張媛媛+張玥莉

摘 要 目的： 探索消除丹參多酚酸鹽抑菌活性的適宜方法，并建立丹參多酚酸鹽微生物限度檢查方法。 方法： 參照2015年版《中國(guó)藥典》四部微生物限度相關(guān)規(guī)定，分別采用薄膜濾過(guò)法、中和法、稀釋法去除或滅活丹參多酚酸鹽中的抗菌活性。 結(jié)果：采用薄膜過(guò)濾法，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜可將抑菌成分去除，該方法可為含中藥抑菌成分藥物微生物限度檢查方法的建立提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 丹參多酚酸鹽 微生物限度 薄膜過(guò)濾法

中圖分類號(hào)：R927.11； R286 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）03-0072-03

Establishment of a method for microbial limit test of salvianolate

ZHANG Yuanyuan1*， ZHANG Yueli2（1. Shanghai Lvgushengmingyuan Pharmaceutical Co. Ltd.； 2. Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit test and the elimination of the antimicrobial activity in the raw materials of salvianolate. Methods： A method for removing or eliminating the antibacterial activity in the raw materials of salvianolate was tested based on the membrane filtration， neutralization and dilution methods recorded in the related regulations of Chinese Pharmacopoeia （2015 edition， Volume Ⅳ）. Results： The antibacterial active component could be removed by washing the membrane for filtration with pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone buffer， which can provide a reference for microbial limit tests of traditional Chinese medicine containing antimicrobial active components.

KEy WORDS salvianolate； microbial limit test； membrane filtration

丹參多酚酸鹽是以丹參為原料，經(jīng)提取、分離、純化等工序制備出的原料藥，其主要成分為丹酚酸B。研究表明，丹酚酸B具有抗腦及心肌缺血、調(diào)節(jié)血脂代謝等作用，對(duì)冠心病、冠心病穩(wěn)定型心絞痛等疾病療效顯著[1-4]。丹參多酚酸鹽作為一種植物多酚物質(zhì)，具有廣譜的殺菌作用[5-7]，故用常規(guī)方法進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，從而影響檢查結(jié)果。藥品中微生物污染的控制是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，2015版《中國(guó)藥典》四部中提到，當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行處理，以消除供試品的抑菌活性，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗菌活性的去除是否徹底，再依法檢查[8]。目前常用的方法有培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、靜置法、中和劑法等，其中，薄膜過(guò)濾法是液體類制劑和抑菌作用較強(qiáng)的水溶性藥品如抗生素類及各種滴眼、鼻、耳制劑及藥酒等進(jìn)行微生物限度試驗(yàn)的首選方法。但藥典對(duì)其檢查的具體操作并未明確敘述[9-11]。本研究主要探索消除丹參多酚酸鹽抑菌活性的適宜方法，并建立丹參多酚酸鹽微生物限度的檢查方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）及pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)分別為151130、151223、150821、150210及151225）；氯化鈉（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20150502）；金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉。（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：CMCC（B）26003-5a28-1、CMCC（B）10104-2a20-1、CMCC（B）63501-2a21-1、CMCC（F）98001-2a14、CMCC（F）98003-201507），丹參多酚酸鹽（上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：150601、150602、150603）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YP1002N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），PHS-3C酸度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司），BSC1000ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），Talboys渦旋混合器（Henry Troernner，LLc），YX490D電動(dòng)吸引器（上海醫(yī)療器械公司醫(yī)用吸引器廠），spx-250BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱和MJ-160BS-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械有限公司），XK97-A菌落計(jì)數(shù)器（杭州齊威儀器有限公司），YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌液的制備

取經(jīng)培養(yǎng)的銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌TSB新鮮培養(yǎng)物及白色假絲酵母SDB新鮮培養(yǎng)物按照2015版中國(guó)藥典四部有關(guān)內(nèi)容培養(yǎng)備用。

1.3.2 供試液的制備

取丹參多酚酸鹽供試品10 g，加pH 7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制得供試液A。另取丹參多酚酸鹽供試品10 g，加含3%（v/v）聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分散均勻，調(diào)節(jié)pH至7.02，然后加稀釋液至100 ml，混勻，制得供試液B。

1.3.3 抗菌活性的去除或滅活方法

1）稀釋法 ①試驗(yàn)組：取制備好的供試液A，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使含菌量不大于100 cfu/ml，取1 ml菌液，等量分注于5個(gè)無(wú)菌平皿，立即傾注20 ml相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，凝固后于規(guī)定溫度下倒置培養(yǎng)48～72 h，計(jì)數(shù)。②供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，用稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。③菌液對(duì)照組：取稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌并進(jìn)行回收試驗(yàn)。④陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液同試驗(yàn)組操作，但稀釋液中不加入菌液。

2）中和劑法 增加稀釋劑對(duì)照組：取含3%（v/v）聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌并進(jìn)行回收試驗(yàn)。其余同稀釋法。

3）薄膜過(guò)濾法 試驗(yàn)組：取供試液A 9.9 ml，加入0.1 ml含菌量不大于100 cfu的菌液，混勻后，注入濾膜經(jīng)潤(rùn)洗的開(kāi)放式濾器中，加入100 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，全量通過(guò)孔徑0.45 μm混合纖維素膜后，再加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 ml沖洗，取出濾膜，菌面朝上貼于培養(yǎng)基上。需氧菌用TSA培養(yǎng)基，在30～35 ℃下培養(yǎng)48～72 h。霉菌和酵母菌用SDB培養(yǎng)基，在20～25 ℃下培養(yǎng)48～72 h，計(jì)數(shù)。各對(duì)照組同上。

1.3.4 計(jì)算公式

試驗(yàn)組比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

稀釋劑對(duì)照組比值=（稀釋劑對(duì)照組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

試驗(yàn)組比值和稀釋劑對(duì)照組比值都應(yīng)在0.5～2.0范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

1）稀釋法 銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率分別為0.6和0.5，剛剛達(dá)到要求；金黃色葡萄球菌比值（回收率）為0，不符合要求（表1），因此并未繼續(xù)進(jìn)行白色假絲酵母和黑曲霉的測(cè)定。這些結(jié)果表明，稀釋法并不能有效去除丹參多酚酸鹽中的抑菌活性成分。

2）中和劑法 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均不能達(dá)到要求（表2），可能選擇的中和劑種類不正確，無(wú)法中和丹參多酚酸鹽中的抑菌活性成分。

3）薄膜過(guò)濾法 三次驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)菌的回收率均能達(dá)到藥典要求，且試驗(yàn)組與菌液對(duì)照組的菌落形態(tài)一致，所以在試驗(yàn)沖洗量下，薄膜過(guò)濾法可以有效去除藥品中抑菌活性成分對(duì)檢測(cè)的干擾（表3、4），因此可用該法測(cè)定丹參多酚酸鹽中的需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)。

3 討論

微生物限度檢查中多種干擾因素會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、加菌量等，都需要格外注意，以最大限度地減少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾[12-13]。通過(guò)本次試驗(yàn)，成功摸索出了含有抑菌活性成分的丹參多酚酸鹽的微生物限度檢測(cè)方法—薄膜過(guò)濾法，同時(shí)為含有抑菌活性藥品微生物限度檢測(cè)方法的建立提供參考依據(jù)。薄膜過(guò)濾法可以把外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，因此該方法更為科學(xué)、客觀、公正，能夠全面反映樣品的染菌情況[14-15]。但是該方法操作較為繁瑣，而本試驗(yàn)中采用中和劑法又未能獲得如期結(jié)果，其原因可能是沒(méi)有找到合適的中和劑，所以，在以后的試驗(yàn)中可繼續(xù)探尋是否有更合適的、能有效中和丹參多酚酸鹽中的抑菌活性成分的中和劑。

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