徐婷，徐國(guó)賓，b，賈淑芹，康曉征，張連海，季加孚

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所a.檢驗(yàn)科，b.分子診斷中心，c.胸部腫瘤外一科，d.胃腸中心，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142)

·專(zhuān)家論壇·

循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)在惡性腫瘤診治中的應(yīng)用進(jìn)展與問(wèn)題思考

徐婷a，徐國(guó)賓a，b，賈淑芹a，康曉征c，張連海b，d，季加孚b，d

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所a.檢驗(yàn)科，b.分子診斷中心，c.胸部腫瘤外一科，d.胃腸中心，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142)

腫瘤組織是檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因突變的理想標(biāo)本，獲得組織標(biāo)本的方式有內(nèi)鏡活檢、淋巴結(jié)活檢、手術(shù)切除等。對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期腫瘤患者，臨床很難獲得或難以獲得足量組織標(biāo)本用于基因檢測(cè)。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡釋放入血的DNA，其基因組信息與腫瘤組織一致。晚期腫瘤患者ctDNA是良好的組織替代品，可作為靶向藥物基因靶點(diǎn)檢測(cè)的補(bǔ)充。常見(jiàn)ctDNA檢測(cè)技術(shù)有突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS)、數(shù)字PCR(dPCR)、新一代測(cè)序(NGS)等。不同方法原理不同，靈敏度不同，一次可檢測(cè)的基因個(gè)數(shù)和位點(diǎn)也不同。該文對(duì)ctDNA檢測(cè)及其在腫瘤早期診斷、用藥指導(dǎo)、療效評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、預(yù)后等方面的研究作一簡(jiǎn)要概述，并闡述存在的問(wèn)題和一些思考。

循環(huán)腫瘤DNA；核酸擴(kuò)增技術(shù)；早期診斷；指導(dǎo)用藥；療效評(píng)價(jià)；復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)；預(yù)后

驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)是晚期腫瘤患者靶向藥物選擇的基礎(chǔ)，腫瘤組織是靶基因檢測(cè)的理想標(biāo)本。獲取組織標(biāo)本的常見(jiàn)方式包括內(nèi)鏡活檢、淋巴結(jié)活檢、手術(shù)切除等。多數(shù)晚期患者往往難以接受有創(chuàng)檢查，臨床很難獲得或難以獲得足夠量的腫瘤組織用于基因檢測(cè)[1]。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)作為組織學(xué)基因檢測(cè)的補(bǔ)充，在指導(dǎo)靶向用藥方面具有潛在價(jià)值，并在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、殘留與復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)等方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 ctDNA檢測(cè)方法和原理

生理或病理狀態(tài)下，細(xì)胞壞死或凋亡時(shí)細(xì)胞核內(nèi)或線(xiàn)粒體內(nèi)DNA會(huì)釋放到血液、胸腔積液、腦脊液、尿液、痰液或糞便中。細(xì)胞外游離 DNA(cell-free DNA，cfDNA)是細(xì)胞 DNA 降解產(chǎn)物，片段大小約150～200 bp[2]。ctDNA作為 cfDNA 的一類(lèi)，來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，可反映腫瘤的異質(zhì)性。血液中ctDNA半衰期為15 min至數(shù)小時(shí)[3]。人cfDNA 濃度多低于100 μg/L，平均約30 μg/L[4]；中晚期腫瘤患者cfDNA 濃度可高達(dá) 1 000 μg/L，平均約180 μg/L[5]。cfDNA中ctDNA占比較低。研究發(fā)現(xiàn)，中晚期腫瘤患者ctDNA占cfDNA的比例約為8%～10%，在腫瘤早期或治療緩解后可低至0.01%～1.7%[3, 6-7]。ctDNA檢測(cè)的主流方法有突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)、新一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)等，各方法檢測(cè)原理和靈敏度不同。低豐度ctDNA對(duì)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度要求很高。上述基于PCR技術(shù)的ctDNA檢測(cè)方法要求加入的cfDNA起始量為30～80 ng，各方法的靈敏度、特異性和通量各不相同。對(duì)于ARMS和dPCR，不同試劑盒間的檢測(cè)差異與ctDNA提取率、引物位置、探針修飾有關(guān)。對(duì)于基于PCR反應(yīng)的NGS，其檢測(cè)靈敏度除與樣本處理有關(guān)外，還與每一步反應(yīng)效率和測(cè)序深度有關(guān)。

1.1 ARMS ARMS技術(shù)利用探針或染料在實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)特異引物擴(kuò)增突變序列的檢測(cè)。探針?lè)ㄝ^染料法特異性好、應(yīng)用廣[8-9]。ARMS檢測(cè)特異性取決于引物特異性，1個(gè)反應(yīng)中加入多個(gè)特異引物，可實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增，檢測(cè)同一基因的多個(gè)突變。檢測(cè)血漿ctDNA的商品化ARMS試劑盒有人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變檢測(cè)試劑盒(廈門(mén)艾德公司)、cobas?EGFRMutation Test v2(美國(guó)Roche公司)、therascreenEGFRPlasma RGQ PCR(德國(guó)凱杰公司)。人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)29種EGFR熱點(diǎn)突變，靈敏度為1.0%[10]，已獲國(guó)家藥監(jiān)局(CFDA)臨床應(yīng)用批準(zhǔn)和歐盟ISO13485認(rèn)證。該公司開(kāi)發(fā)的新一代super ARMS試劑盒正在審批過(guò)程中，其靈敏度約為0.2%。cobas?EGFRMutation Test v2和therascreenEGFRPlasma RGQ PCR可檢測(cè)的EGFR位點(diǎn)分別為42和23種，靈敏度分別為0.5%和1%，這兩種試劑盒中EGFR19外顯子缺失突變(exon 19 deletion)和 21外顯子突變(L858R)的檢測(cè)已獲美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)和歐洲共同體體外診斷產(chǎn)品(CE-IVD)認(rèn)證。

Liu等[11]用人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)86例ⅢB-Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者組織和血漿EGFR突變，陽(yáng)性率分別為46.5%(40/86)和31.4%(27/86)；40例組織EGFR突變型患者中，27例患者血漿中檢測(cè)到EGFR突變，敏感性為67.5%；27例組織EGFR野生型患者血漿均未檢測(cè)到EGFR突變，特異性為100%；該試劑盒檢測(cè)血漿EGFR基因突變的敏感性較低，但特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高。有研究[12]顯示治療前組織EGFR突變豐度低于1%的患者較高于1%的患者使用表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)后的中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival，PFS)和總生存時(shí)間(overall survival，OS)更短。而治療前血漿中EGFR突變豐度低于0.04%的患者較高于0.04%的患者使用EGFR-TKI后的中位PFS更短[13]。

商品化ARMS試劑盒定性檢測(cè)EGFR的靈敏度為0.5%～1%，可用于組織EGFR檢測(cè)，但用于血漿EGFR檢測(cè)時(shí)需慎重。血漿EGFR突變豐度與患者預(yù)后的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究，而選擇高靈敏度ctDNA檢測(cè)技術(shù)是開(kāi)展這項(xiàng)研究的關(guān)鍵因素之一。

1.2 dPCR dPCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，分為DNA單分子化、PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析3部分。與ARMS檢測(cè)存在大量cfDNA背景干擾不同，在dPCR擴(kuò)增前樣品被平均分配到幾至幾百萬(wàn)個(gè)單元中。由于每個(gè)單元中靶基因以單分子狀態(tài)呈現(xiàn)，背景干擾少，解決了突變與野生DNA分子基礎(chǔ)拷貝數(shù)不同而導(dǎo)致二者PCR擴(kuò)增效率差異大的缺陷。dPCR以反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)每個(gè)反應(yīng)單元是否具有熒光信號(hào)判定反應(yīng)的陰陽(yáng)性，根據(jù)泊松分布計(jì)算原始樣本突變基因的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量。探針特異的dPCR檢出基因突變的靈敏度可高達(dá)0.005%～0.01%[14-18]，高于特異引物擴(kuò)增的ARMS分析法。dPCR靈敏度除與檢測(cè)器的靈敏度和PCR擴(kuò)增效率等因素有關(guān)外，還取決于樣本總量和可用于反應(yīng)的單元總數(shù)。樣本量足夠時(shí)，可用于反應(yīng)的單元總數(shù)越多，檢測(cè)的靈敏度越高，準(zhǔn)確度也越高。dPCR適用于拷貝數(shù)變異及突變的檢測(cè)、二代測(cè)序結(jié)果及等位基因頻率的驗(yàn)證等。

根據(jù)反應(yīng)單元形成的方式不同，dPCR主要有微滴和微流控芯片2類(lèi)。微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)源于乳液PCR技術(shù)[19-20]。ddPCR是在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的油包水微滴，對(duì)每個(gè)微滴同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，依次采集每個(gè)微滴中的熒光信號(hào)。一個(gè)微滴發(fā)生卡可一次檢測(cè)8個(gè)樣本。目前應(yīng)用較多的微滴技術(shù)平臺(tái)有Rain DropTM數(shù)字PCR系統(tǒng)(美國(guó)Rain Dance公司)和QX200系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。微流控芯片技術(shù)是一種基于超高密度親疏水微孔芯片的dPCR 平臺(tái)。該平臺(tái)采用包含20 000 個(gè)微孔的超高密度芯片作為反應(yīng)載體。每張芯片只能檢測(cè)一個(gè)樣品。目前采用微流控芯片技術(shù)的平臺(tái)有Bio-MarkTM基因分析系統(tǒng)(美國(guó)Fluidigm公司)和QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)(美國(guó)Life Technologies公司)。

一項(xiàng)前瞻性研究[21]采用ddPCR分析了29例早期乳腺癌患者腫瘤組織和ctDNA中PIK3CA突變，在15例腫瘤組織中檢測(cè)到PIK3CA突變的患者中，有14例患者外周血中檢測(cè)到PIK3CA突變，14例腫瘤組織陰性患者均未在ctDNA中檢測(cè)到PIK3CA突變(敏感性為93.3%，特異性為100%)。但dPCR一次只可檢測(cè)一個(gè)已知突變。若需要檢測(cè)靶基因的多個(gè)敏感突變位點(diǎn)，則需行多次dPCR。例如，需要檢測(cè)肺癌患者血漿EGFR基因L858R、E746_A750del、G719X和T790M 4個(gè)位點(diǎn)時(shí)，則需進(jìn)行4次dPCR反應(yīng)，操作繁瑣耗時(shí)。

1.3 SBE結(jié)合MALDI-TOF-MS 該技術(shù)首先通過(guò)多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)待測(cè)基因突變和野生目的片段，然后加入蝦堿酶水解PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和針對(duì)待測(cè)基因的引物。其后，在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)加入單堿基延伸引物，該引物的3′末端堿基與待檢突變位點(diǎn)的前一個(gè)堿基互補(bǔ)。采用4種雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)替代dNTP參加反應(yīng)。由于ddNTP在脫氧核糖的3′位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的ddNTP形成磷酸二酯鍵。探針在突變位點(diǎn)處僅延伸一個(gè)堿基，且連接上的ddNTP與突變位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)。經(jīng)樹(shù)脂純化后的延伸產(chǎn)物和非延伸引物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜?；|(zhì)從激光中吸收能量傳遞給核酸分子，核酸分子解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子。產(chǎn)物離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而測(cè)定離子的質(zhì)荷比(m/z)，從而確定該位點(diǎn)的堿基。

Margulies等[22]收集122例Ⅲ～Ⅳ期黑色素瘤患者石蠟包埋組織和配對(duì)血漿，采用ARMS法檢測(cè)腫瘤組織中BRAFV600E突變；與組織檢測(cè)結(jié)果相比，質(zhì)譜法和ARMS法檢測(cè)ctDNA的陽(yáng)性一致率分別為76.4%(55/72)和54.2%(39/72), 陰性一致率分別為98%(49/50)和96%(48/50)。單堿基延伸技術(shù)(single base extension,SBE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)可同時(shí)檢測(cè)同一基因或多個(gè)不同基因已知的熱點(diǎn)突變，檢測(cè)通量較大，操作時(shí)間短，成本低，也可定量檢測(cè)突變豐度。突變基因質(zhì)譜法檢測(cè)的靈敏度約為1%，并且由于多重PCR的循環(huán)數(shù)較多(約40個(gè)循環(huán))，突變DNA分子和野生DNA分子可能存在非等倍擴(kuò)增現(xiàn)象，導(dǎo)致質(zhì)譜法檢測(cè)到的突變豐度與實(shí)際豐度存在一定偏差。

1.4 NGS NGS可實(shí)現(xiàn)對(duì)多基因核酸片段進(jìn)行高通量平行深度測(cè)序，定量檢測(cè)突變豐度，發(fā)現(xiàn)未知突變。cfDNA加入量足夠時(shí)，NGS的靈敏度(0.02%～5%)取決于測(cè)序深度[23-25]。美國(guó)Illumina公司和Life公司是目前使用較廣泛的測(cè)序平臺(tái)。Illumina公司測(cè)序分為文庫(kù)構(gòu)建、橋式PCR擴(kuò)增和可逆性末端邊合成邊測(cè)序3部分。采用超聲或酶切法將待測(cè)基因組DNA樣本打斷為100～200 bp小片段，這些小片段兩端連接不同粘性末端接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。血漿cfDNA不需經(jīng)過(guò)處理，可用于文庫(kù)構(gòu)建。將生物素標(biāo)記的捕獲探針與單鏈DNA文庫(kù)混合，目標(biāo)區(qū)域基因片段被雜交到探針上，采用親和素包被的磁珠捕獲雜交到探針上目標(biāo)區(qū)域基因片段，去除未被吸附的基因片段。將經(jīng)過(guò)富集的目標(biāo)區(qū)域基因片段洗脫下來(lái)即可獲得目標(biāo)區(qū)域基因片段DNA文庫(kù)。文庫(kù)中具有粘性末端接頭分子可與flowcell表面附有的互補(bǔ)探針結(jié)合。當(dāng)含DNA文庫(kù)的反應(yīng)液流過(guò)flowcell表面時(shí)，每條連接有粘性末端接頭的單鏈DNA片段與flowcell表面的接頭牢牢結(jié)合在一起。每條固定在flowcell表面的DNA片段都經(jīng)過(guò)橋式PCR擴(kuò)增形成各自的簇，即每個(gè)簇都由單個(gè)DNA模板的很多個(gè)拷貝組成。橋式擴(kuò)增結(jié)束后向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和4種帶有熒光標(biāo)記的dNTP。這些dNTP的3′-OH被疊氮基保護(hù)，不能與下一個(gè)dNTP形成磷酸二酯鍵，因而每次只能添加一個(gè)dNTP。dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶被水洗脫掉。再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，光學(xué)設(shè)備記錄熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)根據(jù)4種不同顏色的熒光信號(hào)確認(rèn)堿基種類(lèi)。熒光信號(hào)記錄完成后，加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3′-OH疊氮基團(tuán)，暴露dNTP 3′-OH。再加入新的dNTP、 DNA聚合酶和接頭引物，進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)，如此循環(huán)，直到記錄下每條模板的堿基序列。

Life公司測(cè)序分為文庫(kù)構(gòu)建、乳液PCR擴(kuò)增和可逆性末端邊合成邊測(cè)序3部分。小片段DNA的兩端連接上平端接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。其目標(biāo)區(qū)域基因片段的捕獲方法與Illumina平臺(tái)相同。將包含單鏈DNA文庫(kù)、5′端標(biāo)記生物素的接頭引物、DNA聚合酶和測(cè)序微珠(表面連接有與平端接頭互補(bǔ)的引物序列)的水溶液混合均勻后，加入油，油和水混合后形成的每個(gè)小微滴中都包含0到若干個(gè)文庫(kù)分子和測(cè)序微珠，每個(gè)微滴同時(shí)進(jìn)行獨(dú)立的PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)序微珠上就連接了同一微滴中擴(kuò)增出的生物素標(biāo)記的DNA分子。破壞微滴結(jié)構(gòu)，加入鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠，磁珠會(huì)和發(fā)生PCR反應(yīng)的帶有生物素的測(cè)序微珠結(jié)合，富集這些測(cè)序微珠，然后通過(guò)洗脫液把磁珠富集的測(cè)序微珠洗脫下來(lái)。Life測(cè)序芯片含有數(shù)以百萬(wàn)、千萬(wàn)計(jì)的小孔。每個(gè)小孔既是測(cè)序微珠的容器，又是一個(gè)微型的pH計(jì)。測(cè)序時(shí)將測(cè)序微珠的混懸液從芯片的進(jìn)口注入，當(dāng)混懸液流過(guò)芯片時(shí)，每個(gè)測(cè)序微珠沉積在1個(gè)小孔中。測(cè)序時(shí)堿基ACGT依次連續(xù)流過(guò)芯片。如果核苷酸與小孔中DNA 分子互補(bǔ)，則該核苷酸與DNA 分子結(jié)合，釋放1分子焦磷酸，1個(gè)焦磷酸分子被酶進(jìn)一步分解為2個(gè)磷酸分子(即兩個(gè)酸性分子)。一個(gè)測(cè)序微珠上有幾百、幾千條DNA鏈，因此，每次發(fā)生聚合反應(yīng)，每個(gè)測(cè)序微珠就會(huì)釋放出幾百、幾千個(gè)酸性分子，小孔的pH值下降。芯片中每個(gè)小孔中的離子傳感器檢測(cè)到pH 變化后，即刻將化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息。如果DNA 鏈含有連續(xù)兩個(gè)相同的堿基，則有雙倍的酸性分子釋放，記錄的電壓信號(hào)也是雙倍的。如果堿基不匹配，則無(wú)酸性分子釋放，也就沒(méi)有電壓信號(hào)的變化。不同研究中，與組織相比，不同ctDNA檢測(cè)方法的陽(yáng)性一致率(敏感性)、陰性一致率(特異性)和總一致率存在差異，這種差異可能與組織異質(zhì)性和腫瘤分期(以往的研究，多選擇晚期腫瘤的患者)相關(guān)。不同ctDNA檢測(cè)方法針對(duì)不同分期的真陽(yáng)性和真陰性的頭對(duì)頭比較研究(head to head comparative trial)目前未見(jiàn)報(bào)道。

2 ctDNA檢測(cè)在惡性腫瘤中的應(yīng)用

2.1 早期診斷 早期腫瘤患者cfDNA含量低，ctDNA豐度低，對(duì)檢測(cè)靈敏度要求高。雖然ctDNA在腫瘤早期篩查中的價(jià)值并未被看好，但其仍然受到關(guān)注。2014年，Newman等[23]從腫瘤基因圖譜庫(kù)407位NSCLC患者全基因組測(cè)序結(jié)果和腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)篩選139個(gè)基因設(shè)計(jì)成NGS檢測(cè)組合，該組合基因突變?cè)诜蜗侔┗蝼[癌患者中發(fā)生率為96%。研究者將這種方法命名為癌癥個(gè)體化深度測(cè)序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing， CAPP-Seq)。與組織結(jié)果相比，CAPP-Seq在Ⅰ期(4例)和Ⅱ～Ⅳ期(9例)NSCLC中檢出基因突變的敏感性分別為50%和100%，在各期NSCLC中特異性為96%。ctDNA用于腫瘤早期診斷，除需高靈敏度的技術(shù)，還需設(shè)定合適的基因組合。由于不同種類(lèi)的腫瘤突變譜不同，設(shè)定的基因組合最好能覆蓋不同腫瘤80%～90%突變。

2.2 微小殘留病灶和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè) 液體活檢，包括ctDNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，在微小殘留病灶和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究成為近2年來(lái)的熱點(diǎn)，在微小殘留病灶檢測(cè)和復(fù)發(fā)預(yù)警中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。ctDNA對(duì)于微小殘留病灶評(píng)估和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)研究多集中于直結(jié)腸癌和胰腺癌。Tie等[26]對(duì)178例術(shù)后未接受輔助化療的Ⅱ期結(jié)腸癌患者進(jìn)行為期4年的追蹤試驗(yàn)。研究者采用NGS(Illumina公司)監(jiān)測(cè)血漿體細(xì)胞突變。患者于術(shù)后每6個(gè)月接受一次全身CT掃描，4～10周內(nèi)、10周后每3個(gè)月分別采集新鮮外周血。采用NGS對(duì)連續(xù)收集的外周血漿行6個(gè)基因外顯子突變檢測(cè)，術(shù)后ctDNA陽(yáng)性和陰性患者例數(shù)分別為14和164，復(fù)發(fā)率分別為78.6%(11/14)和9.8%(16/164)，無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間分別為7.9和27個(gè)月；提示ctDNA檢測(cè)或可作為病灶是否完全清除的指標(biāo)，對(duì)部分早期結(jié)腸癌患者腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)具有預(yù)測(cè)作用。Reinert等[27]還比較了影像學(xué)、癌胚抗原(CEA)、ctDNA監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的性能，發(fā)現(xiàn)ctDNA較CEA升高和影像學(xué)發(fā)現(xiàn)改變?cè)?0個(gè)月。微小殘留病灶和復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于復(fù)發(fā)的早期干預(yù)和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間非常重要。早期腫瘤患者血清蛋白質(zhì)類(lèi)腫瘤標(biāo)志物陽(yáng)性率低，對(duì)于微小殘留檢測(cè)價(jià)值有限。腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)主要靠影像學(xué)和蛋白質(zhì)類(lèi)腫瘤標(biāo)志物，但前者不能及時(shí)反映患者病情的進(jìn)展，后者敏感性低。ctDNA在監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌和胰腺癌患者術(shù)后微小殘留病灶和復(fù)發(fā)方面具有一定價(jià)值，但在其他腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值以及向臨床轉(zhuǎn)化還有待進(jìn)一步研究。

2.3 療效評(píng)價(jià) 腫瘤療效評(píng)價(jià)為基于影像學(xué)檢查的實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[28]。血清蛋白質(zhì)類(lèi)腫瘤標(biāo)志物的變化與影像學(xué)療效評(píng)價(jià)的一致率不超過(guò)50%[29]。近2年來(lái)，已有ctDNA用于晚期肺癌、結(jié)直腸癌治療的耐藥預(yù)警[23,26-27]，較早的相關(guān)研究發(fā)表于新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志[30]。該項(xiàng)研究采用靶向或全基因組測(cè)序檢測(cè)了52例正接受全身性治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者腫瘤基因組改變，采用ddPCR或靶向測(cè)序檢測(cè)組織基因突變陽(yáng)性患者(以PIK3CA和TP53基因突變居多)血漿中對(duì)應(yīng)基因突變拷貝數(shù)改變。研究還檢測(cè)了相同時(shí)間點(diǎn)CA15-3水平和CTC數(shù)量。CTC檢測(cè)采用CellSearch平臺(tái)。研究驗(yàn)證NGS檢測(cè)ctDNA突變豐度與ddPCR具有良好的一致性。該研究發(fā)現(xiàn)在30例組織中檢測(cè)到基因突變患者的外周血中ctDNA檢出的陽(yáng)性率為97%，而CTC和CA15-3陽(yáng)性率分別為87%和78%。與影像學(xué)結(jié)果相比，無(wú)論用NGS或ddPCR檢測(cè)的ctDNA水平動(dòng)態(tài)改變與腫瘤負(fù)荷改變一致性好，且兩者的關(guān)聯(lián)性?xún)?yōu)于CA15-3及CTC。ctDNA可以成批檢測(cè)，避免影像學(xué)檢查的長(zhǎng)時(shí)間等候預(yù)約。ctDNA中多個(gè)突變基因檢測(cè)可以反映腫瘤克隆的演變，但向臨床轉(zhuǎn)化還需要大規(guī)模多中心的前瞻性研究。

2.4 指導(dǎo)靶向藥物使用 癌組織基因檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)靶向治療具有重要意義。2015年2月CFDA批準(zhǔn)對(duì)吉非替尼說(shuō)明書(shū)的更新，新說(shuō)明書(shū)要求晚期NSCLC患者治療前應(yīng)檢測(cè)組織EGFR突變，但如不可獲得或不可獲得足夠的腫瘤組織時(shí)，則可檢測(cè)血液標(biāo)本中ctDNA并評(píng)估，以鑒別出最可能從吉非替尼治療中受益的NSCLC患者。2015年，《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》也提出當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，血液是EGFR基因突變檢測(cè)合適的替代生物材料，也可作為對(duì)可疑組織檢測(cè)結(jié)果的補(bǔ)充[31]。2014年，Weber等[32]分別采用Roche公司組織和血漿EGFRARMS-PCR試劑盒檢測(cè)196例Ⅱ～Ⅳ期NSCLC患者腫瘤組織和對(duì)應(yīng)血漿中EGFR基因突變，血漿EGFR突變患者使用TKI治療的PFS顯著長(zhǎng)于EGFR未突變者(5.7個(gè)月 vs 2.8個(gè)月)。該研究中組織和血漿EGFR突變的檢出例數(shù)分別為28例和24例，組織和血漿總一致率為179/196(91%)。血漿EGFR定性和定量檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)NSCLC靶向用藥十分重要。2016年，文獻(xiàn)[33]報(bào)道采用ddPCR檢測(cè)73例組織EGFR突變的晚期肺腺癌患者TKI治療前和治療后不同時(shí)間段血漿中EGFR突變頻率，治療前血漿EGFR突變頻率0.04%～5.15%的患者，其PFS顯著短于血漿EGFR突變頻率>5.15%的患者(11.1個(gè)月 vs 15.4個(gè)月)，但顯著長(zhǎng)于血漿EGFR突變頻率<0.04%的患者(11.1個(gè)月 vs 6.7個(gè)月)。該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)治療后血漿EGFR豐度下降患者的PFS(12.7個(gè)月 vs 7.1個(gè)月)和OS(overall survival，總生存時(shí)間)(28.3個(gè)月 vs 14.9個(gè)月)均顯著長(zhǎng)于治療后未下降者。目前已有部分廠(chǎng)家可檢測(cè)血漿中的某些融合基因，如ALK、ROS1等，但這些技術(shù)之間的陽(yáng)性一致率、陰性一致率以及檢測(cè)結(jié)果能否指導(dǎo)用藥，進(jìn)一步改善患者轉(zhuǎn)歸還未見(jiàn)報(bào)道。

耐藥是靶向治療的必然結(jié)果，耐藥突變基因檢測(cè)有助于耐藥的發(fā)現(xiàn)和治療方案的調(diào)整。TKI治療后耐藥的晚期NSCLC患者中EGFRT790M突變率約為50%，T790M突變患者被推薦使用AZD9291。2014年，Oxnard等[34]采用dPCR連續(xù)監(jiān)測(cè)9例晚期肺癌患者厄洛替尼治療過(guò)程中血漿中EGFRT790M突變，結(jié)果6例患者進(jìn)展，這6例患者的血漿中均檢測(cè)到T790M 突變。該研究顯示血漿T790M突變可在影像學(xué)發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展前8～24周被檢測(cè)到，提示ctDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可及時(shí)發(fā)現(xiàn)T790M耐藥基因位點(diǎn)，有助于臨床及時(shí)更換方案。

組織KRAS基因突變檢測(cè)已被NCCN指南推薦為結(jié)直腸癌患者用抗EGFR治療前的檢測(cè)項(xiàng)目，KRAS基因突變患者不推薦用西妥昔單抗(抗EGFR)治療。早在2010年，比利時(shí)De Roock等[35]采用質(zhì)譜法檢測(cè)750例接受西妥昔單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA基因的突變狀態(tài)，并分析這些基因的突變狀態(tài)與患者的治療反應(yīng)率、PFS和OS的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)KRAS突變型患者的治療反應(yīng)率、中位PFS和中位OS均低于KRAS野生型患者(治療反應(yīng)率：6.7% vs 35.8%；中位PFS：12周 vs 24周；中位OS：32周 vs 50周)。目前血漿KRAS基因突變檢測(cè)用于指導(dǎo)用藥還未達(dá)成專(zhuān)家共識(shí)，但未來(lái)或可先通過(guò)血漿KRAS基因檢測(cè)，免除對(duì)血漿KRAS基因突變陽(yáng)性患者的活檢。結(jié)直腸癌血漿KRAS檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值受到關(guān)注。2015年，Danese等[36]采用ARMS法檢測(cè)了85例Ⅰ～Ⅳ期(以Ⅱ～Ⅲ期為主)結(jié)直腸癌患者血漿和新鮮冰凍組織中KRAS突變。組織KRAS基因突變陽(yáng)性率為34%。與組織相比，血漿檢測(cè)KRAS突變的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為85%、93%、84.6%和93%，血漿和組織KRAS檢測(cè)的總一致率為89.4%。同年，Spindler等[37]采用ARMS法檢測(cè)211例Ⅳ期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者石蠟包埋組織和血漿中KRAS突變，組織中KRAS基因突變率為66.4%。與組織相比，血漿檢測(cè)KRAS突變的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為80%、95.8%、97.4%和70.8%，血漿與組織KRAS檢測(cè)的總一致率為85.3%。以上研究結(jié)果表明血漿KRAS基因檢測(cè)在中、晚期結(jié)直腸癌中具有理想的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。術(shù)后或不可手術(shù)晚期胃腸間質(zhì)瘤患者組織C-KIT和PDGFR及晚期黑色素瘤患者組織BRAFV600E和C-KIT基因突變應(yīng)用于前者選擇伊馬替尼和后者選擇威羅替尼。胃腸間質(zhì)瘤、黑色素瘤血漿基因突變檢測(cè)也應(yīng)該具有意義。

2.5 生存評(píng)估 研究顯示年齡、性別、病理類(lèi)型、T分期、N分期、淋巴結(jié)采樣數(shù)量與NSCLC患者術(shù)后生存有關(guān)[38]，而初始ctDNA定性和定量檢測(cè)預(yù)測(cè)腫瘤患者生存的研究少見(jiàn)。Kinugasa等[39]采用ddPCR檢測(cè)了75例Ⅱ～Ⅳ期(Ⅲ～Ⅳ期患者占97%)胰腺癌患者腫瘤組織和cfDNA中KRAS突變，結(jié)果在腫瘤組織和cfDNA中檢測(cè)到KRAS突變比例分別為74.7%和62.7%。研究發(fā)現(xiàn)，組織KRAS基因檢測(cè)陽(yáng)性和陰性患者OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(351 d vs 301 d)，而ctDNA檢測(cè)陽(yáng)性患者OS較陰性患者短 (413 d vs 276 d)。Sanmamed等[14]采用ddPCR檢測(cè)19例組織BRAFV600E突變的晚期黑色素瘤患者治療前外周血中BRAFV600E的濃度(copies/mL)，結(jié)果在16例患者外周血中檢測(cè)到BRAFV600E突變。研究發(fā)現(xiàn)OS超過(guò)2年的患者，其初治時(shí)血漿BRAFV600E濃度較OS短于2年的患者低(27 copies/mL vs 478 copies/mL)。以216 copies/mL為臨界值，ctDNA低于臨界值患者的PFS和OS較ctDNA高于臨界值的患者長(zhǎng)(PFS：9個(gè)月 vs 3個(gè)月；OS：27.7個(gè)月 vs 8.6個(gè)月)。腫瘤患者的生存與腫瘤病理類(lèi)型、腫瘤分期和負(fù)荷、生理狀況等諸多因素相關(guān)。目前已有研究綜合患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、病理類(lèi)型、分期、淋巴結(jié)采樣數(shù)目等構(gòu)建模型，評(píng)估患者預(yù)后，但未見(jiàn)結(jié)合臨床資料和ctDNA濃度及豐度評(píng)估預(yù)后的模型。該模型的構(gòu)建或能更好地評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后。

3 存在的問(wèn)題與思考

不同分析技術(shù)平臺(tái)的涌現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了ctDNA基因檢測(cè)從單基因到多基因、定性到定量的發(fā)展。ctDNA在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用研究層出不窮，目前只有血漿EGFR檢測(cè)被推薦作為組織檢測(cè)的補(bǔ)充，用于指導(dǎo)晚期NSCLC患者的靶向用藥。ctDNA檢測(cè)在早期診斷、微小殘留檢測(cè)和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、治療效果評(píng)價(jià)、生存評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值仍在研究和驗(yàn)證中。ctDNA檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)受到關(guān)注，正逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用。不同ctDNA檢測(cè)平臺(tái)的分析性能和臨床診斷性能的評(píng)價(jià)、ctDNA的規(guī)范檢測(cè)應(yīng)該受到關(guān)注。以下4個(gè)方面值得思考。

3.1 ctDNA反映腫瘤異質(zhì)性的能力 腫瘤異質(zhì)性是基因檢測(cè)和腫瘤治療面對(duì)的難題。腫瘤異質(zhì)性主要表現(xiàn)為不同個(gè)體之間、不同癌細(xì)胞之間、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間、不同轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性。ctDNA能反映腫瘤異質(zhì)性是其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。組織中基因突變頻率與癌組織占有的比例及突變與未突變的克隆比例有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者血漿EGFR和晚期結(jié)直腸癌患者血漿KRAS檢測(cè)的敏感性可達(dá)60%～80%，說(shuō)明ctDNA可敏感地檢測(cè)出大部分晚期肺癌和晚期直結(jié)腸癌患者攜有該突變的克隆。哪些腫瘤患者血漿ctDNA可作為組織基因檢測(cè)的替代材料需要深入研究。對(duì)于進(jìn)展期患者，如果轉(zhuǎn)移灶靶基因檢測(cè)陰性，而血漿檢測(cè)陽(yáng)性，可能與取得的活檢標(biāo)本未包括有突變的克隆有關(guān)。要驗(yàn)證此假設(shè)，需對(duì)患者進(jìn)行多部位活檢或尸檢，比較活檢或尸檢組織與ctDNA檢測(cè)的一致性。類(lèi)似研究?jī)H有個(gè)案報(bào)道。

3.2 不同平臺(tái)檢測(cè)ctDNA基因突變的一致性與假陽(yáng)性 不同平臺(tái)檢測(cè)ctDNA突變結(jié)果不一致令臨床和患者困惑。檢測(cè)結(jié)果不一致與方法不同、同一方法不同平臺(tái)的敏感性及特異性、對(duì)檢出信號(hào)陽(yáng)性閾值的設(shè)置不同有關(guān)。如前所述，dPCR檢測(cè)的靈敏度最高，可達(dá)0.1%。基于ARMS和NGS的檢出靈敏度有的僅達(dá)1%，有的可接近0.2%～0.5%。如用于復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、靶基因豐度改變的監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估、結(jié)局預(yù)測(cè)，則要求該技術(shù)的靈敏度達(dá)到0.1%，且可定量報(bào)告ctDNA豐度和拷貝數(shù)。我們的研究初步發(fā)現(xiàn)當(dāng)晚期NSCLC患者血漿EGFR突變豐度>1%時(shí)，ARMS、ddPCR和NGS的陽(yáng)性一致率、陰性一致率均高于90%，而當(dāng)突變豐度<1%時(shí)，較低靈敏度的某ARMS產(chǎn)品與較高靈敏度的NGS和ddPCR平臺(tái)的陽(yáng)性一致率低于15%。似乎1%的檢出敏感性是評(píng)價(jià)基于PCR檢測(cè)ctDNA的不同平臺(tái)檢測(cè)能力的分水嶺。文獻(xiàn)和我們的研究均發(fā)現(xiàn)EGFRT790M(ACG>ATG)陽(yáng)性結(jié)果的報(bào)告富有挑戰(zhàn)性，該位點(diǎn)的C堿基可自發(fā)脫氨基生成U，且該點(diǎn)位于CpG島內(nèi)，C堿基的甲基化可增加其脫氨基的風(fēng)險(xiǎn)，三聯(lián)密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸由蘇氨酸(T)變成甲硫氨酸(M)，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性。有廠(chǎng)家通過(guò)提高該位點(diǎn)的判讀閾值來(lái)降低假陽(yáng)性率。

樣本前處理也影響ctDNA檢測(cè)結(jié)果。使用含不同種類(lèi)細(xì)胞保護(hù)劑樣本采集管和樣本采集后放置的時(shí)間、cfDNA提取試劑種類(lèi)都會(huì)影響ctDNA檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性，未見(jiàn)到相關(guān)系統(tǒng)研究報(bào)告。

3.3 優(yōu)化分子病理檢測(cè)和液體活檢的流程 不同平臺(tái)檢測(cè)ctDNA的通量不同，價(jià)格相差很大。合理和優(yōu)化使用ctDNA檢測(cè)以減輕患者負(fù)擔(dān)受到重視。合理應(yīng)用ctDNA檢測(cè)的指導(dǎo)意見(jiàn)有待討論與出版。為此，分子病理檢測(cè)和液體活檢流程的優(yōu)化被納入了“重大慢性非傳染性疾病防控研究”2017年度重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)的資助范圍。

ARMS檢測(cè)價(jià)格適宜，一次可檢測(cè)單個(gè)基因的多個(gè)已知突變，操作簡(jiǎn)單。檢測(cè)已知的、單個(gè)臨床上可用藥物抑制的靶點(diǎn)(如EGFR、KRAS、BRAF等基因突變)，ctDNA檢測(cè)推薦ARMS法。dPCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的具有高靈敏度的新技術(shù)，其一個(gè)反應(yīng)只能定量檢測(cè)一個(gè)已知突變位點(diǎn)，對(duì)于多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，需要更多的樣本量，操作繁瑣，價(jià)格較ARMS貴。目前有許多廠(chǎng)家試圖開(kāi)發(fā)dPCR試劑盒。dPCR現(xiàn)多用于臨床研究。dPCR檢測(cè)敏感突變的基線(xiàn)豐度以及治療過(guò)程中ctDNA的豐度消漲對(duì)于療效評(píng)價(jià)和生存評(píng)價(jià)具有價(jià)值，是一個(gè)具有應(yīng)用潛力的技術(shù)。NGS可定量檢測(cè)多個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)。NGS檢測(cè)ctDNA突變豐度可與dPCR相當(dāng)。普通和超靈敏的NGS成本高，但最具應(yīng)用潛力。以EGFR檢測(cè)為例，由于多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)患者的EGFR突變狀態(tài)與患者數(shù)年前的組織EGFR檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性，所以當(dāng)原始組織標(biāo)本可獲得時(shí)，采用ARMS檢測(cè)組織EGFR突變狀態(tài)用于指導(dǎo)用藥可行。需動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)者可采用dPCR監(jiān)測(cè)血漿EGFR突變以用于療效評(píng)價(jià)和預(yù)后評(píng)估，該模式具有較好的分子檢測(cè)經(jīng)濟(jì)學(xué)。普通NGS尚不能完全取代EGFR等突變基因的ARMS檢測(cè)、ALK和ROS1等融合基因的免疫組化或逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，但其在腫瘤組織基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。如經(jīng)濟(jì)條件允許，可首先直接采用普通NGS檢測(cè)組織基因突變譜，其后采用dPCR或超靈敏NGS平行定量檢測(cè)血漿驅(qū)動(dòng)基因以及其他基因突變豐度消漲以預(yù)測(cè)腫瘤克隆演變。目前血漿中ALK、ROS1等融合基因的NGS檢測(cè)方法正在開(kāi)發(fā)中。臨床醫(yī)生應(yīng)該向患者說(shuō)明不同檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)性能(包括靈敏度、特異性、假陽(yáng)性、通量等)及花費(fèi)，讓患者做出適合自身檢測(cè)的選擇。

3.4 ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品的研制 ctDNA檢測(cè)質(zhì)控品的研發(fā)和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃剛起步。含突變位點(diǎn)的細(xì)胞系基因組DNA或重組質(zhì)粒均可作為ARMS和dPCR檢測(cè)的質(zhì)控物。由于ctDNA片段小，制備與ctDNA長(zhǎng)度相當(dāng)、基質(zhì)與血漿類(lèi)似的參考物用于NGS的質(zhì)量控制應(yīng)該受到關(guān)注，此類(lèi)參考物也適用于ctDNA ARMS和dPCR的質(zhì)量控制。英國(guó)Horizon Discovery 公司發(fā)布了商品化的ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源于細(xì)胞系基因組DNA。近2年來(lái)，美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)也啟動(dòng)了ctDNA檢測(cè)的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。與人血漿ctDNA性質(zhì)相似的標(biāo)準(zhǔn)品制備瓶頸包括DNA的片段化和ctDNA突變豐度的定值。片段化DNA包括超聲法和酶切法，有學(xué)者認(rèn)為酶切法產(chǎn)生的DNA片段用于建庫(kù)的效率更高。ctDNA突變豐度的定值較困難。理論上采用具有100%突變頻率的細(xì)胞系基因組DNA與野生型細(xì)胞系勾兌可完成配制。但細(xì)胞系的基因組突變與健康人的胚系基因突變不同，純合型和雜合型突變的頻率多不是100%和50%，難以克隆到某基因突變頻率為100%的細(xì)胞系，即便尋找到或克隆到這類(lèi)細(xì)胞系，傳代對(duì)突變豐度的影響也不清楚。期待突變豐度賦值準(zhǔn)確、基質(zhì)與血漿類(lèi)似、內(nèi)含的DNA建庫(kù)效率高、片段大小與ctDNA一致、適用于NGS質(zhì)量控制的參考品問(wèn)世。

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(本文編輯：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.01

徐婷，1989年生，女，博士研究生，研究方向?yàn)槟[瘤液體活檢技術(shù)的應(yīng)用；徐國(guó)賓，1963年生，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域?yàn)槟[瘤生物化學(xué)與分子生物學(xué)檢驗(yàn)；徐婷與徐國(guó)賓對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)，同為第一作者。

季加孚，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：jijiafu@hsc.pku.edu.cn。

R446；R730.3

A

2016-12-20)