21世紀,糖尿病(diabetes Mellitus，DM)已經(jīng)逐漸成為一種流行病，其患病率為2%～6%[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy ，DR)，是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，病變晚期可導致失明。過去常認為，DR的發(fā)生及進展與糖尿病的病程長、血糖控制不佳及高血脂有關。事實上，DR的病理變化是涉及到微血管病變、神經(jīng)退化、免疫、繼發(fā)性炎癥反應等多種因素相互作用的結果。目前，DR的治療方法主要包括：視網(wǎng)膜光凝，球內注藥(抗VEGF)，以及玻璃體切除術，適用于該疾病的晚期，且病人之間療效差異較大。差異表達的生物標志物能客觀預示疾病的發(fā)生，監(jiān)控疾病的進展，評估治療的療效，有助于DR的預防及治療。蛋白質組(proteome)概念在1994年由Wilkins與Williams[2]提出，是指在特定的時間和空間內，一個基因組、一種組織或一種生物、細胞所表達的包括所有亞型以及經(jīng)過修飾的全部蛋白質。而蛋白質組學(proteomics)就是從整體水平上來認識蛋白質的存在及其活動方式(表達、修飾、功能、相互作用等)，從而更好的闡明生命科學本質的學科[3]。以玻璃體、房水，血液、淚液、唾液等為研究對象，運用蛋白質組學從分子水平研究DR的發(fā)病機制，能對其進行早期診斷，尋找新的治療靶點，從而改善其預后。

一、蛋白質組學的研究概況

根據(jù)研究目的和手段的不同，蛋白質組學可以分為表達蛋白質組學、結構蛋白質組學和功能蛋白質組學。表達蛋白質組學用于細胞內蛋白樣品表達的定量研究。其研究技術為經(jīng)典的蛋白質組學技術即雙向凝膠電泳和圖像分析。在蛋白質組水平上研究蛋白質表達水平的變化等，是應用最為廣泛的蛋白質組學的研究模式[4]。

1.蛋白質主要分離技術 ：二維凝膠電泳(two dimensional electrophoresis，2DE)及液相色譜法(liquidchromatographic，LC)是兩種常見的分離技術。2DE是一種用途廣泛，以凝膠為基礎，通過蛋白質電荷及分子大小，定性及定量分析的技術[5]。LC是一種不以凝膠為基礎的高效分離技術。是利用待分離的物質在分離相與固定相的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的[6]。

2.基于質譜的定量研究技術：質譜法(mmass spectrometry，MS)是用電場和磁場將運動的離子按它們的質荷比分離后進行檢測的方法，可獲得化合物的分子量及化學結構[7]。近年來，蛋白質組學能夠飛速發(fā)展的最大功臣非質譜莫屬。根據(jù)生物大分子的特性，基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質譜(ESI-MS)主要應用于生物質譜?；谫|譜的定量蛋白質組學技術分為同位素標記技術(ICAT，iTRAQ，TMT，雙甲基化，SILAC)，及非同位素標記(Lable-free)蛋白質組學定量技術。SILAC法是在細胞培養(yǎng)時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，細胞經(jīng)傳代后其蛋白質被同位素穩(wěn)定標記，再通過質譜對蛋白進行鑒定及相對定量。ICAT法是將來源不同處理的蛋白質分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT 試劑標記，等量混合后經(jīng)胰蛋白酶酶切，進行質譜分析。ICAT法不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質，且ICAT分子量相對較大，與蛋白質連接后可能會造成分子的空間位組。隨著科學技術的不斷進步，iTRAQ技術在蛋白質組學研究中已成為熱點，它幾乎可以標記所有的蛋白質，一次可同時處理8個樣本[8]，具有靈敏度高、分辨率高、重復性好等諸多優(yōu)點,這使其在醫(yī)學和生物制藥領域受到高度關注和廣泛應用[9]。非同位素標記蛋白質組學定量技術，不需要昂貴的同位素進行標記，所需樣本總量少，且不受樣品數(shù)量的限制，直接采用液質聯(lián)用技術對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，比較不同蛋白質樣品二級質譜的肽段離子的數(shù)量，并根據(jù)肽段數(shù)量進行相對定量[10]。

二、蛋白質組學在DR發(fā)病機制中的應用

1.增生膜中的生物分子標志物：因為視網(wǎng)膜是DR的病變部位，所以選取的研究對象與視網(wǎng)膜關系越緊密，越能夠揭示DR的發(fā)生與發(fā)展。2010年Takada等[11]用LC/MS 技術，以特發(fā)性黃斑前膜(idiopathic epiretinal membranes ，ERMs)患者為對照組取其前膜，PDR患者為實驗組取其增生膜，發(fā)現(xiàn)226種蛋白表達于PDR組，154種蛋白表達于ERM組，其中102種蛋白特異性存在于PDR中，30種蛋白特異性存在于ERM中，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析及RT-PCR對其驗證發(fā)現(xiàn)，骨膜素(periostin)在PDR組中的表達量明顯上調，該蛋白在細胞粘附中發(fā)揮重要作用，可能參與PDR的發(fā)生。

2.玻璃體中的生物分子標志物：玻璃體含有可溶性蛋白質及一些生物大分子，較易通過玻璃體切除術獲取，且其貼近視網(wǎng)膜，能一定程度上反應視網(wǎng)膜的病變。Angi[12]等用蛋白質組學的方法證實了DR組玻璃體的蛋白質含量比非DR組的高。Sirpa[13]等用LC/MS技術選取138位患者的玻璃體進行分析，鑒定出了2482種蛋白質，并對其中的1351種蛋白質進行定量分析。與NPDR組相比，PDR組中有230種蛋白質顯著上調，其中氧化應激及活性氧物質(PRDX2, PRDX6, CATA， ROMO1)在PDR組中顯著上調，參與補體級聯(lián)反應的(C1Q, CFAB, CFAD,CFAH, CFA)等因子及A1AT, A2MG, ANT3等凝血因子也在PDR組中顯著上調。此外，該研究還指出，PDR組經(jīng)抗VEGF治療后，有72種蛋白被顯著下調，其中包括(CNTN2, FAT4, FLNC)等細胞粘附因子，(APOBR和APOH)載脂蛋白等。

3.房水中的生物分子標志物：房水經(jīng)睫狀體分泌，從后房途經(jīng)瞳孔流進前房，實現(xiàn)眼內循環(huán)。Chiang[14]等通過以凝膠為基礎的蛋白組學研究技術與MALDI-TOF-MS聯(lián)用，鑒定出了DR組與對照組房水中差異性表達的11種蛋白質，這些蛋白與營養(yǎng)運輸、組織重組、血管生成、抗氧化及神經(jīng)保護等生命活動相關(見表1)。Grigsby[15]等指出，DM的發(fā)病與炎癥反應有關，而其機制之一是神經(jīng)膠質細胞(retinal glial cells，RGC)的活化。隨后，Stela[16]等用蛋白質組學的方法證實，與對照組相比，DR患者房水中RGC相關的炎性因子表達上調(見表1)。

4.血漿中的生物分子標志物：增生膜、玻璃體、房水因為與DR的發(fā)病部位聯(lián)系緊密，所以是最為合適的研究對象。但它們必須通過手術獲得，適合揭示疾病的進展，不適用于疾病的診斷。由于血漿相對容易獲取，能為DR的診斷提供重要信息。雖然，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多生物分子標志物與DR相關，有研究表明，當糖化血紅蛋白每減少1%，DR的發(fā)生率將下降40%，DR的進展將減少25%[17]。Song和Xu分別通過meta分析發(fā)現(xiàn)，C反應蛋白的水平在DR患者中有所上升，同型半胱氨酸在I型糖尿病中與DR的發(fā)生密切相關[18，19]。然而，它們都是非特異性的炎性標志物，故限制了其應用。目前，只有糖化血紅蛋白應用于臨床監(jiān)測DR的發(fā)生及進展。Gopalakrishnan[20]等用2DE與MALDI-TOF-MS技術發(fā)現(xiàn)血漿中RBP1、NUD10、NGB、HBG2、CD160在DR組中表達上調，其與物質運輸、信號轉導、氧傳遞及免疫應答相關。Yeh[21]等用親和去除系統(tǒng)提取出2型糖尿病患者血漿中14種高豐度蛋白，再用LC-ESI-MS技術對低豐度蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)L1CAM在DR患者血漿顯著上調。

5.淚液中的生物分子標志物：淚液是一種由蛋白質、脂質、粘液素、水和鹽組成的一種復雜混合物。與血漿相比，其較少受全身疾病影響，取材更方便，且具有非侵入性，所以近些年，成為了尋找生物標志物的重要對象。DR的發(fā)生是由于眼內血管內血液成分的變化，所引起的視網(wǎng)膜的病變。雖然淚液并不直接與視網(wǎng)膜接觸，但血液成分的變化也可能影響淚腺的分泌，從而造成淚液成分的改變。有研究指出，DR患者淚液中的載脂蛋白A-1[22]、糖化終產物[23]、氨基多糖[24]等物質表達上調。Aass[25]等通過蛋白質組學技術在淚液中鑒定出了1526種蛋白質。 Nguyen-Khuong[26]等用LC-ESI-IT-MS和串聯(lián)MS技術對DR組及對照組淚液蛋白中的糖基化修飾進行分析，發(fā)現(xiàn)兩組中的聚糖結構大多保守，只有一些低豐度蛋白質發(fā)生N-糖基化修飾，在DM與DR的發(fā)病中也恰巧存在N-糖基化修飾。這能為尋找提示DR的診斷及進展的生物標志物提供依據(jù)。

6.唾液中的生物分子標志物：除了淚液以外，唾液也具有取材方便、非侵入性等特點。唾液由唾液腺、口腔黏膜、牙周組織及口腔微生物共同參與分泌，能為唾液腺疾病、口腔疾病甚至系統(tǒng)性疾病提供診斷依據(jù)。Castagnola[27]等發(fā)現(xiàn)唾液中存在某些生物標志物能反映患者健康及疾病的狀態(tài)。Chee[28]等用iTRAQ技術及LC-MS技術對唾液進行蛋白質組學分析，鑒定出了315種蛋白質，發(fā)現(xiàn)其中119種在NPDR組及PDR組中發(fā)生了差異性表達，它們與多種生物途徑有關，說明DR的發(fā)病是多種機制相互作用的結果(見表1)。

三、結語

2030年，DR患者及嚴重視力損害的DR患者數(shù)量將可能分別達到1億9100萬及5630萬[29]。 然而以上所提到的這些生物標志物，并沒有像糖化血紅蛋白一樣應用于臨床。近年來，蛋白質組學研究發(fā)展迅速，廣泛地應用于各個領域。運用蛋白質組學尋找DR組與對照組中的差異蛋白，能更好的闡述DR的發(fā)病機制，有助于DR的早期預警。大規(guī)模以及多中心研究將能更客觀地為DR找到生物標志物，從而為改善DR的預后提供幫助。

[1] Pettitt DJ, Talton J, Dabelea D,et al. Prevalence of diabetes in U.S. youth in 2009: the SEARCH for diabetes in youth study.Diabetes Care，2014，37：402-408.

[2] Wilkins MR,Sanchez JC,Gooley AA,et al. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol Genet Eng Rev，1996，13：19-50.

[3] 董書偉，李巍，嚴作廷,等．蛋白質組學及其在奶牛蹄葉炎研究中的應用前景.動物醫(yī)學進展, 2012,33:174-178.

[4] 尹穩(wěn)，伏旭，李平. 蛋白質組學的應用研究進展. 生物技術通報,2014,25：32-38.

[5] Sandra M，Paul D,Kay O. Comparative skeletal muscle proteomics using two-dimensional gel electrophoresis.Proteomics,2016,4:27.

[6] Callesen AK,Madsen JS,Vach W,et al. Serum protein profiling by solid phase extraction and mass spectrometry: a future diagnostics tool?.Proteomics,2009,9:1428-1441.

[7] 應萬濤，錢小紅.生物質譜技術應用及進展.軍事醫(yī)學院院刊，2000，30：146-150.

[8] Jiao J,Wang S,Zhang R,et al.iTRAQ-based quantitative proteomics discovering potential serum biomarkers in locoweed poisoned rabbits. Chem Biol Interact,2017, 268:111-118.

[9] Nú?ez EV, Guest PC, Martins-de-Souza D,et al.Application of iTRAQ shotgun proteomics for measurement of brain proteins in studies of psychiatric disorders. Adv Exp Med Biol,2017, 974:219-227.

[10] Zhu W,Smith JW,Huang CM,Mass spectrometry-based label-free quantitative proteomics. J Biomed Biotechnol, 2010 :8.

[11] Takada M, Ban Y, Yamamoto G,et al. Periostin, discovered by nano-flow liquid chromatography and mass spectrometry, is a novel marker of diabetic retinopathy, Biochem. Biophys. Res Commun,2010,399：221-226.

[12] Angi M,Kalirai H,Coupland SE,et al. Proteomic analyses of the vitreous humour. Mediators Inflamm,2012：2012.

[13] Sirpa L, Helka N,Fitsum T,et al,Quantitative proteomics analysis of vitreous humor from diabetic retinopathy patients. Proteome Res, 2015, 14:51315143.

[14] Chiang SY, Tsai ML, Wang CY, et al.Proteomic analysis and identification of aqueous humor proteins with a pathophysiological rolein diabetic retinopathy. J Proteomics.,2012,75:2950-2959.

[15] Grigsby JG, Cardona SM, Pouw CE, et al.The role of microglia in diabetic retinopathy. J Ophthalmol,2014:705783.

[16] Vujosevic S,Micera A,Bini S,et al. Proteome analysis of retinal glia cells-related inflammatory cytokines in the aqueous humourof diabetic patients. Acta Ophthalmol.,2016,94:56-64.

[17] Mohamed Q, Gillies MC, Wong TY. Management of diabetic retinopathy: a systematic review. JAMA, 2007，298:902-916.

[18] Song J, Chen S, Liu X,et al. Relationship between C-reactive protein level and diabetic retinopathy: a systematic review and meta-analysis. PLoS One, 2015,10.

[19] Xu C, Wu Y, Liu G,et al. Relationship between homocysteine level and diabetic retinopathy: a systematic review and meta-analy. Diagn Pathol,2014,9:167.

[20] Gopalakrishnan V, Purushothaman P, Bhaskar A. Proteomic analysis of plasma proteins in diabetic retinopathy patients by two dimensional electrophoresis and MALDI-TOf-MS. J Diabetes Complicat,2015,29:928-936.

[21] Yeh SH, Chang WC, Chuang H,et al.Differentiation of type 2 diabetes mellitus with different complications by proteomic analysis of plasma low abundance proteins. J Diabetes Metab Disord,2016,15：24.

[22] Kawai S, Nakajima T, Hokari S,et al.Apolipoprotein A-I concentration in tears in diabetic retinopathy.Ann Clin Biochem, 2002,39:56-61.

[23] Zhao Z, Liu J, Shi B,et al. Advanced glycation end product(AGE)modified proteins in tears of diabetic patients. Mol Vis, 2010,16:1576-1584.

[24] Moschos MM, Rouvas AA, Papadimitriou S,et al.Apostolopoulos M. Quantitative determination of glycosaminoglycans in tears of diabetic patients. Clin Ophthalmol,2008,2:581-584.

[25] Aass C, Norheim I, Eriksen EF,et al. Single unit filter-aided method for fast proteomic analysis of tear fluid. Anal Biochem,2015;480:1-5.

[26] Nguyen-Khuong T, Everest-Dass AV, Kautto L, et al.Packer NH.Glycomic characterization of basal tears and changes with diabetes and diabetic retinopathy. Glycobiology,2015,25:269-283.

[27] Castagnola M,Picciotti PM,Messana I,et al.Potential applications of human saliva as diagnostic fluid. Acta Otorhinolaryngol Ital,2011,3:347-357.

[28] Chee CS, Chang KM, Loke MF,et al. Association of potential salivary biomarkers with diabetic retinopathy and its severity in type-2 diabetes mellitus:a proteomic analysis by mass spectrometry.Peer J,2016,12;4:e2022.

[29] International Diabetes Federation.Diabetesatlas.6thed.Brussels:International Diabetes Federationm,2015.