標(biāo)準(zhǔn)品β-胡蘿卜素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，番茄紅素購(gòu)自北京綠百草科技發(fā)展有限公司。

1.2 目的基因EutPDS的克隆與分析

采用熱硼酸鹽方法提取牛奶子成熟果實(shí)中的總RNA，以oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成一鏈cDNA(Guoetal., 2009)，采用CTAB法提取牛奶子葉片DNA?？鏓utPDS基因(GenBank登錄號(hào)：GQ254067)ORF區(qū)設(shè)計(jì)特異引物(上游5′-ATGTCCCAGTGGGGGTGTACTAC-3′和下游5′-TGAACCTGTCCCTCTTTTGCT-3′)，分別以果實(shí)一鏈cDNA和葉片DNA擴(kuò)增出其cDNA及基因組全長(zhǎng)序列。25 μL反應(yīng)體系： 上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，10 × LaPCR緩沖液2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，LaTaq DNA聚合酶(Takara)0.2 μL。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

分別用BamHⅠ，SacⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ 4種內(nèi)切酶消化葉片DNA。100 μL酶切體系包括10 × buffer 10 μL、內(nèi)切酶4 μL、DNA 10 μL(15～20 μg)?；靹蚝?7 ℃保溫15 h。探針制備用上游引物5′-ATGTCCCAGTGGGGGTGTACTAC-3′和下游引物5′-CGGTTGAACTGTCCTGGTTTGT-3′。使用羅氏(Roche)公司Southern雜交試劑盒，按說明書操作。1.3 果實(shí)特異性EutPDS超表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)EutPDS序列設(shè)計(jì)上游引物F(KpnⅠ)(5′-GGGTACCATGTCCCAGTGGGGGTGTACT-3′)和下游引物R(BamHⅠ)(5′-CGGATCCTCAAAAAGA GCCTGTCTCTG-3′)，以牛奶子紅果一鏈cDNA為模板，用高保真酶進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，58.8 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)； 68 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段后連接至PMD 18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆送Invitrogen公司測(cè)序驗(yàn)證。在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建EutPSY基因的番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子2A11植物表達(dá)載體pCAMBIA 2A11-EutPSY-1301基礎(chǔ)上，提取pCAMBIA 2A11-EutPSY-1301和EutPDS-PMD 18-T質(zhì)粒，使用相同的內(nèi)切酶KpnⅠ、BamHⅠ分別進(jìn)行雙酶切，回收得到EutPDS基因和2A11-1301載體片段，用T4 DNA連接酶連接，完成EutPDS基因替換EutPSY基因。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，正確的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA 2A11-EutPDS-1301。

1.4 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pCAMBIA 2A11-EutPDS-1301轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，菌液PCR篩選及雙酶切驗(yàn)證。利用葉盤法轉(zhuǎn)化番茄(鄒禮平等， 2012)，使用20 mg·L-1潮霉素篩選。以番茄再生植株葉片基因組DNA為模板，根據(jù)載體上的GUS標(biāo)記基因序列合成引物(上游5′-GTGAATCCGCACCTCT-3′和下游5′-ATCGCCGCT TTGGACATA-3′)，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.5 半定量RT-PCR分析EutPDS基因的表達(dá)

取3個(gè)成熟番茄果實(shí)，用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA為模板，根據(jù)EutPDS的5′非保守域設(shè)計(jì)特異引物F(5′-GCTACGATGA AAGAACTGGCTAA-3′)和R(5′-AGGGACGGCAAG GTTCACAA-3′)(Guoetal., 2009)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用番茄泛素基因(SlUBI)為內(nèi)參基因(F: 5′-AAGCAATGGATGCTGAGGCT-3′； R: 5′-GAAGGTG CCGTTGAATGACA-3′)(Tikunovetal., 2013)。PCR反應(yīng)程序： 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

1.6 番茄果實(shí)主要類胡蘿卜素組分測(cè)定

用3個(gè)成熟果實(shí)進(jìn)行類胡蘿卜素的提取、濃縮、樣品的制備及高效液相色譜分析，均參照胡海濤等(2014)的方法，在450 nm下檢測(cè)，重復(fù)3次。運(yùn)用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異顯著。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR分析番茄內(nèi)源類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達(dá)

番茄SlPSY、SlPDS、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(SlZDS)、番茄紅素β-環(huán)化酶(SlLCY-b)、番茄紅素ε-環(huán)化酶(SlLCY-e)等基因的引物序列參考文獻(xiàn)(Tikunovetal., 2013)，用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)在StepOnePlusTM Real-Time PCR System(ABI公司)分析成熟番茄果實(shí)中類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)，SlUBI為內(nèi)參基因，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(Guoetal., 2009)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶子EutPDS基因的結(jié)構(gòu)

分別以牛奶子葉片DNA、果實(shí)cDNA為模板，擴(kuò)增出大小一致的基因，全長(zhǎng)約1 920 bp(圖1)； 測(cè)序結(jié)果也表明EutPDS基因的DNA序列與其cDNA序列一致，說明其沒有內(nèi)含子。EutPDS基因的ORF為1 749 bp，編碼582個(gè)氨基酸，計(jì)算出的分子質(zhì)量為65.2 kDa，等電點(diǎn)為8.12。Southern雜交結(jié)果表明，EutPDS基因在牛奶子基因組中只有1個(gè)拷貝，番茄等大多數(shù)植物中的PDS為單拷貝(Mannetal., 1994)。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，EutPDS氨基酸序列與花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)(ABV46593)、杏樹(Prunusarmeniaca)(AAX33347)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AAK64084)的同源性最高，與番茄(ABR57230)同源性也達(dá)80%。EutPDS蛋白含有典型的與FAD或者NAD(P)結(jié)合的βαβ吡啶二核苷酸結(jié)合域、類胡蘿卜素結(jié)合域(圖2)。

圖1 牛奶子EutPDS基因全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of full-length EutPDS from Elaeagnus umbellataM. DL2000 marker. 1. DNA全長(zhǎng)； 2. cDNA全長(zhǎng)。1.Full-length DNA； 2. Full-length cDNA.

2.2 果實(shí)特異性超表達(dá)載體的構(gòu)建

以牛奶子成熟果實(shí)一鏈cDNA為模板，合成帶有酶切位點(diǎn)的引物，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條約2 kb的清晰條帶，回收測(cè)序。連接轉(zhuǎn)化后，獲得EutPDS-PMD 18-T質(zhì)粒。將擴(kuò)增產(chǎn)物定向連接至pCAMBIA301-2A11載體(圖3)。經(jīng)酶切驗(yàn)證的重組質(zhì)粒pCAMBIA 2A11-EutPDS-1301轉(zhuǎn)化至根瘤農(nóng)桿菌GV3101中，菌液PCR及雙酶切結(jié)果顯示重組載體已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。2.3 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR檢測(cè)

將果實(shí)特異性超表達(dá)載體PCAMBIA 2A11-EutPDS-1301通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化至番茄‘中蔬四號(hào)’，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株(圖4)。特異擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因再生苗的GUS能夠鑒定表達(dá)載體的T-DNA區(qū)是否插入到番茄基因組中，檢測(cè)結(jié)果見圖5。對(duì)番茄轉(zhuǎn)化株系T1代種子進(jìn)行潮霉素篩選，得到2個(gè)結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因陽性株系。

圖3 牛奶子EutPDS基因超表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of EutPDS-overexpression vector

圖4 轉(zhuǎn)基因番茄植株的再生及結(jié)實(shí)Fig.4 Regeneration and fruit set of transgenic tomato plantsA. 無菌苗； B. 不定芽的分化； C. 不定芽的生長(zhǎng)； D. 生根； E. 再生植株的移植； F. 轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)。 A. Aseptic plantlet; B. Differentiation of adventitious buds； C. Growth of adventitious buds； D. Rooting； E. Transplantation of regenerated plants； F. Transgenic tomato fruit.

圖5 轉(zhuǎn)基因番茄再生植株的PCR檢測(cè)Fig.5 PCR identification of transgenic tomatoesM. DL2000 marker. 1. 陽性對(duì)照； 2. 野生型； 3-7. 轉(zhuǎn)基因番茄。1. Positive control； 2. Wild type； 3-7. Transgenic tomato.

2.4 轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實(shí)中EutPDS的表達(dá)

利用半定量RT-PCR分析外源基因EutPDS在番茄中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中出現(xiàn)了預(yù)期的EutPDS基因條帶，而野生型中沒有檢測(cè)到(圖6)，說明轉(zhuǎn)基因番茄中外源EutPDS基因已在番茄果實(shí)中組成型表達(dá)。

圖6 EutPDS基因在轉(zhuǎn)基因及野生型番茄中的半定量分析Fig.6 Semi-quantitative PCR analysis of EutPDS expression in the tomato fruit of transgenic line and wild type1-3. 野生型； 4,5. 轉(zhuǎn)基因株系OE-1,OE-2。 1-3. Wild type； 4,5. Transgenic line OE-1 and OE-2, respectively.

2.5 轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實(shí)的類胡蘿卜素組分

野生型及轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的主要類胡蘿卜素組分為β-胡蘿卜素和番茄紅素。與野生型比較，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系番茄果實(shí)中的β-胡蘿卜素含量沒有顯著變化，但番茄紅素含量顯著增高(P<0.05)，從而使總胡蘿卜素含量也顯著上升； 且以EutPDS表達(dá)量相對(duì)高的株系OE-1中的番茄紅素和總胡蘿卜素含量增幅較大，分別為(133.81±14.49)、(161.58±18.24)μg·g-1(以鮮質(zhì)量計(jì))，約為野生型的2倍(圖7)。說明外源基因EutPDS的超表達(dá)提高了番茄紅素的含量。

圖7 轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實(shí)中類胡蘿卜素的含量Fig.7 Carotenoids content of ripe transgenic tomato fruitsWT： 野生型； OE-1, OE-2： 轉(zhuǎn)基因株系。*：表示P<0.05差異顯著。WT： Wild type； OE-1, OE-2： Transgenic lines. *：Significance at 0.05 level.

2.6EutPDS超表達(dá)的番茄果實(shí)中類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)

番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的生物合成始于SlPSY催化2分子牻牛兒牻牛兒基焦磷酸向八氫番茄紅素的轉(zhuǎn)化，八氫番茄紅素經(jīng)過SlPDS和六氫番茄紅素脫氫酶(SlZDS)的連續(xù)脫氫生成番茄紅素，中間物番茄紅素在2種番茄紅素環(huán)化酶(SlLCY-b、SlLCY-e)的作用下繼續(xù)代謝形成β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素等，這些胡蘿卜素經(jīng)過羥化酶和加氧酶的作用形成種類多樣的類胡蘿卜素及其他下游代謝產(chǎn)物(鄒禮平等， 2012; Liuetal., 2010)。選取超表達(dá)EutPDS顯著的轉(zhuǎn)基因番茄株系OE-1，利用實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，EutPDS基因超表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)中內(nèi)源類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響不同： 與野生型比較，除SlPDS基因表達(dá)沒有顯著變化外，番茄紅素生物合成上游基因SlPSY和SlZDS均極顯著上調(diào)(P<0.01)； 下游基因SlLCY-b的表達(dá)沒有顯著變化，SlLCY-e的表達(dá)則極顯著下降(圖8)。

圖8 實(shí)時(shí)定量PCR分析轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)內(nèi)源類胡蘿卜素生物合成基因的表達(dá)Fig.8 Real-time quantitative PCR analysis of the expression of endogenous carotenoid biosynthetic genes in transgenic tomato fruit**表示P<0.01差異顯著Significance at 0.01 level.

3 討論

朱海生等(2011)克隆了草莓(Fragaria×ananassa)PDS基因，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列與其他物種具有很高的相似性，該基因表達(dá)水平在紅色果實(shí)中最高，在葉片中最低。陳段芬等(2008)克隆了中國(guó)水仙(Narcissustazettavar.chinensis)PDS基因，其在花中表達(dá)最高。EutPDS基因主要在葉、花和成熟果實(shí)中表達(dá)(Guoetal., 2009)。EutPDS基因沒有內(nèi)含子，與番茄(X71023)、擬南芥(ATCHRIV38)和水稻(AC079633)基因組中PDS基因的多個(gè)外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(≥10)(Mannetal., 1994; Matthewsetal., 2003)不同。EutPDS在基因組中為單拷貝，番茄、玉米和水稻基因組中的PDS也只有1個(gè)拷貝(Aracrietal., 1994; Matthewsetal., 2003)，溫州蜜柑(Citrusunshiu)、大豆(Glycinemax)有2～3個(gè)拷貝(Bartleyetal., 1991; Kitaetal., 2001)，PDS基因的低拷貝數(shù)特征可能是植物的共性(Kitaetal., 2001)。

番茄紅素的抗氧化能力較β-胡蘿卜素強(qiáng)(Dimascioetal., 1989; Mülleretal., 2016)，食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，因此人們?cè)噲D利用基因工程的方法提高可食用植物靶器官中番茄紅素的含量。果實(shí)特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，在‘Ailsa Craig’遺傳背景下超表達(dá)噬夏孢歐文菌(Erwiniauredovora)PSY基因，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中的番茄紅素、β-胡蘿卜素、總類胡蘿卜素含量分別提高了1.8～2.1，1.6～2.7和2～4倍(Fraseretal., 2002)。使用胚乳特異性啟動(dòng)子在小麥中共表達(dá)來源于噬夏孢歐文菌的PSY和PDS基因，其種子(干質(zhì)量)的總類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素含量分別提高到8倍和65倍，但番茄紅素的含量?jī)H略增加(Wangetal., 2014)。Schaub等(2005)認(rèn)為，超表達(dá)水仙花(Narcissuspseudonarcissus)PSY的轉(zhuǎn)基因黃金稻米之所以富含β-胡蘿卜素而非番茄紅素，是因?yàn)榕呷橹蠵DS基因的表達(dá)水平太低。在番茄‘中蔬5號(hào)’中超表達(dá)內(nèi)源SlPDS基因，獲得的轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)中的番茄紅素含量平均提高了1.4倍(鄒禮平等， 2012)； 但將噬夏孢歐文菌的PDS組成型表達(dá)載體轉(zhuǎn)入番茄‘Ailsa Craig’，果實(shí)中β-胡蘿卜素提高了3倍，而番茄紅素含量減半，類胡蘿卜素的總量也只有野生型的50%(R?meretal., 2000)。由此可見，番茄紅素生物合成的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜。植物類胡蘿卜素生物合成受一系列酶或基因調(diào)控，某一種類胡蘿卜素合成酶催化活性的改變或代謝中間物含量的變化會(huì)調(diào)節(jié)其他類胡蘿卜素合成內(nèi)源基因的表達(dá)(Beyeretal., 2002; Paineetal., 2005; Direttoetal., 2007)。此外，使用的基因及其來源、啟動(dòng)子、受體遺傳背景等的不同均會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株靶器官中類胡蘿卜素的組分及其含量(Paineetal., 2005; Direttoetal., 2007; Wangetal., 2014)。

4 結(jié)論

牛奶子果實(shí)富含番茄紅素，EutPDS表達(dá)水平在果實(shí)成熟早期就大幅上調(diào)。本文在番茄果實(shí)中特異性超表達(dá)外源EutPDS基因，不但克服了SlPDS酶的限制，而且顯著誘導(dǎo)了番茄紅素生物合成上游內(nèi)源基因SlPSY和SlZDS的表達(dá)、顯著下調(diào)下游內(nèi)源基因SlLCY-e表達(dá)，增加了番茄紅素生物合成上游原料的供給，降低分支途徑的代謝消耗，從而顯著促進(jìn)番茄紅素的合成與積累，番茄紅素含量為野生型對(duì)照組的2倍，β-胡蘿卜素的含量則無顯著變化。轉(zhuǎn)基因番茄株系果實(shí)中的番茄紅素積累顯著提高，不但證實(shí)了EutPDS在番茄紅素合成中重要的定向調(diào)節(jié)作用，而且為EutPDS作為番茄紅素生物反應(yīng)器的候選功能基因提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Overexpression ofEutPDSGene fromElaeagnusumbellataIncreases Lycopene Content in Tomato Fruit

Cheng Zhenxia Hu Haitao Yang Li Wang Changchun Guo Weidong Yang Ling

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversityJinhua321004)

【Objective】 Lycopene has a strong anti-oxidative activity, which could remove free radicals of oxygen to delay the aging of cells of human body. Phytoene desaturase (PDS) is an important upstream enzyme of lycopene biosynthesis. The fruit ofElaeagnusumbellatawas found to accumulate high level of lycopene. This study was aimed to enhance lycopene component of tomato(Solanumlycopersicum)by overexpressingEutPDS(GenBank number: GQ254067) driven by fruit-specific promoter. 【Method】 The full-length cDNA and genomic DNA ofEutPDSgene were isolated fromE.umbellatafruit using RT-PCR. The copy number was determined by southern blot hybridization. The structural features ofEutPDSgene and protein were analyzed by using special software. A recombinant plasmid carryingEutPDSgene driven by fruit-specific promoter 2A11 was constructed. The expression vector was transferred into theAgrobacteriumtumefaciensstrain GV3101, and then introduced into a tomato variety ‘Zhongshu 4’ byAgrobacterium-mediated leaf disc method. Semi-quantitative RT-PCR was used to analyzeEutPDSexpression. High performance liquid chromatography and real-time RT-PCR were used to identity the main components of carotenoids and endogenous carotenoid gene expression in tomato fruits of both transgenic lines (OE) and wild-type, respectively. 【Result】 The clonedEutPDScDNA has 1 920 bp in length and contained a 1 749 bp ORF. TheEutPDSgene was not interrupted by any intron and exists as a single copy inE.umbellatagenome.EutPDSencodes a protein of 582 amino acids, which showed a high identity with other plant PDSs. Both a potential dinucleotide-binding motif and the carotenoid-binding domain were identified. The overexpressing vector ofEutPDSwas transformed into tomato leaves byAgrobacterium-mediated method. Two transgenic lines ofEutPDSwere obtained after PCR detection and hygromycin screen. The transgenic fruits were redder than wild type. Semi-quantitative PCR analysis showed thatEutPDSgene was overexpressed in transgenic tomato fruit. Real-time quantitative PCR analysis demonstrated that two endogenous upstream genes of lycopene biosynthesis,SlPSYandSlZDS, were significantly upregulated while a downstream geneSlLCY-ewas significantly downregulated in the fruit of OE-1 compared with the wild-type. Lycopene content in transgenic tomato fruits was nearly twice as much as that in the wild-type, butβ-carotene content was not significantly different.【Conclusion】 Fruit-specific overexpression ofEutPDSgene in tomato can significantly increase the biosynthesis and accumulation of lycopene.

Elaeagnusumbellata;Solanumlycopersicum; lycopene; phytoene desaturase gene (PDS); vector construction; genetic transformation

10.11707/j.1001-7488.20170108

2016-01-18；

2016-07-07。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31071775)； 浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008C24G2030004)。

S718.46

A

1001-7488(2017)01-0062-08

*楊玲為通訊作者。