朱鳳 胡園??劉衡??肖懷 ??楊自忠 ?ふ院Ｈ? 張成桂 何苗

【摘要】目的：通過復制小鼠急性不完全性腦缺血模型，研究Ento-Ⅰa涂膜劑對腦缺血的保護作用。 方法：140只小鼠分為2批進行實驗，每批70只。將70只小鼠隨機分為7組，每組10只，分別為假手術組、Ento-Ⅰa涂膜劑組（3750mg·kg-1、1875mg·kg-1、938mg·kg-1）、生理鹽水模型組、基質模型組、尼莫地平組（18mg·kg-1，ig）。Ento-Ⅰa涂膜劑預防給藥7 d后，測定小鼠結扎雙側頸總動脈帶迷走神經后的存活時間及其腦組織SOD活性、MDA含量、EB含量。 結果：Ento-Ⅰa涂膜劑在劑量為1875 mg·kg-1時，可以明顯延長小鼠結扎雙側頸總動脈帶迷走神經后的存活時間（P<005），延長率為3955%；在劑量為3750mg·kg-1時效果最佳（P<001），小鼠存活時間的延長率為4515%，與陽性藥尼莫地平（18 mg·kg-1，延長率4396%）相當。與基質模型組比較，Ento-Ia涂膜劑1875、3750 mg·kg-1劑量組均可提高腦組織內SOD活性并能減少MDA含量（中劑量組，P<005；高劑量組P<001）；同時，Ento-Ia涂膜劑能顯著降低小鼠急性不全性腦缺血小鼠腦組織EB含量（P<005）。結論：Ento-Ia涂膜劑經皮給藥可對小鼠急性不完全性腦缺血誘發(fā)的腦損傷有明顯的保護作用，其機制可能通過干預腦缺血后腦組織的氧化應激及其保護血腦屏障有關。

【關鍵詞】Ento-Ia涂膜劑；經皮給藥；急性不完全性腦缺血；存活時間；腦保護

【中圖分類號】R74331【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）02-0047-05

The Protect of Ento-Ⅰa Plastic on Acute Incomplete Cerebral Ischemia by Mice

ZHU Feng1，2HU Yuan1，2LIU Heng1，2，3XIAO Huai1，2，3YANG Zizhong1，2，3

ZHAO Hairong1，2，3

ZHANG Chenggui1，2，3HE Miao1，2，3*

1Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Institute of Entomoceutics Research， Dali University， Dali 671000， China；2National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics， Dali 671000， China；3Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics， Dali University， Dali 671000， China

Abstract：Objective To investigote the protective effect of Ento-Ⅰa Plaster on acute mice incomplete cerebral ischemia. Methods 140 mice were divided into two batches to carry on the experiment， each batch 70. 70 rats were randomly divided into 7 groups， 10 in each group， the sham operation group， the Ento-Ⅰa coating group （3750mg·kg-1、1875mg·kg-1、938mg·kg-1）， the saline model group， the matrix model group， the nimodipine group （18 mg·kg-1， ig）. Ento-Ia plastic was given prophylactically for 5 days， establishment mice acute incomplete cerebral ischemia model by total bilateral carotid artery ligation in mice with vagus nerve， record survival time of mice after ischemia and the determination of mouse brain tissue SOD activity， MDA content and the content of Evans blueResults This research shows that Compared with the model group matrix， Ento-Ia plastic can significantly prolong the survival time of mice after ligation of bilateral common carotid artery with vagus nerve at a dose of 1875 mg·kg-1（P<005）， the extension rate was 3955%； At a dose of 13750 mg·kg-1， the effect was the best（P<001）， prolonged survival time of mice was 4515%， compared with the positive drug nimodipine （18mg·kg-1， the elongation rate of 4396%） Compared with the matrix model group， Ento-Ia plastic at the dose of 1875 and 3750mg·kg-1 dose group could increase the brain tissue SOD activity and reduce MDA content （middle dose group， P<005； high dose group P<001） At the same time， Ento-Ia plastic can significantly reduce the cerebral capillary permeability （P<005）， which is equivalent to the nimodipine group （P>005）. Conclusion Ento-Ⅰa plastic has obvious protective effect for transdermal delivery of mice with acute incomplete cerebral ischemia induced brain injury， its mechanism may be through the intervention of brain tissue of cerebral ischemia oxidative stress and protection of BBB.

Keywords：Ento-Ia Plastic； Transdermal Drug Delivery； Acute Incomplete Cerebral Ischemia； Survival Time； Cerebral Protection

卒中是人類致死和致殘的主要原因之一[1]，急性缺血性卒中（Acute Ischemic Stroke，AIS）約占全部卒中的80%。然而大多數(shù)情況下是非致死性卒中，長期殘疾構成人類的重大負擔[2]。AIS治療的關鍵在于盡早開通阻塞血管、挽救缺血半暗帶，然而，基于腦缺血的病理過程涉及復雜的時間和空間級聯(lián)反應[3]，目前有關缺血性腦血管疾病的臨床治療依然存在很多問題，因此開發(fā)保護缺血性腦損傷的藥物也同樣具有重要的理論意義和臨床價值[4]。同時，在急性腦卒中過程中的腦保護及神經保護作用對于發(fā)病機制的研究是一項重大挑戰(zhàn)[5-7]。Ento-Ia是Ento-Ⅰ的同源性物質，在現(xiàn)代應用中可治療中風偏癱后遺癥患者[8]，前期研究發(fā)現(xiàn)Ento-I具有防治腦血栓生成、恢復腦癱動物活動能力[9]、抗血小板聚集、減輕腦梗死面積[10]等作用，可用于制備防治心腦血管疾病創(chuàng)新生化藥物，用以預防和治療缺血性心腦血管等疾病，例如心梗、心血管血栓、腦血栓、腦梗、急/慢性腦卒中。本文通過采用小鼠雙側頸總動脈帶迷走神經結扎法觀察小鼠存活時間、小鼠腦組織超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的變化及通過測定腦組織伊文思藍（EB）含量，檢測小鼠的腦毛細血管通透性，以此初步評價Ento-Ia涂膜劑對小鼠急性不完全性腦缺血的保護作用，為臨床應用和新藥研發(fā)提供科學依據(jù)。

1材料與方法

11實驗動物與試劑動物：雄性昆明種小鼠140只（由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證編號：SCKX（滇）2011-0004），體重18～22 g。

試劑：尼莫地平組（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ22848）；川芎嗪（針劑，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號：121101A3）；Ento-Ⅰa涂膜劑（大理大學昆研院自制）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20141011）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140422）。

12實驗方法

121實驗分組及給藥實驗分為2批，每批70只小鼠，共140只。第一批用于測定Ento-Ia涂膜劑對小鼠急性不完全性腦缺血后的存活時間及腦缺血后小鼠腦組織中SOD、MDA含量的變化，第2批用于測定Ento-Ⅰa涂膜劑對急性不完全性腦缺血小鼠腦毛細血管通透性的影響。將70只小鼠平均分為7組，每組10只，分別是假手術組、生理鹽水模型組、基質模型組、尼莫地平組（18mg·kg-1，ig）；Ento-Ⅰa涂膜劑3750、1875、938mg·kg-1劑量組。實驗前將Ento-Ⅰa涂膜劑組及基質涂膜劑組用人用脫毛膏在小鼠太陽穴兩側部位進行脫毛，7組小鼠分別按照實驗分組及各組相應的給藥劑量預防給藥7d，其中生理鹽水對照組及尼莫地平組灌胃給藥；Ento-Ⅰa涂膜劑高、中、低劑量組及基質組按照相應的含藥量太陽穴涂抹給藥，30μL/只。

122Ento-Ia涂膜劑經皮給藥小鼠急性不完全性腦缺血后存活時間及小鼠腦組織中SOD、MDA含量的影響造模方法：將小鼠用乙醚在密閉的玻璃缸中進行淺麻醉，用小動物手術器械仔細分離出雙側頸總動脈，并在左側及右側頸總動脈帶迷走神經下穿過1根5-0號手術線，結扎兩側頸總動脈帶迷走神經造成小鼠急性不完全性腦缺血[11-12]。假手術組只分離雙側頸總動脈，不結扎。

記錄結扎雙側頸總動脈后各組小鼠的存活時間。待小鼠死亡后開顱取腦，去除嗅球、小腦和延髓，腦組織勻漿后離心取上清，置于-80℃保存，按照試劑盒說明書分別測定腦組織中MDA含量和SOD活性。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法按操作步驟進行，于532nm處測定吸光度；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，于550nm處測定吸光度，考馬斯亮藍法測定蛋白含量[13]。

123Ento-Ia涂膜劑經皮給藥急性不完全性腦缺血對小鼠腦毛細血管通透性的影響繪制標準曲線：將伊文思藍配制成系列濃度（039、078、156、312、624、1248、2496μg/mL），在分光光度計620 nm處測定吸光度（A）值。以濃度為橫坐標、吸光度（A）值為縱坐標，得回歸直線方程：Y=00892X-0005，R2=09975。

124小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量的測定分組及給藥方法同上，并按“122”項方法進行造模。末次給藥后1h，假手術組小鼠尾靜脈注射伊文思藍（50mg·kg-1），5min后分離雙側頸總動脈帶迷走神經，但不結扎，其余各組小鼠在結扎兩側頸總動脈帶迷走神經前5min尾靜脈注射伊文思藍（50mg·kg-1），2h后斷頭，小心剝取兩側大腦半球，稱濕重（去小腦、延髓），加入05%硫酸鈉溶液3mL與丙酮7mL勻漿，密封放置1h，3000rpm離心10min，取上清液，以丙酮︰05%硫酸（7∶3）混合液調零，620nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算出腦內伊文思藍的含量（μg/g腦濕重）。

2統(tǒng)計方法

計量資料以均數(shù)加減標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間均數(shù)的顯著性檢驗，并以LSD-t檢驗進行多重比較；計數(shù)資料以χ2檢驗及Fisher確切概率法進行統(tǒng)計分析。采用統(tǒng)計軟件SPSS 170進行數(shù)據(jù)處理與分析（α=005）。

3實驗結果

31Ento-Ia涂膜劑經皮給藥對小鼠結扎雙側頸總動脈帶迷走神經后存活時間的影響生理鹽水模型組與基質模型組比較，小鼠存活時間無統(tǒng)計學差異（P>005）；假手術組小鼠剝離頸總動脈和迷走神經，小鼠正常存活，說明手術操作對小鼠的存活無影響。與生理鹽水組比較，尼莫地平組（18 mg·kg-1）可以顯著延長小鼠急性不完全性缺血后的存活時間，其延長率為4396%；與基質模型組比較，Ento-Ⅰ涂膜劑不同劑量組均可以延長腦缺血小鼠的存活時間，Ento-Ia涂膜劑低劑量組延長率為2164%，中劑量組為3955%，高劑量組為4515%，藥效呈現(xiàn)一定的劑量關系。提示Ento-Ia通過經皮給藥途徑可以明顯延長小鼠急性不完全性缺血存活時間。見表1。

32Ento-Ia涂膜劑對腦缺血小鼠腦組織SOD活力、MDA含量的影響生理鹽水模型組與基質模型組比較，小鼠腦內SOD和MDA含量變化無統(tǒng)計學差異（P>005）；兩組模型組與假手術組相比，SOD活力均顯著性下降、MDA含量均顯著性升高（P<001），證明小鼠結扎頸總動脈造模形成的急性腦缺血，引發(fā)了機體SOD活力的迅速降低及MDA含量的迅速升高。與生理鹽水組比較，尼莫地平組可以顯著提高腦組織SOD活力、降低MDA含量（P<001）；與基質模型組比較，Ento-Ia涂膜劑3750、1875、938 mg·kg-1劑量組能升高SOD的活力、降低MDA的含量，結果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中Ento-Ia涂膜劑高劑量組最明顯（P<001），且與假手術組差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

33Ento-Ia涂膜劑對腦缺血小鼠腦毛細血管通透性的影響小鼠腦缺血后腦中伊文思藍的含量可表示腦毛細血管的通透性。與假手術組相比，模型組小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量明顯增高（P<001），說明小鼠急性非完全性腦缺血模型造模成功；與模型組比較，Ento-Ⅰa涂膜劑太陽穴給藥能顯著降低小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量（P<005）。實驗結果提示，Ento-Ⅰa涂膜劑太陽穴給藥可以顯著降低小鼠腦缺血后的腦毛細血管的通透性，從而具有強效的腦缺血保護作用。見表3。

4討論

41腦缺血的發(fā)病機制缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風”范疇，多起病較緩，靜態(tài)發(fā)病，大多清醒，無頭痛嘔吐等癥狀。中風主要是由脈絡閉阻、氣血逆亂和臟腑氣機失調等引起[14]。缺血性腦血管疾病的病因和缺血后腦損傷機制至今尚未完全闡明，而治療上又存在著臨床療效有限、時間窗窄及治療副作用大等一系列難題，針對這些難題尋找新的、更有效的治療方法就成為了亟待解決的科學問題[15]。而大腦對缺血極為敏感，短期腦缺血即能導致一系列的功能及代謝紊亂。腦缺血導致腦梗死后可能引發(fā)能量損耗[16]、酸中毒[17]、細胞內Ca2+超載[18]、興奮性氨基酸毒性作用[19]、氧化應激[19-20]和自由基損傷[25]、炎癥[21]和細胞凋亡[22]等繼發(fā)性腦損傷，這幾種因素之間相互作用、相互影響，構成復雜的調控網絡，形成惡性循環(huán)，造成一系列病理級聯(lián)反應，繼而導致病情加重[23]。

42腦缺血模型的制作及缺血后自由基的生成本實驗復制小鼠急性不完全性腦缺血損傷模型[10]，由于血流的突然阻斷，組織嚴重缺氧，微循環(huán)血流障礙，最終導致供血區(qū)腦組織異常、壞死，以此來模擬臨床急性腦缺血患病的過程。小鼠急性腦缺血后存活時間不符合正態(tài)分布，在結果處理中采用非參數(shù)檢驗的方式對其進行統(tǒng)計分析[24]。

另有研究表明，氧化應激是腦缺血再灌注后最早出現(xiàn)和最重要的損傷機制[25-27]。正常情況下，機體所產生的少量氧自由基，很快就會被體內的自由基清除系統(tǒng)迅速清除，不會造成細胞、組織及機體損傷。腦缺血再灌注時所產生的大量自由基，如果體內SOD等抗氧化酶的清除能力下降，將會導致氧自由基大量堆積，引發(fā)細胞膜的脂質過氧化，從而破壞膜的結構和功能。MDA是脂質過氧化終產物，可間接反映出機體受自由基攻擊的嚴重程度。本研究表明，Ento-Ⅰa可升高腦缺血后腦組織內SOD活力及明顯降低腦組織內MDA含量，即Ento-Ia可減輕腦缺血引起的脂質過氧化損傷。另外，實驗亦表明，Ento-Ia涂膜劑可顯著延長小鼠急性不完全性腦缺血的存活時間。

43血腦屏障對腦組織的保護作用Ento-Ia涂膜劑對腦缺血后腦組織的保護作用可能和其減輕血腦屏障（BBB）的損傷有關[10]。BBB是存在于血液和腦組織之間的一道屏障，對維持中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。伊文思藍為腦血管通透性指示劑，正常情況下不易通過血腦屏障，但血腦屏障受到破壞時，伊文思藍易于進入腦組織。本實驗應用伊文思藍為示蹤劑，通過測定各組小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量，觀察藥物對急性不完全性腦缺血小鼠斷頭后腦毛細血管通透的影響，進而評價其對腦缺氧動物的腦保護功效。

綜上所述，Ento-Ia涂膜劑可以有效延長小鼠雙側頸總動脈結扎后小鼠存活時間、升高SOD活性及降低MDA含量，并具有降低腦缺血損傷小鼠腦毛細血管通透性的作用。但是，本實驗只是通過小鼠急性不完全性腦缺血這一種模型來驗證Ento-Ia涂膜劑的藥效，并不能完全涵蓋腦缺血的臨床病因，關于Ento-Ia對不同原因所致腦缺血的保護作用及相應的作用機制，我們會在后期研究中繼續(xù)深入探討。

目前由Ento-Ia毒素制備的透皮吸收制劑治療腦缺血的藥效研究工作正在開展，前期研究表明Ento-Ia毒素可減少MCAO-I/R大鼠腦梗死面積，可能是恢復大鼠大腦皮質區(qū)血流。提示其可用于臨床治愈癱瘓、失語的中風病人，其機制可能與Ento-Ia毒素的抗凝、溶栓及其透過血腦屏障有關。因此下一步的工作是確定抗腦缺血的Ento-Ia毒素的組分及其抗腦缺血的機制。

致謝：云南省昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用工程實驗室長期致力于昆蟲生物藥物的研發(fā)，在昆蟲藥物治療心腦血管疾病的研究方面擁有豐富的經驗，本實驗的條件由工程實驗室藥理藥效學研究平臺提供，非常感謝實驗室老師對于本實驗的指導、同學對于本實驗的幫助。

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（編輯：梁志慶）