余霖 陳慶愷 何子毅

·綜述·

核酸檢測應注意的幾個問題*

余霖 陳慶愷 何子毅

核酸檢測 Cobas s201 樣本 試劑使用率 儀器維護

提高經(jīng)血傳播傳染病的檢出率，降低經(jīng)血傳播傳染病一直是保證血液安全的重要課題。酶聯(lián)免疫法（ELISA）作為傳統(tǒng)檢測手段，由于方法學上的局限性，加之“窗口期”較長等原因，存在漏檢現(xiàn)象，嚴重影響輸血安全性[1]。而核酸檢測（Nucleic acid test，NAT）對象為病毒核酸，可以明顯縮短ELISA的“窗口期”[2]；此外，NAT還可以檢測出因病毒變異、免疫靜默感染等造成的漏檢[3]。歐美國家在20世紀90年代陸續(xù)將NAT納入常規(guī)血液篩查中，我國2012年發(fā)布的《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》中，明確提出了“到2015年，血液篩查核酸檢測基本覆蓋全國”的目標[4]。我站從2004年開始科研性地應用核酸檢測無償獻血者血樣本，已完成了50多萬例次的核酸樣本檢測，在樣本管理、試劑管理、設(shè)備管理和防污染方面積累了一定的經(jīng)驗，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 樣本管理 在影響血液篩查結(jié)果的眾多因素中，樣本因素是首要的。在我國，涉及到NAT樣本要求的法規(guī)主要包括《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）》、《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》、《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》等?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程（2015版）》于2016年3月1日正式實施，各級采供血機構(gòu)必須執(zhí)行，該法規(guī)對樣本管理提出了明確要求，用于血樣采集的樣本管應采用EDTA-K2

抗凝劑且為帶有分離膠的真空負壓試管，同時對樣本的離心條件和保存運輸溫度作了較詳細的規(guī)定。在《血站核酸檢測實驗室質(zhì)量保證指南》中還規(guī)定了核酸樣本采集后離心的時間要求、核酸樣本的質(zhì)量核查要求，即無溶血、無稀釋、無脂血、足量，并且樣本管完整、標識符合規(guī)范，對不合格樣本管理也作了具體規(guī)定，存在質(zhì)量問題的樣本一般在樣本交接時目視判斷。羅氏核酸檢測試劑說明書建議EDTA-K2抗凝全血在2℃～25℃下可保存48 h，隨后在2℃～8℃下可保存72 h，血漿分離后在2℃～8℃下可保存7 d，在低于–18℃下可保存20 d，最多可凍融3次。

在實際工作中，絕大多數(shù)情況下按照試管生產(chǎn)廠家提供的離心參數(shù)（如BD核酸專用試管推薦的離心參數(shù)為：25℃，1 100 g離心力，離心10 min），可以實現(xiàn)離心后分離膠將血漿和紅細胞分隔，但仍有離心后分離膠未完全分隔血漿和紅細胞的情況?；仡?013年1月～2015年8月混樣失敗的數(shù)據(jù)，以夏季炎熱月份明顯多于其他月份，表現(xiàn)為離心后有分離膠液滴漂浮在血漿表面，混樣時分離膠液滴堵塞加樣針頭引起失敗。出現(xiàn)上述情況的原因可能是分離膠在高溫下變性，也可能與試管本身的質(zhì)量或試管的運輸、儲存條件有關(guān)；混樣失敗還與抗凝不充分時有纖維蛋白析出和嚴重脂肪血樣本在低溫保存后血漿上層出現(xiàn)白色脂肪滴有關(guān)。

核酸樣本采集后要求在4 h內(nèi)送抵實驗室，若不能保證就要在采血現(xiàn)場離心，因此部分采血點要配備離心機，樣本離心后放置4℃±2℃冰箱保存，核酸樣本從采血點運送到實驗室一般采用冷藏運輸箱。但在運輸過程中，箱內(nèi)實際溫度可能已高于2℃～10℃，尤其在夏季更難保證。姚鳳蘭等[5]分析不同溫度、時間和不同采血管對諾華NAT結(jié)果的影響，結(jié)果顯示聯(lián)檢陽性的樣本最好在2 d內(nèi)鑒別檢測。本實驗室也對不同溫度下不同濃度陽性樣本檢出率做了初步比較，結(jié)果顯示室外溫度（30℃左右）、室溫（25℃左右）和冷藏冰箱（4℃±2℃）條件下，高、中、低3種濃度陽性樣本檢出率沒有明顯差異。這說明當環(huán)境溫度符合羅氏核酸試劑對標本要求時，仍能保證檢測的靈敏度和準確度，尚需進一步證實。

總之，應使用核酸檢測專用試管，采血時按規(guī)范要求完成樣本的抗凝處理，嚴格按照核酸試管生產(chǎn)廠家的離心要求操作、4 h內(nèi)離心，2℃～10℃保存運輸，72 h內(nèi)完成檢測。

2 試劑管理 目前核酸試劑的成本較高?；仡?013年1月～2016年1月我站試劑使用數(shù)據(jù)，平均每年的試劑有效使用率{試劑有效使用率=每月實際檢測人份數(shù)/[每月試劑使用總測試孔數(shù)×480（1盒試劑可做480人份）/96（1盒試劑可做96孔測試）]×100%}在逐步提高，2015年已達86%以上，2016年達90%左右；影響試劑有效使用率的因素主要為日常室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評、單獨檢測血小板樣本和混檢陽性樣本拆分等[6]。由于加強了實驗室人員的培訓和儀器的維護保養(yǎng)，使人為因素和儀器故障引起的試劑損耗大大減少，試劑的主要損耗為單獨檢測血小板樣本。當我站獻血服務科外采組休息停止采血時，檢測總樣本數(shù)少于120人份，即未達到核酸“滿架”數(shù)量，由于單采血小板的臨床需求及有效期短，在采集和運輸血小板標本已占去1 d的情況下，第2 d就應檢測單采血小板樣本。因參與混檢樣本數(shù)減少，相應的混檢測試數(shù)也減少，使得用于陰陽對照和日常室內(nèi)質(zhì)控的測試數(shù)所占比例增加，導致試劑有效使用率降低；混檢陽性后的拆分也使有效使用率降低，也是不滿架的原因。國內(nèi)有學著認為室間質(zhì)評樣本與已知NAT陰性樣本進行混檢，既符合質(zhì)評樣本按常規(guī)樣本檢測對待的原則，又能節(jié)約試劑成本，并加快血液放行速度[7]，這也是提高試劑有效使用率的方法。盡量實現(xiàn)“滿架上機”，即每天僅采用一套核酸檢測系統(tǒng)，除了做室內(nèi)質(zhì)控的那一架為114個樣本外，其他盡量為120個或120的倍數(shù)。今年，我站供血部門建立并完善了預約發(fā)放單采血小板的制度，能有效減少單獨檢測血小板樣本造成的試劑損耗，進一步提高了試劑有效利用率。

3 設(shè)備管理 使用時嚴格依照操作規(guī)程要求做好日常維護。日常維護中，混樣儀用75%乙醇擦拭Core-Tip金屬擋板，丟棄廢物桶中垃圾，并更換新垃圾袋，用75%乙醇清潔儀器外罩；提取儀用75%乙醇擦拭定位樁、機內(nèi)平臺，并清潔試劑針頭，清潔樣本處理單元（SPU）鉗子的抓手，清潔當天要用到的試劑架、樣本架和SPU架，擦拭K-carrier，清潔儀器外罩。開始試驗前要注意實驗室的溫濕度，尤其在夏季高溫高濕條件下，要提前打開空調(diào)降溫除濕，使溫度不高于25℃，濕度不高于70%，以免儀器在運行時出現(xiàn)意外故障。儀器的液路管道系統(tǒng)方面要注意2個洗液導管中是否有氣泡，注射器是否有滲漏和結(jié)晶。若洗液導管中氣泡量少且較小，可以用手指輕彈有氣泡的導管；若氣泡較多、體積較大，可以嘗試用軟件系統(tǒng)中的長沖洗功能；若長沖洗后仍有氣泡，可能是液路系統(tǒng)的氣密性有問題，建議聯(lián)系工程師檢查液路系統(tǒng)。日常維護時要注意軟件系統(tǒng)中的其他維護提示，及時對有關(guān)部件進行周期性維護和更換。COBAS@ TaqMan（CTM）維護主要是擦拭機內(nèi)定位樁、工作平臺和K-carrier，清潔儀器外罩。以上維護過程中最好使用無紡布擦拭和清潔，以免有線頭或纖維絲落入儀器內(nèi)部，增加污染和導致儀器故障。準備耗材時，有條形碼的卡條必須檢測其松緊度，可將卡條放置在樣本架（SK24）卡槽內(nèi)，觀察其自由下落的情況，若下落到卡槽內(nèi)的距離較深，說明卡條位置較松，卡條必須丟棄?？l與S-tube結(jié)合過緊也需丟棄。將SPU裝載到SPU架子時，一定要按箭頭方向并靠右側(cè)孔位放置，放置時用力按壓使每個SPU都與架子緊密相貼。

試劑的平衡需在儀器內(nèi)完成，以免從冰箱取出時溫度較低遇到水汽凝集而導致模糊難辨，影響儀器對試劑的識別，一般做完維護后就可以放入[8]。試劑放入時要與上次所使用的提取儀型號相對應，以免出現(xiàn)試劑數(shù)量識別錯誤的情況。需要注意的是每組試劑都有3個有效期的限制，即試劑本身的有效期，在儀器內(nèi)累計不能超過40 h，開啟后累計不能超過20 d，且同一組試劑里，后2個的時間不能相差過大，否則儀器會判定試劑失效。

4 防污染管理 核酸檢測的潛在污染可能來自以下幾個方面：擴增產(chǎn)物、室內(nèi)/室間質(zhì)控物、實驗室環(huán)境中的污染物及陽性樣本。s201針對潛在污染具備4種防污染設(shè)計：全自動封閉系統(tǒng)并內(nèi)置紫外燈；即插即用型試劑盒；閉管進，閉管出；AmpErase酶（尿嘧啶-N-轉(zhuǎn)葡萄糖激酶）。全自動封閉系統(tǒng)、即插即用型試劑盒以及S-tube在進入和離開儀器時都保持閉管狀態(tài)，可有效阻止實驗室環(huán)境中的污染物影響檢測結(jié)果的準確性；內(nèi)置紫外燈和AmpErase酶可有效防止儀器內(nèi)可能殘留的擴增產(chǎn)物對實驗的影響。

擴增產(chǎn)物是最容易出現(xiàn)的污染，通常一次典型的PCR擴增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列，若氣溶膠化，最小的氣溶膠都會含有106拷貝的擴增產(chǎn)物，這些氣溶膠的累積會污染實驗室內(nèi)的試劑、儀器設(shè)備和通風設(shè)備，使檢測結(jié)果出現(xiàn)異常[9]。實驗室污染的征兆主要表現(xiàn)為出現(xiàn)大量異常結(jié)果，尤其是陰性、陽性對照結(jié)果異常，如陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果、陽性對照出現(xiàn)非對應項目的陽性等。

防止室內(nèi)/室間質(zhì)控物與樣本及樣本間的交叉污染，需要操作人員在開蓋、轉(zhuǎn)移樣本架等過程中防止液體飛濺，并以無菌操作完成相關(guān)操作。每次實驗室開始前和結(jié)束后應認真完成儀器的例行維護，用500 mg/L（2 000 mg/L）二溴海因?qū)嶒炇遗_面和地面進行清潔，并用紫外線和臭氧對實驗室空氣進行消毒，也能有效消除擴增產(chǎn)物遺留造成的污染。

實驗室環(huán)境中的污染包括混樣后的SK24架通過傳遞窗傳送，傳遞窗為密封嚴實的雙開門，且相互連鎖，當一側(cè)的門未關(guān)嚴時，另一側(cè)的門無法打開；全自動開蓋機使用前做好確認工作，保障開蓋過程不會造成樣本間的交叉污染[10]。每次開蓋后及時拿走已開蓋的樣本，防止儀器在丟棄蓋子時有液體飛濺導致其他意外的污染。防止氣溶膠產(chǎn)生的污染可以通過設(shè)置實驗室不同分區(qū)間空氣的流動方向來實現(xiàn)。我們根據(jù)自身條件將核酸實驗室分為2部分：標本混樣區(qū)和提取擴增檢測區(qū)，2區(qū)分別有相互獨立且不互通的排風系統(tǒng)，一方面能將本區(qū)內(nèi)產(chǎn)生的氣溶膠及時排除，另一方面2區(qū)之間的空氣不會相互流通，避免其間可能的氣溶膠交換。室內(nèi)/室間質(zhì)控物和樣本分別存放于標本混樣區(qū)指定區(qū)域，避免其與提取擴增檢測區(qū)中提取和擴增檢測儀器可能的接觸，也防止?jié)撛诘年栃詷颖緦嶒炇噎h(huán)境和儀器的污染。

經(jīng)過這些年來對s201的使用，我們認為該檢測系統(tǒng)自動化和智能化程度高，人為干擾因素少。質(zhì)量保證的關(guān)鍵還是樣本質(zhì)量和操作人員規(guī)范化操作的執(zhí)行力度。防污染的思想在實驗室設(shè)計時就應考慮到，并貫穿于SOP和工作人員的培訓中。沒有合格的樣本、合格的操作者，再好的儀器也不能發(fā)揮其功能。

1 趙俊鵬，田喜鳳，賈幼珍，等. 血液病毒核酸檢測與酶聯(lián)免疫檢測比較研究[J].中國病原生物學雜志，2011，10（5）：732-735.

2 Wiedmann M，Kluwick S，Walter M，et al. HIV-1，HCV and HBV seronegative window reduction by the new Roche cobas TaqScreen MPX test in seroconverting donors[J]. J Clin Virol，2007，39（4）：282-287.

3 王悅，韓玲，趙偉平.20例輸血感染案例引起的思考[J].中國輸血雜志，2002，6（15）：216-218.

4 衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃[EB/OL]. [2 0 1 5-09-16]. http：//www.gov.cn/zwgk/2012-10/19/content_2246908.htm.

5 姚鳳蘭，陳瑜，汪德海，等. 標本保存溫度、時間和不同采血管對核酸檢測結(jié)果的影響[J].中國輸血雜志，2012，25（6）：530-533.

6 寸偉，何清，張珂，等.血液篩查實驗室核酸檢測試劑損耗控制的探討[J].中國輸血雜志，2014，27（2）：166-168.

7 王慶敏，蔣呢真，朱紹汶，等.室間質(zhì)評樣本混樣核酸檢測模式的探討[J].中國輸血雜志，2012，25（12）：1297-1298.

8 陳科，馬洪濱，李，等.羅氏COBAS AmpliPrep全自動PCR分析儀的應用與維護[J].中國醫(yī)學裝備，2013，10（11）：125-126.

9 李金明. 實時熒光PCR技術(shù)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2014.

10 汪德海，葛紅衛(wèi).自動開蓋機在血站核酸檢測實驗室使用前確認[J].中國輸血雜志，2012，25（6）：536-537.

R392.11

A

1671-2587（2017）05-0528-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.038

*本課題受廣東省東莞市醫(yī)療衛(wèi)生一般項目（No.2015105101245）資助

523930 廣東省東莞市中心血站

余霖（1978–），男，江西九江人，主管檢驗師，主要從事血液核酸檢測研究，（E-mail）yulin587@126.com。

2016-03-06）

（本文編輯：姚萍）