王云，吳雪，李晶，柏青楊，趙治明

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉頭頸外科，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 病理實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

臨床研究·論著

扁桃體惡性腫瘤中microRNA-21和98的表達(dá)及臨床意義*

王云1，吳雪1，李晶1，柏青楊2，趙治明1

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉頭頸外科，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 病理實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.011

目的初步探討m i croR N A-21（m i R N A-21）和m i R N A-98在扁桃體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用和臨床意義。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)53例扁桃體惡性腫瘤組織，50例扁桃體炎癥組織及20例正常組織中m i R N A-21和m i R N A-98的表達(dá)水平，并分析其在不同臨床病理指標(biāo)下的表達(dá)。結(jié)果m i R N A-21在扁桃體惡性腫瘤組織中的表達(dá)量高于扁桃體炎癥組織及正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。惡性腫瘤組織中m i R N A-21的表達(dá)量與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與病理分級(jí)無(wú)關(guān)。m i R N A-98在扁桃體惡性腫瘤組織中的表達(dá)量低于扁桃體炎癥組織及正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論扁桃體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能與m i R N A-21和m i R N A-98的表達(dá)密切相關(guān)。

m i R N A-21；m i R N A-98；扁桃體惡性腫瘤；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

M i croRNA（m i RNA）是近年來倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的研究熱點(diǎn)。其是一類普遍存在動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼小分子RNA，通過調(diào)節(jié)靶m RNA的降解或翻譯抑制，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著類似于癌基因或抑癌基因的作用[1-3]。隨著腫瘤分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展被證實(shí)與m i RNA的表達(dá)異常有關(guān)，尤其頭頸部惡性腫瘤組織中m i RNA擁有自己獨(dú)特的表達(dá)特征、生物標(biāo)記及其靶基因[4-6]，但m i RNA在扁桃體惡性腫瘤中的有關(guān)研究在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月-2015年11月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院53例扁桃體惡性腫瘤組織（其中41例為鱗狀細(xì)胞癌，9例為淋巴肉瘤，3例為腺癌）、50例扁桃體炎癥組織及20例咽部正常組織的石蠟標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組病例臨床資料完整，術(shù)前未接受放化療和激素治療。惡性腫瘤組織中男性49例，女性4例；年齡35～78歲，平均59歲。病理分級(jí)高分化例18，中分化例14，低分化例21。TNM分期（UICC2002）：Ⅰ期8例，Ⅱ期23例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例。實(shí)驗(yàn)組伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例。

1.2 材料與試劑

試劑Tri zol（美國(guó)i nvi t rogen公司），焦碳酸二乙酯處理水（上?；鶢栴D生物科技有限公司），氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、液氮、蒸餾水等（北京國(guó)藥集團(tuán)有限公司），SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)（pol ym erase chai n react i on，PCR）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Therm o公司），RNaseⅠ（立陶宛Ferm ent as公司），PCR引物（上海劍鈍生物科技有限公司），Real-t i m e檢測(cè)儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)：ABI-7300）。所有的試劑購(gòu)回來后按說明書保存。RNA提取過程中所需的離心管、槍頭等耗材經(jīng)過0.1%焦碳酸二乙酯水浸泡過夜，121℃滅菌30 m i n，烘干后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR：嚴(yán)格按照分離試劑盒操作說明書提取扁桃體惡性腫瘤組織、扁桃體炎癥組織及正常組織中總m i RNA。應(yīng)用m i RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用m i RNA檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)分析不同組織中m i RNA-21和m i RNA-98的表達(dá)水平[7]。循環(huán)閾值（Ct）比較法分析各組織中m i RNA的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[8-9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的質(zhì)量和純度

總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外線下觀察到3條帶：2條明亮的帶分別對(duì)應(yīng)于28 S和18S RNA，暗一點(diǎn)的帶則對(duì)應(yīng)于5 S RNA?？俁NA經(jīng)過電子核酸分光光度計(jì)測(cè)定，OD260/OD280比值為1.8～2.0，表明所提取的總RNA樣品較純，而且沒有降解，可用于m i RNA表達(dá)的檢測(cè)。見圖1。

圖1 總RNA凝膠電泳

2.2 miRNA-21和miRNA-98在扁桃體惡性腫瘤的相對(duì)表達(dá)量

用特異引物對(duì)m i RNA-21和m i RNA-98進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以Let-7a作為內(nèi)參，m i RNA-21、m i RNA-98和Let-7a的熔解曲線均為單峰曲線，產(chǎn)物單一，顯示引物特異性比較好，無(wú)特異性擴(kuò)增和引物二聚體干擾。見圖2。

圖2 miRNA-21、miRNA-98及Let-7a的熔解曲線

m i RNA-21、m i RNA-98及Let-7a擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線中可見明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增前期、對(duì)數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期，說明PCR產(chǎn)物豐富，引物敏感性較高。見圖3。

圖3 miRNA-21、miRNA-98及Let-7a的擴(kuò)增曲線

3組m i RNA-21、m i RNA-98比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與正常組織和炎癥組織比較，惡性腫瘤組織中m i RNA-21的表達(dá)量升高，而m i RNA-98降低。兩兩比較中，惡性腫瘤組織中m i RNA-21表達(dá)量與炎癥組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=48.481，P=0.000），惡性腫瘤組織中的m i RNA-21的表達(dá)量與正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 38.742，P=0.000）。炎癥組織與正常組織m i RNA-21的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.302，P= 0.023）。m i RNA-98在扁桃體惡性腫瘤組織中的表達(dá)量與扁桃體炎癥組織、正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。惡性腫瘤組織與炎癥組織m i RNA-98比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.978，P=0.000）。惡性腫瘤組織與正常組織m i RNA-98表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.791，P=0.000）。炎癥組織與正常組織m i RNA-98表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.479，P=0.142）。見表1。

2.3 miRNA-21表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

m i RNA-21在扁桃體惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，其與患者的性別、年齡及腫瘤的病理分級(jí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。惡性腫瘤組織中，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期m i RNA-21的表達(dá)量高于Ⅰ、Ⅱ期，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組m i RNA-21的表達(dá)量亦高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。見表2。

表1 不同組織中miRNA-21和miRNA-98的相對(duì)表達(dá)水平 （±s）

表1 不同組織中miRNA-21和miRNA-98的相對(duì)表達(dá)水平 （±s）

注：?與惡性腫瘤組織比較，P＜0.05

組別m i RNA-98惡性腫瘤組織（n=53） 1.975±0.145 0.814±0.096炎癥組織（n=50） 0.892±0.073? 1.914±0.182?正常組織（n=20） 0.823±0.099? 1.858±0.137?F值 1431.032 865.930 P值 0.000 0.000m i RNA-21

表2 臨床病理特征與miRNA-21表達(dá)水平的關(guān)系

3 討論

m i RNA對(duì)機(jī)體非常重要，機(jī)體需要用精密的調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)節(jié)m i RNA。機(jī)體可以通過幾個(gè)m i RNA的精細(xì)組合來調(diào)控某個(gè)特定基因的表達(dá)，也可以通過1個(gè)m i RNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，從而使機(jī)體處于一個(gè)調(diào)節(jié)有序的狀態(tài)。而m i RNA表達(dá)異常則可能會(huì)引起疾病包括惡性腫瘤的發(fā)生[10-12]。惡性腫瘤組織中的m i RNA也具有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性，多數(shù)腫瘤組織中異常表達(dá)的m i RNA同樣能在外周血中檢測(cè)到[13-14]，而且血清中的m i RNA能夠耐受反復(fù)的凍融、酸堿，以及DNA酶的處理。這些特性表明，m i RNA可以作為理想的腫瘤生物學(xué)靶點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用于腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估及治療[15-17]。本實(shí)驗(yàn)中，m i RNA-21和m i RNA-98在扁桃體惡性腫瘤組織、扁桃體炎癥組織和正常組織中的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。惡性腫瘤組織中m i RNA-21的表達(dá)量升高，臨床分期中Ⅲ、Ⅳ期m i RNA-21的表達(dá)水平高于Ⅰ、Ⅱ期，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組m i RNA-21的表達(dá)水平高于非轉(zhuǎn)移組，提示m i RNA-21的高表達(dá)可能與扁桃體惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而m i RNA-98在扁桃體惡性腫瘤組織的表達(dá)量與炎癥組織和正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示m i RNA-98可能在扁桃體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的功能。實(shí)驗(yàn)初步證明，m i RNA-21和m i RNA-98參與扁桃體惡性腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的調(diào)控，可能成為扁桃體惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)志。

綜上所述，m i RNA的表達(dá)異常可能與扁桃體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，而臨床上侵襲和轉(zhuǎn)移正是判斷扁桃體癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)[18]，因此對(duì)m i RNA進(jìn)行深入、廣泛的研究，了解扁桃體惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，可為臨床設(shè)計(jì)合理可行的治療方案，并可為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的干預(yù)性治療提供理論依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Expressions of microRNA-21 and microRNA-98 in malignant tumors of tonsils and clinical significance*

Yun Wang1,Xue Wu1,Jing Li1,Qing-yang Bai2,Zhi-ming Zhao1
(1.Department of Otorhinolaryngoloy,the Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;2.Pathology Laboratory, Qiqihar Medical College,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China)

ObjectiveTo investigate the role and clinical significance of the expressions of microRNA-21 (miRNA-21)and microRNA-98 (miRNA-98)in development and progression of malignant tonsilar tumors.MethodsThe expressions of miRNA-21 and miRNA-98 were detected by qRT-PCR in the 53 specimens of tonsilar neoplasms and 50 specimens of inflammatory tonsilar tissues and 20 specimens of normal muscosa. The expressions of miRNA-21 and miRNA-98 in the tonsilar neoplasms were analyzed with different clinicopathological parameters.ResultsThe expression of miRNA-21 in the malignant tonsilar tumors was significantly higher than that in the inflammatory tonsilar tissues and normal muscosa (P＜0.05).There were positive correlations between miRNA-21 expression and both TNM staging and lymph node metastasis;but not pathological grade.The expression of miRNA-98 in the malignant tonsilar neoplasms was significantly lower than that in the inflammatory tonsilar tissues and normal muscosa (P＜0.05).ConclusionsThe expressions of miRNA-21 and miRNA-98 may be correlated with the development and progression of malignant tonsilar neoplasms.

miRNA-21;miRNA-98;malignant tonsilar neoplasm;lymph node metastasis

1005-8982（2017）03-0055-04

R 739.64

A

2016-03-28

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研基金（No：QY2015L-06）

趙治明，E-m ai l：yuenhao2001@163.com；Tel：18646632303