吳 然，徐秋良

(石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院 果樹花卉研究中心，石家莊，050000)

類病毒的概念是由植物病理學(xué)家Diener在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中首次提出[1]。類病毒是目前為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物，約由246～463個(gè)核苷酸組成[2]。類病毒一旦侵染果樹，就會(huì)對(duì)植株造成極大的影響，即使不表現(xiàn)病癥或無明顯病癥，果樹被類病毒侵染后很難有效根除。蘋果是我國的重要生產(chǎn)樹種，近年來類病毒對(duì)蘋果的侵染有蔓延趨勢，致使果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，還嚴(yán)重影響了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。迄今為止類病毒病害在我國蘋果上發(fā)生的主要有：蘋果銹果類病毒ASSVd(AppleScarSkinviroid)、蘋果凹果類病毒ADFVd(Appledimplefruitviroid)、蘋果皺果類病毒AFCVd(Applefruitcrinkleviroid)等。

1 我國蘋果類病毒的種類及特性

1.1 蘋果銹果類病毒

蘋果銹果類病毒ASSVd屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospivioidae)蘋果銹果類病毒屬(Apscaviroid)，約含330個(gè)左右的核苷酸，是目前發(fā)現(xiàn)的最小病原物，存在于細(xì)胞核內(nèi)，具有自我復(fù)制能力，有中央保守序列并且不具有核酶活性[3，4]。1987年，日本的病理學(xué)家Hashimoto等[5]確認(rèn)其為類病毒，并首次報(bào)道了它的全序列。

研究發(fā)現(xiàn)，ASSVd不僅可侵染蘋果[6]，還可以侵染梨[7]、桃子[8]、杏[3]等，感病果實(shí)的病癥基本表現(xiàn)為花臉型、銹果型、銹果花臉復(fù)合型、環(huán)斑型和綠點(diǎn)型5種(表1)。研究檢測表明，植株一旦染病即全身帶毒，其葉、莖、砧木及果實(shí)都可檢測出ASSVd[9]；病樹的果實(shí)變小、硬度增加、表面有銹斑、風(fēng)味變差，失去商品價(jià)值，對(duì)果農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]；尤其是在近幾年，ASSVd在我國蘋果主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，但目前尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)該病毒的有效防治措施。

1.2 蘋果凹果類病毒

蘋果凹果類病毒ADFVd目前在我國蘋果果園發(fā)生率較低。因其致使意大利的蘋果品種Starking Delicious表現(xiàn)出明顯的凹果病癥而由此得名,是一種新發(fā)現(xiàn)的類病毒病害。它與蘋果銹果類病毒同為Pospiviroidae 科Apscaviroid屬成員，其RNA有306 nt組成，ADFVd與ASSVd的序列相似性高達(dá)63.5%，包含了蘋果銹果類病毒組的整個(gè)保守區(qū)域[11]。我國的趙英等[12]在新疆栽培的國光蘋果品種上也檢測到ADFVd，并為進(jìn)一步研究ADFVd的株系分化奠定了良好的基礎(chǔ)。

被ADFVd侵染的蘋果病癥表現(xiàn)為，果實(shí)畸形和果皮表面形成病斑(3～4 mm的凹形綠色斑點(diǎn))，這些病斑的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致部分下層果肉壞死和果實(shí)萎縮(表1)。另外，在某些蘋果品種上的發(fā)病癥狀與ASSVd侵染導(dǎo)致的斑點(diǎn)類似[11]。

1.3 蘋果皺果類病毒

蘋果皺果類病毒AFCVd一般約有368～372個(gè)核苷酸，非對(duì)稱性復(fù)制，存在于細(xì)胞核內(nèi)，也同屬于Pospiviroidae科Apscaviroid屬[14]。1976在日本首次發(fā)現(xiàn)蘋果皺果病癥，后經(jīng)試驗(yàn)確認(rèn)是由AFCVd引起[16]。我國趙英等[14]成功在新疆栽培的蘋果上檢測出了該病毒并對(duì)其序列進(jìn)行了分析，確認(rèn)其被AFCVd侵染，這也是我國首次對(duì)AFCVd的報(bào)道。

AFCVd侵染蘋果后，主要會(huì)對(duì)果實(shí)造成危害。其癥狀表現(xiàn)為果實(shí)粗糙皺縮和果肉壞死(表1)。在幼果期間，感病果實(shí)的果面就開始出現(xiàn)水漬狀凹陷斑，凹陷斑大小不一且形狀不規(guī)則，從而形成畸形果[15]；待到7月下旬后，感病斑塊發(fā)展為鐵銹色且木栓化；另外有一些品種感病后，樹皮也發(fā)生異常，如出現(xiàn)枝條末梢枯死等[16]。近年的研究中發(fā)現(xiàn)，在日本一些鄰近蘋果果園的啤酒花中也可檢測到AFCVd，這一發(fā)現(xiàn)說明AFCVd的寄主范圍有不斷擴(kuò)大的趨勢[17]。

表1 我國蘋果類病毒的特性

2 蘋果類病毒的檢測技術(shù)

類病毒為環(huán)狀RNA分子，不具有外殼蛋白，所以不能編碼蛋白，因此不能用血清學(xué)的方法檢測，如酶聯(lián)免疫吸附法等。目前研究中，應(yīng)用于蘋果類病毒的檢測方法主要包括指示植物法和分子生物學(xué)技術(shù)等。

2.1 指示植物法

指示植物法，是通過對(duì)病毒敏感性強(qiáng)并且能表現(xiàn)出明顯癥狀的植物，作為指示植物來鑒別是否被侵染的方法[18]。研究者們利用指示植物法研究病毒的侵染機(jī)理，汁液摩擦是將病毒接種到指示植物上的主要方法。檢測果樹是否被病毒侵染的指示植物分為木本和草本2種類型。董艷娜等[19]利用番茄為指示植物鑒定出了5種柑橘類病毒。在蘋果病毒病檢測方面，辛玉成等[20]在恒溫室利用雜種榅桲檢測出了蘋果莖痘病毒以及蘋果莖溝病毒。謝曉亮等[21]利用昆諾藜和心葉煙，檢測到蘋果莖溝病毒和蘋果褪綠葉斑病毒。利用指示植物法檢測病毒，不需要先進(jìn)的儀器也無需復(fù)雜的檢測步驟。但是該方法耗時(shí)較長且對(duì)外部環(huán)境條件的要求很高；另外有些指示植物可以被幾種類病毒復(fù)合侵染，因?yàn)楦腥静煌惒《颈憩F(xiàn)的病癥不同，所以要將其鑒別區(qū)分很難[22]。

2.2 分子生物學(xué)技術(shù)

2.2.1聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。利用該方法即使不知道類病毒的核酸序列，也可判斷出病原物是否為類病毒。它的作用原理是在變性電泳條件下交換電極，使類病毒的環(huán)狀核酸打開由棒狀變?yōu)榄h(huán)狀，遷移速度變慢，從而類病毒的環(huán)狀分子與寄主的線性核酸分子分離，并因此產(chǎn)生明顯的條帶[23，24]。該方法最開始用于類病毒和環(huán)狀RNA的提純和分離，在運(yùn)用于檢測類病毒后被進(jìn)一步改進(jìn)。Morris等[25]首次通過該方法從植物中成功檢測出馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RNA分子，經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色條帶。利用該方法的檢測成本較低,但靈敏度不高且需要大量的植物樣本。

2.2.2RT- PCR擴(kuò)增 RT- PCR是一種十分靈敏的檢測方法，即使是很低拷貝數(shù)的RNA，也可以檢測到。這種方法要求模板的純度很高，但是果樹類的檢測樣本通常具有大量的糖類，所以在提取中容易失敗，可將乙二醇單甲醚和聚乙烯吡咯烷酮加入PCR中來去除糖類和RNA的阻遏物[26]。當(dāng)前利用RT- PCR的方法來檢測果樹類病毒已經(jīng)非常普遍：趙英等[12，14]利用RT- PCR成功檢測出了蘋果凹果類病毒和蘋果皺果類病毒；陳紅霞等[27，28]利用RT- PCR檢測到了蘋果銹果類病毒，并且利用一步多重的RT- PCR方法同時(shí)快速檢測出3種蘋果潛隱性病毒；Ragozzino等[29]利用RT- PCR可同時(shí)檢測7種類病毒，這也證實(shí)了這種方法的便捷和高靈敏度。

2.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種新興的定量試驗(yàn)技術(shù),它通過使用熒光化學(xué)物質(zhì)來檢測DNA擴(kuò)增反應(yīng)中每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物的總量。這種方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量并且無需電泳，因此較RT- PCR不易出現(xiàn)因污染而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，所以其檢測結(jié)果更加精確[30]。

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系中加入的不同熒光化學(xué)，將其分為熒光染料法和探針法。在近年來有關(guān)檢測蘋果病毒病的研究中，秦子禹等[31～33]利用Taqman探針法檢測到了3種蘋果潛隱性病毒，但探針的使用會(huì)大大提高病毒檢測的難度。研究表明利用SYBR Green I染料法檢測病毒，不僅成本低于探針法而且簡化了檢測步驟，因此更適于針對(duì)大量樣本的快速檢測[34]。吳然等[35]利用SYBR Green I染料法快速檢測出了蘋果銹果類病毒，且證實(shí)了其靈敏度要高于常規(guī)RT- PCR100倍。

表2 蘋果類病毒的檢測方法

3 展 望

蘋果是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種，產(chǎn)量居世界第一位。類病毒的穩(wěn)定性極高，可通過嫁接、修剪等農(nóng)事操作傳播，從而快速蔓延。目前蘋果類病毒病害已嚴(yán)重影響了我國蘋果產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。由于果樹一旦感染類病毒就將終身帶毒的特性，至今還沒有有效的措施來防治類病毒。針對(duì)此現(xiàn)狀，培育無毒苗木并在無毒苗生產(chǎn)過程中有效篩除類病毒，便是在源頭上解決類病毒侵染和蔓延的關(guān)鍵。但是由于市場監(jiān)管不力、生產(chǎn)技術(shù)不規(guī)范等問題，市場上用于生產(chǎn)的真正的無毒苗很少。因此我國應(yīng)健全蘋果無毒苗的生產(chǎn)規(guī)范，完善無毒苗的生產(chǎn)體系和和市場監(jiān)管系統(tǒng)；建立簡捷、準(zhǔn)確的類病毒檢測體系，從而為我國蘋果的生產(chǎn)提供大量優(yōu)質(zhì)、放心的無毒苗木；積極推廣無毒苗木，把政府部門、科研高校、相關(guān)企業(yè)和農(nóng)戶結(jié)合起來，建成一個(gè)自下而上的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而從源頭控制果樹類病毒，有效防止類病毒的蔓延，進(jìn)而提高我國蘋果的品質(zhì)和增加果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益[36]。

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