徐元宏

臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)若干進(jìn)展

徐元宏

臨床微生物 檢驗(yàn)技術(shù) 進(jìn)展

臨床微生物學(xué)是研究微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類、生命活動(dòng)規(guī)律的一門科學(xué)，包括細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、真菌學(xué)等。新現(xiàn)與再現(xiàn)傳染病的爆發(fā)促進(jìn)臨床微生物檢驗(yàn)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)日新月異豐富了臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)的內(nèi)涵，現(xiàn)就近年臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)展作一綜述。

1 臨床微生物病原體的快速診斷

雖然對(duì)“快速”的時(shí)間長(zhǎng)短沒(méi)有正式的定義，但是大多數(shù)人期望快速的系統(tǒng)能在4 h內(nèi)提供可用的結(jié)果。微生物的繁殖時(shí)間是30 min或更長(zhǎng)時(shí)間，不允許那些依賴微生物生長(zhǎng)與否的檢測(cè)方法。為了克服這一問(wèn)題，必然使用全新的底物，檢測(cè)待測(cè)菌產(chǎn)生的酶或蛋白質(zhì)，從而在1～4 h內(nèi)檢測(cè)出應(yīng)答反應(yīng)。

1.1 細(xì)菌與真菌的快速診斷 經(jīng)典臨床微生物尤其細(xì)菌、真菌鑒定是根據(jù)培養(yǎng)基中的反應(yīng)和物理特性的觀察，如菌落形態(tài)和氣味，再加上革蘭染色、生化反應(yīng)、凝集試驗(yàn)。常規(guī)使用的鑒定方法趨于微型化和便捷化。生化反應(yīng)是依據(jù)每種生物對(duì)于系統(tǒng)中每種底物的反應(yīng)來(lái)確定的，包括接種物制備、接種濃度、孵育條件和結(jié)果解釋。大多數(shù)系統(tǒng)依賴于一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)的組合，包括：①底物利用后產(chǎn)生的pH值變化（API、Crystal、Vitek、MicroScan傳統(tǒng)板、Phoenix板，Sensititre板）；②酶促反應(yīng)釋放顯色或熒光化合物（Crystal，Vitek，MicroScan快速試劑，Phoenix，Sensititre）；③在各種碳源的存在時(shí)，四氮唑指示劑的代謝活性（Biolog）；④揮發(fā)性或非揮發(fā)化合物的檢測(cè)（MIDI）；⑤可見(jiàn)生長(zhǎng)的識(shí)別（API 20C AUX）。

MALDI-TOF MS比較的是菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜，提供了快速且廉價(jià)的細(xì)菌和真菌鑒定方法[1]。MALDITOF MS系統(tǒng)主要包括生物梅里埃公司和BD布魯克公司，Richter等進(jìn)行了一項(xiàng)多中心的比較研究。他們比較了VITEK MS 與16S rRNA基因測(cè)序?qū)?7個(gè)屬40個(gè)種的965株腸桿菌科細(xì)菌的鑒定結(jié)果[2]，MALDI-TOF MS結(jié)果與菌株參考方法測(cè)出的結(jié)果相比，一致性達(dá)96.7%，其中83.8%正確鑒定至種水平，限于屬水平鑒定率為12.8%，無(wú)法鑒定的占1.7%。MALDI-TOF MS可以鑒定Campylobacter species，Arcobacter butzleri，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）和Aeromonas species，并區(qū)分犬咬二氧化碳嗜纖維菌（Capnocytophaga canimorsus）和Capnocytophaga cynodegmi[3]。可以鑒定Burkholderia cepacia復(fù)合群，包括Burkholderia cenocepacia，Burkholderia cepacia，Burkholderia stabilis和Burkholderia vietnamiensis[4]。HACEK菌群（Haemophilus，Actinobacillus/Aggregatibacter，Cardiobacterium，Eikenella，Kingella）和Legionella species 能夠被鑒定出來(lái)。Francisella tularensis和Brucella species也有可能準(zhǔn)確鑒定出來(lái)。

MALDI-TOF MS對(duì)葡萄球菌（Staphylococci）、β-溶血性鏈球菌（β-hemolytic streptococci）、氣球菌（Aerococci）和腸球菌（Enterococci）的整體鑒定性能都是極佳的。而對(duì)一些α-溶血性鏈球菌（α-hemolytic streptococci）有困難。質(zhì)譜系統(tǒng)可靠鑒定溶血隱秘桿菌（Arcanobacterium haemolyticum）和馬紅球菌（Rhodococcus equi），除密切相關(guān)的外，所有棒桿菌屬菌也可準(zhǔn)確鑒定[5]。

MALDI-TOF MS技術(shù)可用于鑒定許多臨床相關(guān)的厭氧菌。Jamal等[6]報(bào)道使用布魯克和生物梅里埃對(duì)274株常規(guī)分離厭氧菌的鑒定準(zhǔn)確率分別為89%和100%。針對(duì)更難鑒定的厭氧菌包括普雷沃菌屬，可成功鑒定83%的菌株。Schmitt等評(píng)估了布魯克系統(tǒng)對(duì)廣泛收集的253種臨床厭氧菌的鑒定效果，其在屬和種的水平上的正確鑒定率分別為92%和71%[7]。Barreau等利用布魯克系統(tǒng)在種的水平正確鑒定了1 325株厭氧菌中的92.5%的菌株[8]。Garneret等評(píng)估了采用VITEK MS 對(duì)651株厭氧菌的鑒定結(jié)果，并報(bào)道鑒定到種水平的正確率為91.2%[9]。

MALDITOF MS應(yīng)該能夠鑒定大多數(shù)臨床相關(guān)的分枝桿菌菌種，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex）或許只能鑒定到復(fù)合群水平，其它一些種（例如Mycobacterium abscessus和Mycobacterium massiliense； Mycobacterium mucogenicum和Mycobacterium phocaicum ；Mycobacterium chimaera和Mycobacterium intracellulare）彼此難以很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。諾卡菌屬可以鑒定，但與分枝桿菌屬一樣，需要特殊的樣本提取與處理過(guò)程。

MALDI-TOF MS在菌株同源性分析方面的研究取得可喜的進(jìn)展，有研究顯示[10-12]其對(duì)細(xì)菌同源性分析的準(zhǔn)確度與PFGE高度一致。

MALDI-TOF MS可以鑒定酵母菌，且性能優(yōu)于一些傳統(tǒng)的表型鑒定系統(tǒng)。它可以鑒別都柏林假絲酵母菌（C. dubliniensis）和白假絲酵母菌（C.albicans）；皺折假絲酵母菌（C.rugosa）和近鄒褶假絲酵母菌（C.pararugosa）；挪威假絲酵母菌（C.norvegensis）、克柔假絲酵母菌（C.krusei）和平常假絲酵母菌（C.inconspicua、）；近平滑假絲酵母菌（C.parapsilosis）、 C.orthopsilosis 和C.metapsilosis；Dhiman等評(píng)估了布魯克系統(tǒng)對(duì)138種常見(jiàn)和103種不常見(jiàn)酵母菌株的鑒定情況，該系統(tǒng)種水平的鑒定準(zhǔn)確率分別可達(dá)96%和85%[13]。對(duì)于鑒定冷僻菌種如無(wú)名假絲酵母菌（C.famata）等，MALDI-TOF MS可能優(yōu)于目前其它系統(tǒng)[14]。

絲狀真菌的表型易變，其蛋白質(zhì)譜可隨生長(zhǎng)條件及分析菌絲區(qū)域的不同而變化。De Carolis等人使用布魯克Biotyper系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了曲霉菌（Aspergillus species）、鐮刀菌（Fusarium species）和毛霉菌（Mucorales）的數(shù)據(jù)庫(kù)，并用于94株菌的鑒定，其種水平的正確率高達(dá)97%[15]。 Iriart等人利用VITEK MS 成功鑒定了44株曲霉菌中的82%的菌[16]。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)建立的不斷完善，皮膚癬菌是可被鑒定的。初步研究表明，假霉樣真菌（Pseudallescheria）/絲孢酵母屬（Scedosporium）復(fù)合群可被鑒定。Lau等人使用一種特殊的真菌提取流程檢測(cè)了421株霉菌，其種水平與屬水平的鑒定準(zhǔn)確率分別是88.9%和4.3%[17]。

2 細(xì)菌、病毒及其它病原體基因型快速診斷

2.1 DNA靶向測(cè)序 對(duì)于純培養(yǎng)的微生物可以進(jìn)行DNA序列的靶向測(cè)序。靶基因的保守區(qū)往往是PCR引物和DNA測(cè)序引物退火結(jié)合的區(qū)域?？勺儏^(qū)具有獨(dú)特的核苷酸序列，從而實(shí)現(xiàn)基于測(cè)序的特定菌株屬和種的鑒定。鑒定細(xì)菌最常用的靶序列是16S rRNA基因（16S rDNA），它是一個(gè)約1 500 bp的基因，編碼核糖體30S亞基的一部分。部分（500 bp）16S rRNA基因測(cè)序常用革蘭陰性、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、厭氧菌與分枝桿菌的序列鑒定。對(duì)于部分16S rRNA基因序列高保守性的菌屬，全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序或其它靶DNA測(cè)序可能有助于鑒別鑒定?；跍y(cè)序細(xì)菌鑒定的其它靶DNA序列包括rpoB基因（細(xì)菌RNA聚合酶β亞基）、tuf（延伸因子Tu）、gyrA或gyrB基因（促旋酶A或B）、sodA（含錳超氧化物歧化酶）和熱休克蛋白基因等。雖然其它靶序列在種屬分辨上比16S rRNA基因更好，但由于這些序列不夠保守，可能需要屬或群特異性的PCR或DNA測(cè)序引物，且其能夠利用的序列數(shù)據(jù)比現(xiàn)有16S rRNA基因要少。鑒定酵母菌和醫(yī)學(xué)相關(guān)霉菌的潛在靶序列包括Internal transcribed spacer regions ITS1和ITS2，它們作為可變區(qū)定位于編碼18S、5.8S和28SrRNA的保守基因之間、及28S rRNA基因的D1-D2區(qū)。鑒定微生物用的DNA靶向測(cè)序結(jié)果與公開(kāi)的（如GenBank）和/或私有的（如MicroSeq）數(shù)據(jù)庫(kù)的參考序列進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)比較查詢序列和參考序列，兩者之間存在的非匹配核苷酸數(shù)量將用來(lái)確定兩者的相關(guān)性，最終的結(jié)果報(bào)告為序列一致性百分比。在屬或種的水平，鑒定微生物界定的可接受序列一致性百分比的數(shù)值是不同的，這取決于DNA靶序列及微生物本身的特性。多數(shù)細(xì)菌的16S rRNA基因?yàn)槎嗫截惏谢?，一個(gè)微生物的16S rRNA基因序列若有變異，可能產(chǎn)生難以解釋的序列數(shù)據(jù)。臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute）刊發(fā)了一份廣泛認(rèn)可的共識(shí)文件以指導(dǎo)DNA靶向測(cè)序技術(shù)在屬和種的水平鑒定微生物；對(duì)即將或已經(jīng)實(shí)施DNA靶向測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室人員而言，這份文件是一份有用的指南手冊(cè)[18]。未來(lái)全基因組測(cè)序在臨床上將變得更為常規(guī)化，可為臨床提供種多樣性、毒力特性、流行病學(xué)、耐藥機(jī)制及病因?qū)W信息。

2.2 電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的分析 將電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的分析，可以實(shí)現(xiàn)基于PCR技術(shù)的細(xì)菌鑒定，發(fā)揮這一功能的質(zhì)譜稱之為PCR電噴霧離子化質(zhì)譜（PCR/ ESI-MS）。它檢測(cè)的是經(jīng)PCR擴(kuò)增后的廣譜基因（例如rRNA）和特定基因的質(zhì)量，而非細(xì)菌蛋白質(zhì)的質(zhì)量。電噴霧離子化質(zhì)譜的檢測(cè)精度能夠確保通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增DNA的質(zhì)量，精確地計(jì)算出擴(kuò)增DNA的核苷酸組分。通常，PCR反應(yīng)的檢測(cè)與分析都是成組地批量進(jìn)行的。通過(guò)分析哪個(gè)PCR反應(yīng)能夠給出擴(kuò)增產(chǎn)物，并結(jié)合其核苷酸組分信息，就可能對(duì)待檢微生物做出鑒定。該方法在概念上與廣譜PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序的鑒定方法非常類似；但不同之處在于，質(zhì)譜提供的是，核苷酸序列未知情況下，堿基（構(gòu)成）組分信息。通過(guò)分析微生物基因組的多個(gè)靶位點(diǎn)，可以彌補(bǔ)與核苷酸序列相比核苷酸組分提供的信息量偏低的不足。Simneret等近期評(píng)價(jià)了PLEX-ID廣譜真菌檢測(cè)試驗(yàn)（Abbott，Abbott Park，IL）對(duì)91株特定真菌的鑒定效果，屬與種水平的鑒定準(zhǔn)確率分別為95.6%和81.3%[19]。相比測(cè)序法，PCR/ESI-MS的優(yōu)勢(shì)是快速和高通量。

2.3 復(fù)合感染病原體的快速診斷 在一個(gè)或多個(gè)體系擴(kuò)增通用保守序列或特異性片段，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)偶聯(lián)在熒光微球體或固相芯片上的通用序列（抗標(biāo)簽）進(jìn)行分揀。這些數(shù)據(jù)隨后通過(guò)分析軟件進(jìn)行分析以檢測(cè)的各類病原體/亞型是否存在，即目前所謂的PCR-液相芯片/固相芯片雜交技術(shù)。市場(chǎng)已見(jiàn)產(chǎn)品有Luminex xMAP和bioMérieux FilmArray。一次可以檢測(cè)多個(gè)病原體（細(xì)菌、真菌、病毒與寄生蟲(chóng)）；也可以檢測(cè)不同類別的感染標(biāo)本（血液、呼吸道分泌物、糞便與腦脊液）。

3 臨床微生物感染的快速診斷

3.1 G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原 由于廣譜抗生素的使用、侵襲性操作、腫瘤放化療及老年患者免疫功能的下降，導(dǎo)致侵襲性真菌感染不斷增加，真菌形態(tài)學(xué)及鑒定（生化反應(yīng)）困難，有關(guān)侵襲性真菌感染需要開(kāi)展G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)?？梢赃_(dá)到快速診斷侵襲性真菌感染并區(qū)分其感染的病原體。

3.2 內(nèi)毒素與外毒素 內(nèi)毒素和外毒素是細(xì)菌產(chǎn)生的兩大類毒素物質(zhì)。內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，它是磷酸一多糖一蛋白質(zhì)的復(fù)合物。外毒素是病原菌在代謝過(guò)程中分泌到菌體外的物質(zhì)。產(chǎn)生外毒素的細(xì)菌主要是一些革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，少數(shù)革蘭陰性菌如霍亂弧菌和產(chǎn)毒性大腸桿菌等也能產(chǎn)生外毒素。目前臨床微生物檢驗(yàn)?zāi)軌蜷_(kāi)展的是內(nèi)毒素，難辨梭狀芽胞桿菌A、B毒素，幽門螺桿菌尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)基因CagA和空泡毒素VacA的檢測(cè)。

難辨梭狀芽胞桿菌是一種能形成芽胞的革蘭陽(yáng)性厭氧桿菌，偽膜性腸炎的病原體。大便厭氧培養(yǎng)對(duì)難辨梭狀芽孢桿菌檢出率較低，靠培養(yǎng)方法來(lái)診斷難辨梭狀芽孢桿菌相關(guān)性腹瀉（CDAD）很困難。確診CDAD通常需要采用組織培養(yǎng)法（CCNA）。CCNA可以檢測(cè)出低至1 pg的毒素，被公認(rèn)為是檢測(cè)難辨梭菌毒素的金標(biāo)準(zhǔn)，但是CCNA費(fèi)時(shí)且復(fù)雜，故在臨床實(shí)施困難。目前檢測(cè)大便CD毒素A、B則成為快速診斷CDAD的主要手段。幽門螺桿菌是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌的主要致病因素，其菌體抗體檢測(cè)有其局限性，其致病性物質(zhì)有尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)基因CagA和空泡毒素VacA。

3.3 病原體IgM 病原體感染刺激機(jī)體產(chǎn)生早期IgM和恢復(fù)期IgG，IgM對(duì)于快速的早期感染診斷具有一定價(jià)值，目前檢測(cè)包括嗜肺軍團(tuán)菌（LP）、肺炎支原體（MP）、Q熱立克次體（COX）、肺炎衣原體（CP）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型流感病毒（IFA）、乙型流感病毒（IFB）、副流感病毒1、2和3型（PIVS）。

3.4 超敏C反應(yīng)蛋白、炎癥細(xì)胞因子、PCT C反應(yīng)蛋白是由肝臟合成的一種全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標(biāo)志物，是心血管事件危險(xiǎn)最強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子之一。超敏C反應(yīng)蛋白能準(zhǔn)確的檢測(cè)低濃度C反應(yīng)蛋白，提高了試驗(yàn)的靈敏度和準(zhǔn)確度，是區(qū)分低水平炎癥狀態(tài)的靈敏指標(biāo)，血清hs-CRP 水平與動(dòng)脈粥樣硬化及急性腦梗死（ ACI） 的發(fā)生、嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān) 。

炎癥細(xì)胞因子是指參與炎癥反應(yīng)的各種細(xì)胞因子。起主要作用的是TNF-α 、IL-1β、IL-6、IL-8等。TNF-α是炎癥反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。IL一6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑。IL-8能刺激中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化，促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放彈性蛋白酶，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使微循環(huán)血流淤滯，組織壞死，造成器官功能損傷。

降鈣素原（PCT）是無(wú)激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，PCT主要是在細(xì)菌毒素和炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生，病毒感染或自身免疫病時(shí)水平很低；血清PCT水平高低還反映疾病的嚴(yán)重狀態(tài)，也是判斷預(yù)后和評(píng)價(jià)療效的良好指標(biāo)，是膿毒癥的診斷、預(yù)后及治療監(jiān)測(cè)的評(píng)估指標(biāo)。上述三者聯(lián)合檢測(cè)有助于感染類型的甄別。

3.5 病原體快速藥敏試驗(yàn) 經(jīng)典的藥敏試驗(yàn)有K-B紙片擴(kuò)散法、微量液體稀釋法和E-test，孵育18～24 h判讀結(jié)果，不能滿足臨床需要。dRAST通過(guò)微孔和微流控板，將細(xì)菌數(shù)量通過(guò)成像技術(shù)顯示，常規(guī)細(xì)菌4 h、結(jié)核分枝桿菌1周報(bào)告報(bào)告藥敏結(jié)果。

4 展望

臨床微生物檢驗(yàn)采用成熟的技術(shù)為患者服務(wù)，性能穩(wěn)定、結(jié)果可靠，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床微生物檢驗(yàn)需要分選。作為臨床微生物檢驗(yàn)工作者，既要守住形態(tài)學(xué)基本功，又要掌握分子生物學(xué)前沿技術(shù)應(yīng)用于臨床微生物檢驗(yàn)，拓展微生物與感染、抗生素與耐藥、致病性等相關(guān)知識(shí)，更好為人類健康服務(wù)。

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R446.5

A

1671-2587（2017）01-0099-04

2016-05-25）

（本文編輯：姚萍）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.01.030

230061 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

徐元宏（1964–），男，安徽無(wú)為人，主任技師，碩士，主要從事臨床微生物研究，（E-mail）xyhong1964@163.com。