李新晶，王 斌，任清云，王瑞娜，柴昕源，徐 睿

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

枯草芽孢桿菌對(duì)香菇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解規(guī)律的影響

李新晶，王 斌*，任清云，王瑞娜，柴昕源，徐 睿

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

通過探究枯草芽孢桿菌對(duì)香菇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解規(guī)律，以其為開發(fā)香菇為原料的益生菌保健品提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)以香菇子實(shí)體為主要原料配制發(fā)酵培養(yǎng)液，接入枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物種子液，分別在25、35、45℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)0～96 h內(nèi)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量變化。結(jié)果表明：發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解率有明顯影響，發(fā)酵至96 h時(shí)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解率分別為42.58%、69.53%、83.96%，發(fā)酵溫度決定了降解程度的峰值。45℃發(fā)酵溫度有利于提高香菇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)等大分子的降解率、縮短發(fā)酵時(shí)間、提高發(fā)酵生產(chǎn)效率。

枯草芽孢桿菌；香菇；發(fā)酵液；蛋白質(zhì)

香菇隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、香菇屬，在我國(guó)素有“山珍”之稱。研究表明，常食香菇有預(yù)防佝僂病、感冒、降低血壓和血脂、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和刺激干擾素形成的功能，其功能與香菇中的麥角甾醇（劉宏，2007）、多糖（梅光明等，2014；汲晨鋒等，2013；阮海星等，2005）、黃酮 （李利華，2015、2009）、核苷酸（吳關(guān)威等，2010；邊洪榮等，2002）等成分有關(guān)。以香菇為主要原料開發(fā)了香菇罐頭、香菇片、香菇脆片、香菇營(yíng)養(yǎng)薯片、香菇靈芝口香糖等食品 （糜志遠(yuǎn)等，2007），香菇酒 （趙貴紅，2006；李蘭等，2006）、香菇酸奶（郭紅珍等，2005）和香菇可樂（李玲，2005）等香菇系列飲料，香菇醬（翟眾貴等，2014；王瑩鈺等，2013）、香菇精（吳關(guān)威，2010；李波等，2009）等香菇系列調(diào)味品，并受到人們的青睞。香菇中的蛋白質(zhì)含量較高，其干品蛋白質(zhì)含量為18%～36%，高于雞蛋和豬肉，但以締合狀態(tài)的非水溶性蛋白質(zhì)為主 （何建芬等，2011；何晉浙等，1999），如何提高香菇中蛋白質(zhì)的溶解性及吸收利用率成為研究熱點(diǎn)問題。

枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性好氣性細(xì)菌，是對(duì)人和動(dòng)物安全有益的微生物，分泌蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶等胞外酶能力較強(qiáng)，其活菌制劑可治療腸炎 （邊連全等，2012；惠明等，2009）、腹瀉（龔建剛等，2016；王強(qiáng)等，2010）等多種疾病。研究表明，枯草芽孢桿菌在20～50℃范圍內(nèi)，在多種常用培養(yǎng)基中均能良好生長(zhǎng)。本試驗(yàn)以香菇子實(shí)體為主要原料配制成培養(yǎng)液，接入純培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌，分別在25、35、45℃發(fā)酵溫度下探究枯草芽孢桿菌對(duì)香菇子實(shí)體蛋白質(zhì)的降解規(guī)律，為開發(fā)香菇為原料的益生菌保健品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 香菇（烘干品）購(gòu)于黑龍江省綏化市華辰超市、枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒（北京韓美藥品有限公司）；牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫鉀、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 K9840全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；SH220石墨爐消解儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；FW100粉碎機(jī)，天津市泰斯儀器有限公司；FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHA-B水浴恒溫振蕩器，天津市泰斯儀器有限公司；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子萬(wàn)用爐，天津市泰斯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌株的分離 從活菌制劑枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒中分離試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌菌株，枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒主要成分是枯草芽孢桿菌和屎腸球菌，根據(jù)枯草芽孢桿菌可耐受60℃高溫而屎腸球菌不能耐受來分離枯草芽孢桿菌。取少量藥品粉末溶解于滅菌生理鹽水，連續(xù)十倍濃度梯度稀釋至10-5，置于60℃培養(yǎng)箱中熱處理120 min，取樣0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)平板先置于60℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)50 min后再放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，得灰白色不透明菌落，采用連續(xù)劃線法傳代純化培養(yǎng)2次，經(jīng)顯微鑒定得到枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物，作為后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)的菌種。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)液的配制 用香菇子實(shí)體干粉配制發(fā)酵培養(yǎng)液，香菇子實(shí)體中的蛋白質(zhì)作為發(fā)酵培養(yǎng)液的唯一氮源。香菇子實(shí)體樣品60℃干燥12 h，粉碎成粉，過80目標(biāo)準(zhǔn)篩，稱取32.4 g過篩的香菇細(xì)粉，先懸浮于500 mL蒸餾水中，在磁力攪拌的條件下依次加入10.8 g葡萄糖，2.16 g磷酸二氫鉀，最后加蒸餾水定容至1000 mL，得香菇子實(shí)體質(zhì)量百分含量為3.24%的發(fā)酵培養(yǎng)液。攪拌均勻后平均分裝到18個(gè)三角瓶中，即每個(gè)三角瓶培養(yǎng)液裝量為55 mL（折合每瓶裝入1.80 g的香菇粉，發(fā)酵液葡萄糖初始濃度為1.08%），用棉塞封口雙層牛皮紙包扎瓶口，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.3 發(fā)酵過程控制與取樣 無菌條件下，向每個(gè)三角瓶中接入枯草芽孢桿菌種子液1mL（種子液用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，種齡為24 h，活菌濃度為1.8×108cfu/mL）。按發(fā)酵溫度將上述裝有接種枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶平均分成三組，分別置于25、35、45℃氣浴恒溫振蕩器中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，振蕩頻率為160 r/min，在發(fā)酵至12、24、36、48、72、96 h分別取3個(gè)發(fā)酵溫度下三角瓶1瓶，以每瓶發(fā)酵液為測(cè)定對(duì)象（另留取1 mL發(fā)酵液用于菌落測(cè)定），進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。稱取1.80 g的香菇粉末，加入55 mL的蒸餾水、1 mL枯草芽孢桿菌種子液攪拌均勻，然后立即進(jìn)行抽濾得濾餅并測(cè)定蛋白質(zhì)含量，作為發(fā)酵0 h的對(duì)照試驗(yàn)。上述各組試驗(yàn)平行3次。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定與蛋白質(zhì)降解率計(jì)算 發(fā)酵過程中按上述1.3.3步驟的要求定期取樣，發(fā)酵液抽濾后收集全部濾渣，用K9840全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定發(fā)酵液濾渣的蛋白質(zhì)含量。發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等降解酶，各種酶協(xié)同作用于香菇子實(shí)體細(xì)胞壁及胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)降解成可溶性多肽和氨基酸，未被降解的蛋白質(zhì)則在過濾時(shí)滯留于濾渣，通過測(cè)定各個(gè)發(fā)酵階段發(fā)酵液濾渣蛋白質(zhì)含量變化可反映香菇子實(shí)體蛋白質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)降解規(guī)律，發(fā)酵培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)降解率的計(jì)算公式如下：

發(fā)酵培養(yǎng)液中香菇蛋白質(zhì)的降解率/%=（發(fā)酵前培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的總含量-發(fā)酵各階段樣品濾渣中蛋白質(zhì)的含量）/發(fā)酵前培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的總含量×100。

1.3.5 發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的菌落數(shù) 發(fā)酵至12、24、36、48、72、96 h時(shí)，分別取三個(gè)發(fā)酵溫度下的發(fā)酵液1 mL用于菌落測(cè)定，采用連續(xù)稀釋涂布平板法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌濃度。取無菌試管6只，各加入無菌生理鹽水9 mL，吸取發(fā)酵液1 mL注入第一管中，并依次作10倍遞增稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七個(gè)濃度，用移液器分別吸取所選定的各種稀釋液0.1 mL涂布于無菌瓊脂培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，35℃培養(yǎng)36 h統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（cfu），菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即得到每mL發(fā)酵液中所含的枯草芽孢桿菌菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)香菇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解率的影響 由圖1可知，發(fā)酵溫度對(duì)香菇子實(shí)體蛋白質(zhì)的降解率產(chǎn)生了明顯影響，在發(fā)酵96 h時(shí)，25、35、45℃發(fā)酵的蛋白質(zhì)降解率分別為 42.58%、69.53%、83.96%。在0～96 h的發(fā)酵過程，蛋白質(zhì)的降解率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)降解率逐漸增大，雖然25、35、45℃三個(gè)發(fā)酵溫度下發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)降解率呈現(xiàn)了相似的變化趨勢(shì) （即在發(fā)酵的0～24 h內(nèi)蛋白質(zhì)降解速率較快，而24 h以后降解速率顯著下降），但不同發(fā)酵時(shí)間段還是有較大差別，25℃發(fā)酵前12 h內(nèi)降解速率非常緩慢，12～ 24 h才進(jìn)入加速降解階段，發(fā)酵24 h時(shí)的降解率為27.92%，發(fā)酵96 h的降解率為42.58%，與24 h相比僅增加了14.66%，相對(duì)增幅為52.51%，這說明25℃條件下發(fā)酵24 h后發(fā)酵時(shí)間對(duì)降解率影響較小，表明25℃低溫下菌體難以利用或降解香菇蛋白，推測(cè)原因可能是此溫度下蛋白酶的種類及數(shù)量較少，或蛋白酶在此溫度下活性較低。而35℃、45℃發(fā)酵降解率在24 h內(nèi)接近直線增長(zhǎng)，始終處于加速降解狀態(tài)，發(fā)酵24 h時(shí)的降解率分別為35.04%、54.56%，發(fā)酵24 h后的降解趨勢(shì)產(chǎn)生了較大差別，發(fā)酵96 h的降解率與發(fā)酵24 h相比，分別增加了34.79%、29.40%，相對(duì)增幅分別為99.29%，53.89%，這說明45℃在發(fā)酵24 h后降解率有所減慢，但仍保持旺盛的降解能力，35℃～ 45℃的發(fā)酵溫度下，發(fā)酵時(shí)間是影響降解率的決定性因素，可通過適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間的策略提高發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的降解率。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香菇發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌數(shù)量的影響 圖2表明，25、35、45℃三個(gè)發(fā)酵溫度下枯草芽孢桿菌的增殖方式有很大差別，在0～ 96 h的測(cè)試范圍內(nèi)，高溫發(fā)酵菌體數(shù)量變化幅度較大，而低溫下發(fā)酵菌體數(shù)量變化幅度較小。25℃條件下，0～72 h菌體數(shù)量保持增加但增幅很小，發(fā)酵至72 h時(shí)菌落數(shù)達(dá)到峰值，達(dá)峰值濃度的時(shí)間滯后于35、45℃條件36 h，達(dá)峰時(shí)的菌落數(shù)，35℃是其1.46倍（第1次達(dá)峰），45℃是其4.37倍。35℃的發(fā)酵條件下，菌體數(shù)量呈先增加后降低再增加而后降低的二次增長(zhǎng)現(xiàn)象，即分別在發(fā)酵至36、72 h出現(xiàn)兩次菌體高峰值且后者高峰數(shù)值高于前者高峰數(shù)值，相差約2倍，推測(cè)其原因是發(fā)酵液中除了蛋白質(zhì)外，碳源是限制菌體繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖消耗竭盡后菌體因?yàn)槿鄙偬荚炊劳?，而后開始分解利用香菇子實(shí)體中的多糖作為碳源，從而產(chǎn)生第二次增殖高峰。45℃的發(fā)酵條件下，菌落數(shù)的變化趨勢(shì)與35℃相似，但變化幅度更大，且進(jìn)入第一次菌體濃度低谷值和第二次菌體數(shù)量高峰值時(shí)間有較大差別，45℃下發(fā)酵至72 h時(shí)才進(jìn)入第一次菌體濃度低谷值，滯后于35℃條件24 h，而后兩者發(fā)酵液中的菌體數(shù)量又開始升高逐漸開始了二次增長(zhǎng)階段。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)香菇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解率的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香菇發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌菌落數(shù)的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對(duì)香菇子實(shí)體蛋白的降解率有明顯影響，提高發(fā)酵溫度可明顯提高發(fā)酵液中香菇蛋白的降解率，縮短發(fā)酵時(shí)間。另外，三個(gè)發(fā)酵溫度下枯草芽孢桿菌的增殖方式有很大差別，高溫發(fā)酵菌體數(shù)量變化幅度較大，而低溫下發(fā)酵菌體數(shù)量變化幅度較小。35℃和45℃發(fā)酵過程中，菌體數(shù)量均出現(xiàn)二次增長(zhǎng)現(xiàn)象，并且45℃下發(fā)酵進(jìn)入第一次菌體濃度低谷值的時(shí)間，滯后于35℃條件24 h。

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The rule degradation of protein in Lentinus edodes fermentation broth of Bacillus subtilis was studied in order to provide theoretical support for the development of probiotic health care products of raw materials.Access pure culture of the Bacillus subtilis to Lentinus edodes as the main raw material preparation of culture liquid，fermentation in 25，35，45℃respectively，the protein content and Bacillus subtilis colony number in fermentation liquid 0～90 h were determined.The results showed that the fermentation temperature has a significant effect on the degradation rate of the Letinous edodes seed protein.The degradation rate of protein in fermentation broth at 96 h were 42.58%，69.53%，83.96%. The fermentation temperature determined the peak value of the degree of degradation.The fermentation temperature of 45℃is beneficial to improve the degradation rate of protein and other macromolecules in letinous edodes fermentation broth，shorten the fermentation time and improve the production efficiency.

Bacillus subtilis；Lentinus edodes；fermentation broth；protein

S816.7

A

1004-3314（2017）03-0020-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170306

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510236015）；綏化學(xué)院“天然藥物與食藥用菌質(zhì)量評(píng)價(jià)及功能保健品開發(fā)研究團(tuán)隊(duì)”階段性研究成果

*通訊作者