潘星燕，陸云霞，姚 軍,2

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河北石家莊 050018)

高效液相色譜法測定芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)

潘星燕1，陸云霞1，姚 軍1,2

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河北石家莊 050018)

為建立測定芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)的方法，采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相A為乙腈，流動相B為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀，流速為0.8 mL/min，按照梯度洗脫，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為250 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果表明：主藥與各雜質(zhì)、各雜質(zhì)之間分離度良好，各雜質(zhì)均能被有效檢出；芒柄花素磺酸鈉及雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)和G的質(zhì)量濃度分別在0.060～4.004(r=0.999 8)，0.056～3.756(r=0.999 3)，0.039～3.902(r=0.999 6)，0.060～4.026(r=0.999 5)，0.058～3.878(r=0.999 3)，0.058～3.869(r=0.999 5)，0.060～3.977(r=0.999 5)和0.040～3.952 μg/mL(r=0.999 4)范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系；儀器精密度、中間精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值小于2.0%；各雜質(zhì)測定的平均回收率為98.49%～101.76%，RSD值為0.37%～1.37%(n=9)。本方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、耐用性良好，可用于芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)的測定。

色譜分析；芒柄花素磺酸鈉；高效液相色譜法；梯度洗脫；有關(guān)物質(zhì)

芒柄花素磺酸鈉為天然異黃酮經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的全新化合物[1]，是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家Ⅰ類新藥，在心腦血管中的藥理活性已通過藥理藥效學(xué)試驗(yàn)并得到了很好的證實(shí)[2-4]。已完成的安全性評價研究證明，芒柄花素磺酸鈉的毒副作用小，安全性優(yōu)于其他溶栓藥和抗血栓藥[5-6]。芒柄花素磺酸鈉為臨床治療心腦血管疾病提供了一種新的選擇，具有良好的市場前景。

芒柄花素磺酸鈉為臨床治療缺血性腦中風(fēng)提供了一種新的選擇，具有良好的市場前景，對其有關(guān)物質(zhì)的研究具有重要的意義。目前，只有高效液相色譜法測定芒柄花素含量[7-11]。為規(guī)范該候選藥物的臨床前研究，為臨床實(shí)驗(yàn)提供質(zhì)量可控的大量樣品，本研究對其有關(guān)物質(zhì)的分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用高效液相色譜(HPLC)法，以對甲氧基苯乙酸和間苯二酚為起始物料，合成過程共3個步驟[12-13]，產(chǎn)生的副產(chǎn)物及中間體共有7種雜質(zhì)[14]，各雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 芒柄花素有關(guān)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)
Fig.1 Chemical structure of formononetin related impurities

1 主要儀器與試藥

1.1 主要儀器

2695-2996型HPLC儀，包括2695分離單元、2996二極管陣列檢測器(美國Waters公司提供)；XA-105U型電子分析天平(梅特勒-托利多公司提供)。

1.2 試劑與藥品

芒柄花素磺酸鈉(自制，批號分別為160301，160501，160502和160503，純度分別為98.38%，98.31%，98.22%和98.43%)；芒柄花素磺酸鈉對照品(自制，批號為DZ160301，純度為98.89%)；雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G對照品(自制，批號分別為Z16031，Z16032，Z16033，Z16034，Z16035，Z16036和Z16037，純度分別為92.88%，97.54%，99.61%，95.43%，96.16%，98.54%和97.84%)；乙腈，色譜純；磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；采用梯度洗脫(0～10 min，25%A→32%A；10～28 min，32%A→78%A；28～45 min，78%A；45～50 min，78%A→25%A；50～60 min，25%A)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液配制

1)供試品溶液 精密稱取芒柄花素磺酸鈉(批號為160501)適量，加入空白溶劑溶解并稀釋，制成1 mL約含芒柄花素磺酸鈉0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。

2)對照品溶液 精密稱取芒柄花素磺酸鈉(批號為DZ160301)適量，加空白溶劑溶解并稀釋，制成1 mL約含芒柄花素磺酸鈉0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。

3)對照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置于200 mL容量瓶中，加入空白溶劑并稀釋至刻度，搖勻作為對照溶液。

4)雜質(zhì)儲備溶液 精密稱取雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G對照品各適量，分別用空白溶劑溶解，制成1 mL中含相應(yīng)雜質(zhì)約0.1 mg的溶液，作為各雜質(zhì)儲備溶液。

5)雜質(zhì)對照品溶液 精密量取上述雜質(zhì)儲備溶液各1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用空白溶劑溶解并制成1 mL中含雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G約為2.0 μg的溶液，作為雜質(zhì)對照品溶液。

6)系統(tǒng)適用液 精密稱定芒柄花素磺酸鈉20 mg，精密量取上述雜質(zhì)儲備溶液各1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用空白溶劑溶解，制成1 mL中含有雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G約為2.0 μg，含芒柄花素磺酸鈉約0.4 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用液。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖
Fig.2 HPLC chromatogram of system suitability test

7)空白溶劑 甲醇-水(1︰1，體積比)，作為空白溶劑。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下空白溶劑、供試品溶液和系統(tǒng)適用液各10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖，見圖2。

圖2結(jié)果表明，空白溶劑不干擾芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)檢測，各雜質(zhì)及芒柄花素磺酸鈉之間能夠達(dá)到基線分離。各雜質(zhì)相對于主成分的相對保留時間詳見表1。

表1 各雜質(zhì)相對于主成分的相對保留時間

2.3.2 專屬性試驗(yàn)

1)酸破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號為160501)約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL溶解，于60 ℃水浴條件下放置2 h后取出，放冷，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL中和，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞溶液。

2)堿破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號為160501)約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL溶解，室溫放置10 min后，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液。

3)氧化破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號為160501)約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水溶液1 mL溶解，室溫放置1 h后，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液。

4)高溫(固體)破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號為160501)適量，置于稱量瓶中，于80 ℃條件下放置24 h后取出，放冷，精密稱定10 mg，置于25 mL量瓶中，加空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為高溫(固體)破壞溶液。

5)光照破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號為160501)適量，置于稱量瓶中，在光照度為(4 500±500)lx的條件下照射48 h后取出，精密稱定10 mg，置于25 mL量瓶中，加空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為光照破壞溶液。分別量取10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖，結(jié)果詳見圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖
Fig.3 Chromatograms of specificity test

結(jié)果表明，芒柄花素磺酸鈉在酸、氧化、高溫、光照破壞條件下穩(wěn)定，不降解；堿破壞后，各降解產(chǎn)物與主峰能夠良好地分離，且能與各個雜質(zhì)達(dá)到基線分離，說明本方法的專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項(xiàng)下芒柄花素磺酸鈉對照品溶液和各雜質(zhì)的對照品溶液適量，分別用空白溶劑進(jìn)行稀釋，制成一系列濃度的線性試驗(yàn)溶液。分別精密量取10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。線性試驗(yàn)溶液質(zhì)量濃度、回歸方程及校正因子詳見表2。

表2 線性試驗(yàn)溶液質(zhì)量濃度、回歸方程及校正因子

2.3.4 檢測限與定量限

分別取“2.2”項(xiàng)下芒柄花素磺酸鈉對照品溶液和各雜質(zhì)對照品溶液適量，進(jìn)行逐級稀釋后進(jìn)樣。當(dāng)峰高

約為基線噪音的10倍時測得定量限，當(dāng)峰高約為基線噪音的3倍時測得檢測限，結(jié)果見表3。

2.3.5 儀器精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下芒柄花素磺酸鈉對照溶液，精密量取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果得知，芒柄花素磺酸鈉峰面積的RSD值為1.1%，說明儀器的精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取芒柄花素磺酸鈉適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并稀釋制成1mL中含有芒柄花素磺酸鈉0.4mg的溶液，平行配制6個樣品溶液進(jìn)行檢測，記錄峰面積。結(jié)果得知，芒柄花素磺酸鈉峰面積的RSD值為1.2%。

表3 檢測限與定量限考察結(jié)果

2.3.7 中間精密度試驗(yàn)

按“2.3.6”項(xiàng)下方法，另配制6個供試品溶液，由不同的分析人員，在不同的日期、使用不同的儀器進(jìn)行檢測，記錄峰面積。結(jié)果得知，重復(fù)性與中間精密度共12次進(jìn)樣的RSD值為1.7%，說明本方法的中間精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液及雜質(zhì)對照品溶液，于室溫放置0，2，4，8，12，24，36，48h，分別精密量取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果得知，供試品溶液主峰面積的RSD值為1.24%(n=8)，各雜質(zhì)峰面積的RSD值分別為1.68%，1.35%，1.44%，1.48%，1.45%，1.40%和1.38%(n=8)，說明供試品溶液及雜質(zhì)對照品溶液在室溫條件下放置48h是穩(wěn)定的。

2.3.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取芒柄花素磺酸鈉供試品10份(每份約20mg，置于10個不同的50mL量瓶中)，其中1份加空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液；另外9份中分別加入“2.2”項(xiàng)下雜質(zhì)儲備溶液各0.8mL×3，1.0mL×3，1.2mL×3，加空白溶劑制成不同濃度的供試品溶液。分別精密量取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

注：-表示未檢出。

2.3.10 耐用性試驗(yàn)

改變有關(guān)物質(zhì)測定色譜條件中的柱溫(±2 ℃)、流速(±0.1mL/min)、波長(±2nm)、pH值(±0.2)和色譜柱(不同批次)，分別測定同一批樣品。結(jié)果表明，雜質(zhì)測得量基本不變，雜質(zhì)個數(shù)也無變化。這說明本方法的耐用性良好。

2.4 樣品測定

取4批樣品適量，分別按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。已知雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)和G采用相對保留時間定位，所含各雜質(zhì)采用自身對照法，按校正后的峰面積(分別乘以校正因子)進(jìn)行計算。供試品中如有已知雜質(zhì)峰，則均不得大于對照溶液主峰面積，其他單個雜質(zhì)峰面積亦不得大于對照溶液的主峰面積，各雜質(zhì)校正后峰面積之和不得大于對照主峰面積的2倍。樣品有關(guān)物質(zhì)結(jié)果見表5。

表5 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

注：-表示未檢出。

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

前期試驗(yàn)中，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，采用甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀(二者體積比為20∶80)為流動相時，雜質(zhì)不能全部檢出。為此將等度洗脫變?yōu)樘荻认疵?，但發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B與雜質(zhì)F的分離度不符合要求。為改善雜質(zhì)B與雜質(zhì)F的分離度，將甲醇更換為洗脫能力更強(qiáng)的乙腈，同時調(diào)節(jié)乙腈的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩雜質(zhì)的分離度滿足要求，主成分峰的峰形良好，理論塔板數(shù)較高。按照此梯度條件，將磷酸二氫鉀濃度變?yōu)?.005mol/L，雜質(zhì)D與雜質(zhì)B的拖尾因子分別為1.994和2.331，不符合要求，故緩沖鹽的濃度不宜再降低。此檢測方法主成分峰與各雜質(zhì)峰均能實(shí)現(xiàn)有效分離，破壞試驗(yàn)中的降解雜質(zhì)不影響芒柄花素磺酸鈉雜質(zhì)的測定。

3.2 色譜柱的選擇

分別對安捷倫公司AgilentHC-C18柱、AgilentTC-C18柱、Thermo-Fisher公司HypersilBDSC18柱(規(guī)格均為250mm×4.6mm，5μm)共3根色譜柱進(jìn)行考察。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，3根色譜柱對主成分及雜質(zhì)均能良好分離。

3.3 校正因子和雜質(zhì)計算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值計算得出各雜質(zhì)相對于主成分的校正因子[18-19]。雜質(zhì)的計算采用加入校正因子的自身對照法[20]，既可以解決雜質(zhì)對照品獲取難的問題，又可計算出產(chǎn)品中雜質(zhì)的真實(shí)含量。

4 結(jié) 語

本研究建立的高效液相色譜法專屬性強(qiáng)，精密度、準(zhǔn)確度和耐用性良好，可有效檢出芒柄花素磺酸鈉中的有關(guān)物質(zhì)，為芒柄花素磺酸鈉的質(zhì)量控制提供了重要依據(jù)。由于部分雜質(zhì)的對照品有限，故只采用了加入校正因子主成分自身對照法來控制原料藥中雜質(zhì)的含量，而沒有采用定量更為準(zhǔn)確的外標(biāo)法。今后還需要對芒柄花素磺酸鈉的后期穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究。

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Related substance determination of formononetin by HPLC

PAN Xingyan1, LU Yunxia1, YAO Jun1,2

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

To establish a method for the related substance determination of formononetin, HPLC is performed on the column of Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm) with the mobile phase A of acetonitrile and mobile phase B of potassium dihydrogen phosphate solution at the flow rate of 0.8 mL/min. According to gradient elute, the sample size is 10 μL, the detection wavelength is 250 nm, and the column temperature is 30 ℃. The result shows that the main drug and related substances could be well separated and detected effectively, different impurities can be detected effectively, and there is a good linear relationship between the mass concentration of formononetin and impurity A, B, C, D, E, F and G and peak area in the range of 0.060～4.004 μg/mL(r=0.999 8), 0.056～3.756 μg/mL(r=0.999 3), 0.039～3.902 μg/mL(r=0.999 6), 0.060～4.026 μg/mL(r=0.999 5), 0.058～3.878 μg/mL(r=0.999 3), 0.058～3.869 μg/mL(r=0.999 5), 0.060～3.977 μg/mL(r=0.999 5) and 0.040～3.952 μg/mL(r=0.999 4), respectively. The RSD of instrument precision, intermediate precision and stability test is no more than 2.0%, and the average recovery of impurities is in the range of 98.49%～101.76% with the RSD in the range of 0.37%～1.37%(n=9). The method is simple, reliable and accurate, and can be used to detect related substance in sodium formononetin-3'-sulfonate.

chromatography；formononetin；HPLC；gradient elute；related substances

1008-1542(2017)01-0032-07

10.7535/hbkd.2017yx01006

2016-11-04；

2016-12-12；責(zé)任編輯：張士瑩

科技部重大專項(xiàng)(2013ZX09103001-002)

潘星燕(1991—)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事藥物分析方面的研究。

姚 軍教授。E-mail：twobright@163.com

R917

A

潘星燕，陸云霞，姚 軍.高效液相色譜法測定芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)[J].河北科技大學(xué)學(xué)報,2017,38(1):32-38. PAN Xingyan, LU Yunxia, YAO Jun.Related substance determination of formononetin by HPLC[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(1):32-38.