賈國(guó)慧+鄭建飛

摘 要 目的：建立丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液包封率的分析方法。方法：利用超濾法分離微乳和游離藥物，采用Agilent的XDB-C18作為色譜分離柱、乙腈-水（7∶3）為流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm、柱溫25 ℃、流速1.0 ml / min和進(jìn)樣量5 μl進(jìn)行色譜分析。結(jié)果：本方法重復(fù)性考察的RSD為1.14%。日間精密度考察RSD為1.25%。結(jié)論：所建立的包封率定量方法，簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，可作為工藝篩選過(guò)程中靈敏、高效、有區(qū)分力的監(jiān)測(cè)方法。

關(guān)鍵詞 包封率 丙泊酚 微乳 超濾

中圖分類(lèi)號(hào)：R944.17 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）03-0069-03

Establishment of a method for the determination of propofol entrapment efficiency in a medium and long chain of fat emulsion injection

JIA Guohui*， ZHENG Jianfei

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of propofol entrapment efficiency in a medium and long chain of fat emulsion injection. Methods： The microemulsion and free propofol were separated by ultrafiltration and the high performance liquid chromatography was carried out on an Agilent XDB-C18 column using acetonitrile-water （7：3） as a mobile phase at flow rate of 1.0 ml/min， column temperature 25 ℃ and detective wave length of 275 nm. Results： The RSD for repeatability and inter-day precision was 1.14% and 1.25%. Conclusion： This method is simple， steady and reliable and can be used for the determination of propofol entrapment efficiency in a fat emulsion.

KEy WORDS entrapment efficiency； propofol； microemusion； ultrafiltration

丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液為我公司開(kāi)發(fā)的脂肪乳制劑，原研為德國(guó)費(fèi)森尤斯卡比（Fresenius Kabi）公司，其產(chǎn)品2007年在我國(guó)上市，商品名竟安，為靜脈注射用麻醉劑。制劑開(kāi)發(fā)中為了獲得與原研一致的藥效、安全性及制劑特性，我們選擇乳劑的粒徑、粒徑分布、包封率、外觀狀態(tài)作為考察指標(biāo)來(lái)篩選處方。在這些指標(biāo)中，反映藥物包封程度的包封率是微乳注射劑重要的質(zhì)量指標(biāo)，其檢測(cè)方法的建立也是研究工作中的難點(diǎn)。在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[1-14]，我們嘗試了透析法[4-6]、葡聚糖凝膠法[4-7]等方案，均未成功。本研究基于丙泊酚微乳溶液中被包封藥物與游離藥物粒徑的區(qū)別，建立了超濾離心檢測(cè)藥物包封率的方法，經(jīng)實(shí)踐與驗(yàn)證，所建立的方法操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)可靠，區(qū)分度好。

1 材料與方法

1.1 材料

安捷倫1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；梅特勒XP56型百萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒）；Sigma 3K15離心機(jī)（德國(guó)希格瑪）；Millipore Amicon Ultra-4 Ultracel-100k（過(guò)濾體積4 ml，NMWL：100 kDal）超濾離心管（德國(guó)密理博）；丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（批號(hào)：20090717-1、100804-5S、100804-10S、100804-15S，公司自制）；費(fèi)森尤斯卡比（商品名竟安，批號(hào)：16DC0082）；丙泊酚長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（商品名力蒙欣，批號(hào)：0808261，西安立邦公司）；工作對(duì)照品：丙泊酚原料（Product-No：49340790792， NDC 12502-4934-0）。

1.2 高效液相色譜檢測(cè)方法

1）色譜條件 采用Agilent的XDB-C18（4.6 mm×150mm， 5 μm）作為色譜分離柱；乙腈-水（7∶3）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm、柱溫25 ℃、流速1.0 ml /min、進(jìn)樣量5 μl。

2）樣品制備方法 將超濾離心管（Amicon ultra-4）用50%乙醇水溶液浸泡過(guò)夜，待用。取本品0.2 ml于超濾離心管中，加水1.8 ml，20 ℃離心25 min（3 400 g）。下層濾液棄去，上層加水2 ml，機(jī)械振蕩3 min。以相同條件再次離心25 min，上層液加水1 ml，機(jī)械振蕩3 min后移至10 ml容量瓶中，并用0.40 ml水清洗2次，清洗液全部轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，以四氫呋喃-異丙醇（5∶3）混合液定容。照色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算濃度C。另取本品0.2 ml于10 ml容量瓶中，加四氫呋喃-異丙醇（5∶3）混合液溶解并定容，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算濃度C0。包封率（%） =C/C0×100%[14]。

2 結(jié)果

2.1 方法的建立與優(yōu)化

微乳為不穩(wěn)定體系，包封率測(cè)定比較困難，為建立切實(shí)可行的控制方法，我們嘗試了透析法、葡聚糖凝膠法、超速離心法[8-12]等，結(jié)果均不理想。最終，我們?cè)诔瑸V離心法[13]的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化，終于獲得了操作便利、具有區(qū)分力的檢測(cè)方法。

2.1.1 超濾管的選擇

本品屬于亞微乳范圍，包封藥物平均粒徑小于300 nm，而游離藥物為小分子?；谝陨闲再|(zhì)及樣品的處理量，我們選擇了Millipore Amicon Ultra-4 Ultracel-100k的超濾離心管，實(shí)踐證明所選用的超濾管可有效截留包封藥物且可操作性良好。

2.1.2 測(cè)定可行性的考察

基于微乳的特性，推測(cè)丙泊酚微乳溶液經(jīng)過(guò)超濾離心后，被包封的丙泊酚因?yàn)榱酱?，?huì)截留在離心管的膜上層，而游離的丙泊酚分子量小，會(huì)被甩到膜下層或被吸附到超濾膜上。

取125 μg/ml丙泊酚水溶液2 ml（即250 μg）于超濾管中。超濾離心后移出下層濾液（約2 ml）；上層加水2 ml，渦旋混合3 min。上下層液均取出100 μl于HPLC進(jìn)樣檢測(cè)。同法操作，離心3次。平行檢測(cè)2份，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1試驗(yàn)結(jié)果可知：①超濾膜可吸附大部分的游離丙泊酚，被吸附的游離丙泊酚解吸附量很?。?lt;1%）；②離心2次后，上層幾乎不殘留游離丙泊酚（<1%）；③鑒于包封率檢測(cè)為限度檢測(cè)，中國(guó)藥典微粒制劑指導(dǎo)原則要求大于80%即可[14]，小于1%的游離藥物殘留，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判定影響不大，因此，所設(shè)計(jì)的測(cè)試方法可行。

2.1.3 離心力的選擇

采用20 ℃，25 min條件下對(duì)離心力進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。

綜上，選擇離心條件為3 400 g、20 ℃、25 min，可防止離心后取出上層濾物的困難，又能保證游離丙泊酚基本被分離。

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性

考察前處理過(guò)程對(duì)檢測(cè)是否存在干擾。將超濾管采用50%的乙醇溶液浸泡1 h后，加水、空白微乳、樣品，按條件分別處理后，經(jīng)HPLC檢測(cè)，空白不干擾樣品的測(cè)定。

2.2.2 溶液穩(wěn)定性

考察對(duì)照品及樣品在配置溶液中的穩(wěn)定性。分別采用工作對(duì)照品及對(duì)照品加空白微乳配置約200 μg/ml的溶液，分別考察6～8個(gè)時(shí)間點(diǎn)至24 h，觀察丙泊酚、丙泊酚加空白微乳在樣品配置溶液（四氫呋喃-異丙醇5∶3）中的穩(wěn)定性。經(jīng)考察，它們RSD實(shí)測(cè)值均小于1%，符合穩(wěn)定性要求。

2.2.3 線性

取適量工作對(duì)照品置量瓶中，用四氫呋喃-異丙醇（5∶3）溶解并稀釋至刻度，制成1.971 mg/ml的溶液作為線性儲(chǔ)備液。精密量取線性儲(chǔ)備液0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 ml，分別置于10 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成線性濃度溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。得到線性方程y=0.085 7x–0.092 5 （r=1， n=5）。

2.2.4 重復(fù)性檢測(cè)

1）日內(nèi) 平行取6份樣品（批號(hào)：20090717-1），它們的包封率分別是92.8%、92.5%、93.7%、90.6%、91.8%和91.9%；RSD為1.14%。

2）日間 對(duì)供試品（批號(hào)：20090717-1）進(jìn)行包封率測(cè)定，連續(xù)3 d，每天平行檢測(cè)3份（表3）。

日內(nèi)與日間測(cè)定結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.3 多批樣品測(cè)定

采用我們所建立的方法，對(duì)多批自制及不同廠家市售樣品進(jìn)行了檢測(cè)（表4）。

上述結(jié)果表明，所建立的方法可有效檢測(cè)樣品的包封率并具有很好的區(qū)分力，為制劑的處方工藝研究提供了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，數(shù)據(jù)也表明自制丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液包封率與市售品竟安基本相同，符合要求，且丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳的包封率高于丙泊酚長(zhǎng)鏈脂肪乳（力蒙欣）。

3 討論

研究中我們發(fā)現(xiàn)，采用葡聚糖凝膠法及Sephadex G25 柱，雖經(jīng)填料徑高比、流動(dòng)相種類(lèi)與洗脫比例等條件的篩選，依然無(wú)法使游離與包封藥物有效分離，檢測(cè)結(jié)果不具區(qū)分力；在透析法中，經(jīng)18 h藥物濃度的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)游離藥物側(cè)的藥物濃度始終無(wú)法出現(xiàn)濃度平臺(tái)；而在超速離心法中，檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性很難把握。在這些研究的基礎(chǔ)上，最終，我們通過(guò)超濾離心法，建立了具有良好區(qū)分度的包封率檢測(cè)方法。我們推測(cè)多種方法未果的原因可能為微乳粒子的穩(wěn)定性所致。通常，在結(jié)構(gòu)上，微乳是較脂質(zhì)體更不穩(wěn)定的體系。游離與包封藥物始終處在動(dòng)態(tài)平衡中，缺少明確的區(qū)分界限。在超濾離心方法中，通過(guò)快速離心與超濾膜的物理分離，相比其他方法，較好地克服了溶劑或稀釋劑對(duì)微乳穩(wěn)定性的影響，同時(shí)通過(guò)超濾膜的快速物理阻隔，也避免了兩部分藥物進(jìn)一步互吸、互溶的問(wèn)題。

采用所建立的方法，我們通過(guò)對(duì)不同工藝樣品、不同來(lái)源市售樣品的考察，同時(shí)結(jié)合樣品粒徑、粒徑分布、外觀等指標(biāo)的綜合分析，證實(shí)了本方法的可靠性，從而為制劑工藝的篩選與優(yōu)化提供了重要的監(jiān)控手段。本研究因無(wú)法獲得完全包封的理想樣品，很難確知超濾膜是否對(duì)包封樣品存在吸附。超濾膜上下層游離藥物殘留檢測(cè)試驗(yàn)證明，膜本身存在對(duì)游離藥物的吸附，因此，無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)的回收率試驗(yàn)對(duì)方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。因此，我們通過(guò)設(shè)計(jì)游離藥物在膜上層的殘留檢測(cè)、樣品的重復(fù)性檢測(cè)和對(duì)不同樣品檢測(cè)的區(qū)分力等對(duì)方法的準(zhǔn)確度與可用性進(jìn)行了驗(yàn)證。

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