陳遂+黃景晟+王娟

摘要：采用超聲波-SDS協(xié)同體積分?jǐn)?shù)70 %的乙醇提取雞蛋花總黃酮，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：SDS濃度3.0 CMC（3.0×8.2 mmol/L），提取時(shí)間25 min，液料比25∶1（mL/g），在此條件下雞蛋花總黃酮得率為1.59±0.061 %。對雞蛋花總黃酮清除DPPH·、·OH及O-2 ·三種自由基能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，雞蛋花總黃酮具有良好的自由基清除效果，其中對·OH清除率最高，三種自由基清除率隨總黃酮濃度增加而增大。研究結(jié)果可為雞蛋花黃酮類物質(zhì)的開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：雞蛋花；總黃酮；超聲波；提?。蛔杂苫宄?/p>

中圖分類號： TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.03.009

雞蛋花，又名蛋黃花、擂捶花、大季花，系夾竹桃科植物雞蛋花（Plumeria rubra L. var. acutifolia，別名緬梔子），原產(chǎn)南美，在中國主要分布于廣東、福建、廣西及云南等地區(qū)[1]。雞蛋花富含黃酮類、萜類等多種活性成分，具有抗焦慮、抗菌及抑制HIV病毒等生物功能[2]。此外，雞蛋花作為中藥材，具有清熱祛濕、潤肺解毒、止咳化痰等藥理作用[4]。目前，關(guān)于雞蛋花的研究主要集中于雞蛋花揮發(fā)油化學(xué)成分的分析檢測方面[1-3]，而關(guān)于雞蛋花黃酮類成分的抗氧化研究未見報(bào)道。

黃酮類化合物因其顯著有效的抗氧化活性而一直作為研究重點(diǎn)并被廣泛用于食品、藥品、日化等領(lǐng)域。醇提法操作簡單、工藝成熟，是目前提取黃酮類化合物的常用方法。當(dāng)輔以超聲波時(shí)，超聲波可通過空化效應(yīng)破壞植物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，使溶劑向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散并促使胞內(nèi)有效成分溶出，因而可縮短提取時(shí)間[11]。另外，表面活性劑能降低溶劑與植物組織之間的表面張力，使植物組織被充分浸潤，加速溶劑深入組織內(nèi)部，促進(jìn)活性成分溶出[5]，如陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）在黃酮類化合物提取方面具有明顯的增效作用[6]。

本研究采用超聲波-SDS協(xié)同醇提法提取雞蛋花總黃酮，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并對雞蛋花總黃酮清除自由基能力進(jìn)行測定，從而評價(jià)其抗氧化活性。本研究所建立的工藝方法可為植物黃酮類物質(zhì)的高效提取提供參考，同時(shí)，研究結(jié)果為后期雞蛋花黃酮類化合物單體的分離、鑒定以及單體抗氧化活性的測定奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋花：洗凈、烘干、粉碎后裝袋備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所，純度99.1%。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.2mg/mL）的配制：稱取10.0mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶解，于50mL容量瓶中定容并搖勻。

1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）： 美國Sigma公司；SDS、乙醇、鄰苯三酚、水楊酸、Al（NO3）3、NaNO2、FeSO4、H2O2、NaOH、Na2S2O3、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010紫外可見分光光度計(jì)：日本HITACHI公司；202-3電熱恒溫干燥箱：鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；KQ-250臺(tái)式超聲波清洗器：蘇州江東精密儀器有限公司；5417C高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市精達(dá)儀器制造廠；AL104電子天平：梅特勒—托利多（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雞蛋花總黃酮提取 稱取2.0 g雞蛋花粉末置于體積分?jǐn)?shù)70 %的乙醇中，加入SDS，然后超聲（300 W）提取總黃酮。提取液離心（5000 r/min，10min）后取上清并定容至100mL，測定總黃酮質(zhì)量，由下式計(jì)算總黃酮得率：

得率（%）=（m/W）×100

式中，m為總黃酮質(zhì)量g；W為雞蛋花粉末質(zhì)量g。

1.3.2 總黃酮含量測定 參考馬祥[7]等的方法并作改進(jìn)。吸取1.0 mL上清樣品于10mL標(biāo)準(zhǔn)比色管，加體積分?jǐn)?shù)60 %的乙醇至5.0mL；加0.3mL 50 g/L的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min；加0.3mL 100g/L的Al（NO3）3溶液，搖勻靜置6min；加4.0mL 40g/L的NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，靜置20 min后倒入比色皿，在波長510nm處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為對照，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y =7.78x + 0.0036，R2 = 0.9982，其中y為吸光度，x為蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL）求得樣品中總黃酮質(zhì)量并計(jì)算出得率。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)：依據(jù)我們前期試驗(yàn)結(jié)果，分別考察SDS濃度、提取時(shí)間及液料比三個(gè)主要因素對雞蛋花總黃酮得率的影響，并確定各因素最優(yōu)水平。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為響應(yīng)指標(biāo)，建立SDS濃度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）及空白（D）的四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，考察各因素對響應(yīng)指標(biāo)影響的顯著性并確定提取總黃酮最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.3.4 清除自由基能力測定

清除DPPH·能力測定：參考吳瓊英[8]等的方法并作改進(jìn)。將總黃酮上清樣品稀釋成一系列濃度的溶液，將每一稀釋度溶液加于2支10 mL試管中，每支試管加2 mL，一支試管再加1×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液2mL，一支試管再加乙醇2 mL，充分混勻并置暗處孵育30min，離心（3000 r/min， 10 min）后取上清于波長517 nm處測定吸光度。由下式計(jì)算DPPH·清除率（I1）：

I1（%）= [1 - （Ai - Aj） / A0] ×100

式中，Ai為2mL總黃酮溶液+2mLDPPH溶液的吸光度；Aj為2mL總黃酮溶液+2mL乙醇的吸光度；A0為2mLDPPH溶液+2mL乙醇的吸光度（參比）。

清除·OH能力測定： 參考候?qū)W敏[9]等的方法并作改進(jìn)。將總黃酮上清樣品用dd水稀釋成一系列濃度的溶液。取10 mL試管若干，分別依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL以及不同濃度總黃酮樣品溶液2 mL（空白對照以dd水代替總黃酮溶液），最后加入8.8 mol/L H2O2溶液2 mL，混勻并于37℃水浴30min，離心（3，000 r/min， 10 min）后取上清于波長510nm處測定吸光度，參比溶液以dd水代替H2O2。由下式計(jì)算·OH清除率（I2）：

I2（%）= [1 - （Ax - Ax0） / A0]×100

式中，A0為空白對照吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；Ax0為參比溶液吸光度。

取10 mL試管若干，分別加入pH 8.2的Tris-鹽酸緩沖液4.5 mL，25 ℃水浴20min，各試管再加入不同濃度的總黃酮樣品溶液0.2mL及30℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL（以10mmol/L鹽酸溶液配制），混勻后25℃水浴4min，立即加4滴8mol/L鹽酸終止反應(yīng)。以蒸餾水作空白對照，于波長325nm處測定吸光度。由下式計(jì)算 ·清除率（I3）：

I3（%）= （A0 - An） / A0 ×100

式中，A0為空白對照吸光度；An為加入樣品溶液后的吸光度。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SAS 8.2（SAS Institute Inc.， Cary， NC， USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異比較采用t檢驗(yàn)法。所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)取均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 SDS濃度對雞蛋花總黃酮得率的影響

室溫下，SDS在水中的臨界膠束濃度（critical micell concentration， CMC）為8.2 mmol/L[10]。不同倍數(shù)CMC的SDS對雞蛋花總黃酮得率的影響，如圖1：

由圖1可知，在SDS濃度1.0-3.0 CMC時(shí)，雞蛋花總黃酮得率隨溶液中膠束的增加而提高。此后，隨著SDS濃度增加，過多的表面活性劑形成過于緊密的膠束系，可能會(huì)對總黃酮的浸出產(chǎn)生抑制作用，從而使總黃酮得率略有下降并趨于穩(wěn)定。

2.1.2 提取時(shí)間對雞蛋花總黃酮得率的影響

提取時(shí)間對雞蛋花總黃酮得率的影響，如圖2：

由圖2可知，在提取時(shí)間5～25min時(shí)，雞蛋花總黃酮得率隨提取時(shí)間的增加而提高。此后隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮得率不斷降低。分析原因可能是長時(shí)間超聲會(huì)對SDS形成的膠束結(jié)構(gòu)造成破壞，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出，從而降低了總黃酮得率。

2.1.3 液料比對雞蛋花總黃酮得率的影響

液料比對雞蛋花總黃酮得率的影響，如圖3：

由圖3可知，液料比5∶1～20∶1時(shí)，雞蛋花總黃酮得率隨液料比增加而提高較快。此后，液料比增加，總黃酮得率提高緩慢并將趨于穩(wěn)定。盡管整體看，液料比越大，總黃酮得率越高，但過大的液料比會(huì)造成高能耗和溶劑浪費(fèi)，且有較多雜質(zhì)溶出，因此考慮到節(jié)能及提高效率，液料比不宜過大。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，如表1：

由表1可知，各因素對雞蛋花總黃酮得率的影響大小順序?yàn)椋篊 > A > B；最優(yōu)提取工藝為A2B2C3，即SDS濃度3.0CMC，提取時(shí)間25 min，液料比25∶1。此工藝下雞蛋花總黃酮提取得率最高：1.59±0.061 %。

方差分析（如表2）結(jié)果表明，液料比對雞蛋花總黃酮得率有顯著性影響。

2.3 清除自由基能力測定結(jié)果與分析

雞蛋花總黃酮清除自由基能力的測定結(jié)果如圖4：

3 結(jié)論

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