董艾青， 劉少文， 柏 凡， 陳 宇， 郭春華， 柏 雪*

（1.西南民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)試中心（成都），四川成都 610041）

不同方法檢測(cè)霉菌毒素的比較研究

董艾青1， 劉少文1， 柏 凡2， 陳 宇1， 郭春華1， 柏 雪1*

（1.西南民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)試中心（成都），四川成都 610041）

本研究通過(guò)比較三種不同方法對(duì)霉菌毒素檢測(cè)結(jié)果的差異，旨在為檢測(cè)霉菌毒素提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒、超高效液相色譜（UHPLC）和液相質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）三種檢測(cè)方法，對(duì)仔豬配合飼料中黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、嘔吐毒素（DON）含量進(jìn)行檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)AFB1、ZEA和DON時(shí)，超標(biāo)率與UHPLC法和HPLC-MS/MS法接近；但ELISA法檢測(cè)AFB1結(jié)果為限量值為80%以上時(shí)，采用UHPLC法的檢測(cè)結(jié)果顯著高于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），其他所有樣品的AFB1、ZEA和DON兩種儀器檢測(cè)方法差異不顯著（P＞0.05）。ELISA可作為霉菌毒素檢測(cè)的快速初篩法；對(duì)ELISA結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，低含量AFB1樣品更宜采用HPLC-MS/MS法，其余樣品采用UHPLC法檢測(cè)更經(jīng)濟(jì)；對(duì)DON和ZEA的ELISA結(jié)果確認(rèn)時(shí)，也可采用UHPLC法。

ELISA試劑盒；UHPLC；HPLC-MS/MS；仔豬配合飼料；霉菌毒素

霉菌毒素對(duì)飼料和糧食的污染問(wèn)題已成為不可忽視的重大難題。Akande（2006）報(bào)告顯示，全世界每年受霉菌毒素污染的作物約占總量的25%。Sulyok（2006）調(diào)查結(jié)果顯示，受污染的作物中霉菌毒素就有300～400種。我國(guó)飼料與糧食中霉菌毒素的污染也不容小覷。程傳民（2014）的研究數(shù)據(jù)表明，我國(guó)小麥嘔吐毒素（DON）檢出率達(dá)94.8%；龔阿瓊（2015）的研究結(jié)果顯示，飼料原料中AFB1的檢出率為95.5%，最低的玉米赤霉烯酮（ZEA）檢出率也接近90%；季海霞（2015）對(duì)飼料原料檢測(cè)顯示，AFB1檢出率超過(guò)90%，ZEA、DON接近全檢出，玉米副產(chǎn)物中ZEA檢出率高達(dá)1518.18μg/kg，DON檢出率更是高達(dá)4402.69 μg/kg，超標(biāo)率分別為12.25%和51.09%，污染較為嚴(yán)重。2006—2012調(diào)查結(jié)果顯示，3種霉菌毒素的檢出率均有下降趨勢(shì)，超標(biāo)率卻沒(méi)有明顯下降，AFB1超標(biāo)率反而有上升趨勢(shì) （周闖等，2014；敖志剛等，2008）。

目前飼料中霉菌毒素的檢測(cè)方法比較多，可以分為快速篩選法和基準(zhǔn)方法。快速篩選方法以熒光光度計(jì)法、ELISA法較為常用。基準(zhǔn)方法包括液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層色譜法、近紅外光譜法和熒光檢測(cè)法等。ELISA試劑盒法是目前運(yùn)用最多的霉菌毒素檢測(cè)方法，此法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，但是特異性較差，有假陽(yáng)性等情況出現(xiàn)。UHPLC應(yīng)用也較普遍，是目前國(guó)際上使用最廣泛的霉菌毒素檢測(cè)方法，但是使用繁瑣、成本較高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速和大量的樣品篩選。HPLC-MS/ MS能夠?qū)︼暳霞笆称分忻咕舅?、獸藥殘留、非法添加物等進(jìn)行痕量和超痕量分析，且基本沒(méi)有假陽(yáng)性現(xiàn)象出現(xiàn)，是檢測(cè)的理想方法，但儀器和耗材昂貴，對(duì)檢驗(yàn)人員技術(shù)要求也較高。

基于檢測(cè)方法在畜牧飼料行業(yè)中的重要性，本實(shí)驗(yàn)利用不同的檢測(cè)方法對(duì)仔豬配合飼料中霉菌毒素進(jìn)行檢測(cè)比較，分別評(píng)價(jià)不同方法對(duì)不同霉菌毒素的檢測(cè)效果，為尋找一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的霉菌毒素檢測(cè)方法提供科學(xué)依據(jù)，以確保檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 嚴(yán)格按照 GB/T 14699.1-2005《飼料采樣》標(biāo)準(zhǔn)，從四川、重慶等地的飼料廠采集具有代表性的仔豬配合飼料33份。

1.2 儀器與試劑 主要試劑：ELISA試劑盒（Romer Labs Gmbh公司）；多功能凈化柱（MycospinTM400）；乙腈，色譜級(jí)（≥99.9%）；甲醇，色譜級(jí)（≥99.9%）；正己烷、乙酸、三氟乙酸、霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)液，均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，保存條件為2～8℃；吐溫；超純水（UP級(jí)）。

主要儀器：超高效液相色譜儀 （型號(hào)：ACQUITY UPLCM-Class，ACQUITYWATERS公司，美國(guó)）；液相質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 （型號(hào)：1290/6460，Agilent公司，美國(guó)）；DNM-9602酶標(biāo)分析儀；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（型號(hào)：ULUP?-I-5/10/20T，優(yōu)普超純科技公司，中國(guó)）；XH-B型旋渦混合器；DH-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；HS-501振蕩器；電子天平；隔膜真空泵（型號(hào)：GM-0.33A）；氮吹儀。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 利用ELISA法、UHPLC法和HPLC-MS/MS法對(duì)配合飼料中AFB1、ZEA 和DON含量進(jìn)行測(cè)定。ELISA法參照操作說(shuō)明書進(jìn)行；UHPLC法檢測(cè)：AFB1檢測(cè)參考 GB/T 30955-2014標(biāo)準(zhǔn)，ZEA參考GB/T 28716-2012標(biāo)準(zhǔn)，DON參考GB/T 30956-2014標(biāo)準(zhǔn)；HPLC-MS/ MS法：AFB1、ZEA具體參考標(biāo)準(zhǔn) NY/T 2071-2011，DON參考標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3136-2011。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)為100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒度2.4μm或類似色譜柱；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相、梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 液相色譜儀的梯度洗脫條件參數(shù)

1.5 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)進(jìn)行的掃描模式；毛細(xì)管電壓：正模式（4000 V）；負(fù)模式（3500 V）；干燥氣流速：13 L/min；干燥氣溫度：350℃；霧化氣壓力：40 psi。

1.6 限量標(biāo)準(zhǔn) 國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)：AFB1根據(jù)GB 13078-2001飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) （AFB1≤10μg/kg），ZEA參考 GB 13078.2-2006飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（ZEA≤100μg/kg），DON參考GB 13078.3-2007飼料中嘔吐毒素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（DON≤1000μg/kg）。當(dāng)霉菌毒素含量大于或等于80%限量時(shí)，該樣品認(rèn)定為高含量樣品；當(dāng)霉菌毒素含量低于50%限量時(shí)，該樣品認(rèn)定為低含量樣品；含量位于兩者之間的樣品為中含量樣品。

1.7 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行二樣本配對(duì)T檢驗(yàn)。其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢測(cè)方法間AFB1的檢測(cè)結(jié)果比較 由表2可看出，ELISA法檢測(cè)出飼料樣品中AFB1超標(biāo)率為18.18%，高于UHPLC法和HPLC-MS/MS法（15.15%和12.12%），最大值也高于另外2種方法的檢測(cè)結(jié)果。AFB1低含量的樣品三種檢測(cè)方法之間差異不顯著（P＞0.05），但對(duì)于中含量和限量值80%以上的樣品，ELISA法檢測(cè)結(jié)果均顯著或極顯著高于其他兩種檢測(cè)方法（P＜0.01）。從整體來(lái)看，ELISA法檢測(cè)樣品的總體平均值極顯著高于UHPLC法（P＜0.01），但與HPLC-MS/MS法之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同檢測(cè)方法下仔豬飼料中AFB1的結(jié)果μg/kg

兩種檢測(cè)方法僅在檢測(cè)ELISA結(jié)果為限量值 80%以上的樣品時(shí)，UHPLC法顯著高于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），其余情況兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著 （P＞0.05），但絕對(duì)數(shù)值HPLC-MS/MS法高于UHPLC法，特別是低含量樣品，HPLC-MS/MS法結(jié)果為UHPLC法的6倍。

2.2 不同檢測(cè)方法間ZEA檢測(cè)結(jié)果的比較 由表3可看出，UHPLC法與HPLC-MS/MS法檢測(cè)超標(biāo)樣品超標(biāo)率均為39.39%，低于ELISA法（42.42%），最高值也同樣低于ELISA法。

表3 不同檢測(cè)方法下仔豬飼料中ZEA的結(jié)果μg/kg

ELISA法檢測(cè)ZEA低含量和中含量的樣品時(shí)，其結(jié)果接近UHPLC和HPLC-MS/MS法的兩倍，但由于標(biāo)準(zhǔn)差較大，三種方法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；檢測(cè)高含量樣品時(shí)，ELISA法顯著高于UHPLC法和HPLC-MS/MS測(cè)定方法（P＜ 0.05）。但無(wú)論樣品中ZEA含量多少，兩種檢測(cè)方法之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同檢測(cè)方法間DON檢測(cè)結(jié)果的比較由表4可看出，ELISA法檢測(cè)DON的超標(biāo)率低于UHPLC法和HPLC-MS/MS法，分別為33.33%、36.36%和36.36%，且最高值僅為兩種方法的50%左右。

表4 不同檢測(cè)方法下仔豬飼料中DON的結(jié)果μg/kg

從總體平均值來(lái)看，三種方法檢測(cè)仔豬配合飼料中DON含量時(shí)差異不顯著 （P＞0.05）。但ELISA法檢測(cè)值為低含量的樣品，其ELISA法檢出結(jié)果顯著高于UHPLC法和HPLC-MS/ MS法（P＜0.05）；中含量樣品檢出結(jié)果顯著高于HPLC-MS/MS法 （P＜0.05），檢測(cè)限量值80%以上的樣品結(jié)果顯著低于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），兩種方法在檢測(cè)DON時(shí)差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

在實(shí)際生產(chǎn)中，采用UHPLC儀器檢測(cè)霉菌毒素成本太高，ELISA試劑盒法又受溫度、試劑盒品牌、酶標(biāo)儀靈敏度等條件影響，假陽(yáng)性率較高，可重復(fù)性差。這兩類方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，尋找一種相互彌補(bǔ)、穩(wěn)定快捷又價(jià)格低廉的檢測(cè)模式是檢測(cè)部門和飼料廠的共同目標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)ELISA法測(cè)定AFB1、ZEA的平均值均顯著高于UHPLC法，這和柳潔等（2005）在檢測(cè)糧油食品中AFB1含量時(shí)的結(jié)果一致。ELISA法檢測(cè)低含量的AFB1樣品時(shí)，三種方法檢測(cè)結(jié)果一致，陳建偉（2012）研究也認(rèn)為HPLC法和 ELISA法測(cè)定玉米中 AFB1含量在0.2～200μg/mL時(shí)，兩種方法相當(dāng)。樣品中毒素的濃度是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素之一。當(dāng)樣品中AFB1含量較高時(shí)，ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯著高于其他方法，這可能與ELISA法檢測(cè)原理有關(guān)。范素芳等（2011）認(rèn)為檢測(cè)玉米等糧食中AFB1的含量時(shí)，HPLC法的精密度和靈敏度都弱于HPLC-MS/MS法。本研究也發(fā)現(xiàn)兩種儀器檢測(cè)方法在檢測(cè)低含量和中含量樣品時(shí)，UHPLC法檢測(cè)結(jié)果低于HPLC-MS/MS法。而當(dāng)樣品含量較高時(shí)，UHPLC法檢測(cè)結(jié)果高于HPLC-MS/MS法。楊水艷等（2015）認(rèn)為，在使用HPLC-MS/MS法測(cè)定AFB1時(shí)，當(dāng)樣品中AFB1含量較高時(shí)，會(huì)降低其回收率，這也可能是導(dǎo)致上述結(jié)果的原因之一。

當(dāng)ELISA法檢測(cè)ZEA樣品時(shí)，其結(jié)果均顯著高于其他兩種測(cè)定方法，ELISA法檢測(cè)DON值為低含量和中含量的樣品時(shí)，ELISA法檢出結(jié)果也顯著高于UHPLC法和HPLC-MS/MS法，這與佘容（2015）和賈衛(wèi)昌（2015）等人的研究結(jié)果一致。ELISA法檢測(cè)高含量DON的樣品時(shí)，檢測(cè)結(jié)果卻顯著低于其他兩種方法，這與佘容等（2015）研究結(jié)果相反，原因可能與選擇的試劑盒差異有關(guān)，試劑盒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)的假陽(yáng)性也可能是原因之一 。陳玲（2006）和古莉（2015）等人對(duì)造成ELISA試劑盒假陽(yáng)性和不穩(wěn)定的因素進(jìn)行了研究，大致歸納為以下幾點(diǎn)：（1）飼料樣品溶解液的pH值。為防止仔豬腹瀉與促消化，一般添加的酸含量較高，而極端的酸堿環(huán)境可影響酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溶解液pH低于5.0時(shí)，酶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆性變化，導(dǎo)致后續(xù)酶聯(lián)反應(yīng)受影響，出現(xiàn)假陽(yáng)性。（2）飼料中的微量元素含量過(guò)高時(shí)，能夠破壞酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同樣影響底物的顏色反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。（3）飼料中的脂肪可能包裹抗體，影響抗原-抗體的特異性結(jié)合，反應(yīng)的終止時(shí)間受干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性。但值得注意的是，試劑盒檢測(cè)值并不一定都比上機(jī)檢測(cè)值高。說(shuō)明試劑盒在檢測(cè)霉菌毒素含量時(shí)，穩(wěn)定性不及色譜法和質(zhì)譜法。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，三種檢測(cè)方法對(duì)DON的檢測(cè)結(jié)果差異不顯著，出于成本與快速檢測(cè)結(jié)果考慮，DON更適合使用ELISA試劑盒檢測(cè)。在檢測(cè)AFB1和 ZEA時(shí)，ELISA試劑盒結(jié)果顯著高于UHPLC法與HPLC-MS/MS法，ELISA試劑盒進(jìn)行AFB1和ZEA檢測(cè)時(shí)只適合用作初篩。在采用儀器對(duì)AFB1進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，低含量樣品更宜采用HPLC-MS/MS法；其他含量的樣品出于成本考慮可選擇UHPLC法。對(duì)DON和ZEA結(jié)果確認(rèn)時(shí)，也可選擇較經(jīng)濟(jì)的UHPLC法。

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The study was conducted to investigate the difference of three differentmethods to detect concentrations of mycotoxins，aims to give references aboutmycotoxins detection.A total of 33 piglet dietswere selected to detectmycotoxins aflatoxins B1（AFB1），zearalenone（ZEA）and deoxynivalenol（DON）concentrationswith differentmethods including ELISA，ultra performance liquid chromatography（UHPLC）and liquid chromatographmass spectrometermass spectrometer（HPLCMS/MS）.The over standard rate of ELISA method on detection of AFB1，ZEA and DON was same with UHPLC and HPLCMS/MSmethods，and the ELISA could be the preliminary screeningmethod.When the concentration of AFB1in piglet feed was 80%higher than limited value with themethod of ELISA，the UHPLC detected AFB1concentration was higher than that of HPLC-MS/MS（P＜0.05）.While there were no significant difference in UHPLC and HPLC-MS/MS on concentrations of AFB1，ZEA and DON on other samples（P＞0.05）.Itwas indicated that ELISA could be the preliminary screening method to detect themycotoxins concentrations.HPLC-MS/MS could be used to verify the results of ELISA method with lower AFB1concentration，while others were verified by UHPLC method.UHPLC could be used to verify the results of ELISA on concentration of DON and ZEA.

ELISA kits；UHPLC；HPLC-MS/MS；piglet feed；mycotoxins

S816.17

A

1004-3314（2017）04-0027-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170407

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（CX2015SZ087）

*通訊作者