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        結核感染T細胞斑點試驗對脊柱結核的診斷價值

        2017-03-05 09:07:02劉漢輝余嘉洪
        關鍵詞:檢測方法

        劉漢輝,李 輝,余嘉洪

        骨關節(jié)結核是肺外結核中最常見的類型,其中脊柱結核占50%以上,尤以兒童與青少年多見[1]。早期診斷和早期治療能夠阻止脊柱結核病變的進一步發(fā)展,大大縮短療程,避免或減少畸形發(fā)生,甚至不用手術就能達到治愈目的[2]。但脊柱結核發(fā)病早期一般較隱匿,缺乏典型的臨床癥狀;加上近年來椎間盤型結核、單椎體中心型結核、非連續(xù)性結核等非典型性脊柱結核病例不斷增多,早期X線、CT及其他影像學檢查缺乏特異性,導致脊柱結核在早期易發(fā)生漏診或誤診[3],延誤治療,引發(fā)脊柱畸形、截癱等嚴重后果。

        結核病的傳統(tǒng)診斷手段包括結核菌素純蛋白衍化物(purified protein derivative,PPD)皮試、血清結核抗體檢測、結核桿菌DNA PCR檢測、細菌學檢查、影像學檢查、組織病理學檢查等[4]。結核菌素皮試試驗(tuberculin skin test,TST)臨床最為常用,但有較多缺陷[5],在易受結核感染的免疫力低下人群中,其敏感性反而大大降低,而在普遍接種卡介苗的地區(qū)則出現非常高的假陽性率;其他幾種檢測手段因陽性率偏低、結果誤差較大或檢測技術要求高等原因,對脊柱結核的輔助診斷作用亦有限[6]。因此建立更加快速準確的診斷方法,對于早期發(fā)現和診斷脊柱結核至關重要。近年來出現的結核感染T細胞斑點(T-cell spot of tuberculosis,T-SPOT.TB)試驗是診斷結核感染的新方法,在國外已廣泛應用于結核感染的診斷[7-8]。本研究應用T-SPOT.TB試劑盒對經確診的脊柱結核及非結核患者進行檢測,并與其他常規(guī)檢測方法進行比較,目的在于評估T-SPOT.TB檢測對于脊柱結核的診斷價值。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2015年1月至2016年12月佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科收治并確診的脊柱結核及非結核患者各50例。結核組納入標準:①影像學檢查符合脊柱結核的特征;②術前或術中活檢病灶標本涂片或細菌培養(yǎng)結果證實存在結核分枝桿菌,或病理檢查符合結核改變;③抗結核治療少于2周。排除合并脊柱外結核病例。非結核組納入標準:①無結核患者接觸史;②影像學檢查無結核表現;③排除結核分枝桿菌感染及診斷不明的脊柱疾病。

        結核組患者男31例,女19例,年齡9~43歲,平均年齡35.3歲;其中頸椎結核8例、胸椎結核23例、腰椎結核19例。非結核組患者中男28例,女22例,年齡13~56歲,平均年齡41.8歲;其中化膿性感染21例、轉移瘤16例、多發(fā)性骨髓瘤9例、布魯氏菌病4例。

        1.2 檢測方法

        1.2.1 PPD皮試 抽取結核菌素皮試液0.1 mL(5 IU)于受試者左前臂掌側皮內注射,注射后72 h硬結的橫徑與縱徑平均值≥5 mm為陽性、<5 mm為陰性。

        1.2.2抗結核抗體檢測 抽取受試者3 mL外周血,采用結核桿菌抗體檢測試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)及全自動生化檢測儀進行抗結核抗體檢測,并記錄檢測結果。

        1.2.3 T-SPOT.TB檢測 分別抽取受試者3~4 mL外周抗凝血,以淋巴細胞分層液分離、提純外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),調節(jié)細胞濃度至2.5×106/L。在4個檢測孔內加入不同的對照物:陰性對照孔加入細胞培養(yǎng)液50 μL;陽性質控對照孔加入陽性對照植物血細胞凝集素50 μL;2個測試孔A孔和B孔分別加入結核桿菌混合多肽A(ESAT-6抗原)和混合多肽B(CFP-10抗原)各50 μL。分別在上述孔內加入100 μL 2.5×106/mL的PBMC。將微孔板放入(37±1)℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育l6~20 h。洗板后加入配制的標記抗體工作液50 μL,于2~8℃下孵育60 min;再次洗板后加入底物溶液50 μL,于室溫中顯色反應7 min,洗滌各孔、終止反應,孔內可見深藍色清晰斑點。將微孔板避光置于通風環(huán)境或37℃溫箱中干燥,采用ELISPOT斑點計數并加以記錄。

        T-SPOT.TB試驗結果判定標準:①陽性結果:當空白對照孔≤5 SFCs(斑點形成細胞數)時,(A孔-空白對照孔)或(B孔-空白對照孔)≥6 SFCs;當空白對照孔≥6 SFCs時,A孔或B孔細胞數≥空白對照孔2倍;②陰性結果:(A孔-空白對照孔)或(B孔-空白對照孔)<6 SFCs且陽性對照孔≥20 SFCs;③不確定結果:(A孔-空白對照孔)或(B孔-空白對照孔)<6 SFCs且陽性對照<20 SFCs,建議重新送檢;④技術誤差:當空白對照孔≥10 SFCs時建議重新送檢。

        1.3 檢測指標

        根據檢測結果統(tǒng)計3種檢測方法診斷脊柱結核的敏感度(真陽性率,Se)、特異度(真陰性率,Sp)、陽性似然比(+LR)及陰性似然比(-LR);對脊柱結核組3種診斷方法的檢測結果進行比較。

        1.4 統(tǒng)計學方法

        應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(x-±s)表示,比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料以例或率表示,比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        1.5 結果判定

        當Se、Sp分別>80%,可判定該檢測方法對脊柱結核的輔助診斷價值較高;+LR>10或-LR<0.1,可判定其檢測結果真實可信,+LR越大或-LR越小,檢測結果可信度則越高[9]。

        2 結果

        3種診斷方法對脊柱結核的檢測結果見表1,表2提示T-SPOT.TB檢測的Se、Sp、+LR、-LR明顯優(yōu)于其他兩種常規(guī)檢測方法。對脊柱結核組T-SPOT.TB試驗與其他兩種診斷方法的檢測結果進行比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表3)。

        3 討論

        3.1 診斷脊柱結核的傳統(tǒng)方法

        表1 3種檢測方法診斷脊柱結核的結果比較(n=50,例)

        表2 3種檢測方法敏感度、特異度、陽性似然比和陰性似然比的比較(n=50)

        結核菌培養(yǎng)是目前臨床診斷結核病的金標準,但敏感性太低,對結核菌培養(yǎng)的實驗室條件及工作人員的素質要求也較高,在基層醫(yī)院較難開展。組織病理學檢測方法對脊柱結核的診斷陽性率亦只有40%左右[10]。原因可能是脊柱結核病變位置較深,組織標本取材難度較高;此外,結核病變早期呈非特異性炎癥反應,而特異性干酪性壞死及結核結節(jié)樣壞死在疾病晚期才出現,因此限制了其對脊柱結核的早期診斷。

        表3 脊柱結核組T-SPOT.TB檢測與結核菌素PPD皮試、抗核抗體檢測的比較(n=50,例)

        3.3 T-SPOT.TB檢測原理

        結核感染的免疫應答反應以細胞免疫為主。作為免疫應答的一部分,T細胞受結核抗原刺激致敏,形成活化的效應T淋巴細胞,包括CD4和CD8。將這些活化的效應T淋巴細胞從全血中單獨分離出來,在體外受特異抗原刺激并計數;在細胞分泌的細胞因子擴散稀釋前,ELISPOT技術能夠立即捕獲細胞周圍所分泌的細胞因子,可以檢測出1/10 000~1/50 000 PBMC中經結核菌抗原刺激后釋放γ-干擾素的細胞,其靈敏度遠超傳統(tǒng)的檢測方法[11-12]。

        而T-SPOT.TB試驗是一種以ELISPOT技術檢測結核感染的新方法,其對每個活化的結核特異效應T細胞進行計數,操作更加簡單。該方法使用的抗原是結核分枝桿菌RD1和RD16區(qū)編碼的蛋白,這些蛋白在卡介苗中缺失,因此能夠較好地區(qū)分卡介苗接種和結核分枝桿菌感染[13]。由于排除了卡介苗接種及大多數非結核分枝桿菌的影響,故T-SPOT.TB檢測的特異性和敏感性均較高。

        3.3 T-SPOT.TB試驗對脊柱結核的診斷價值

        自英國Oxford Immunotec公司成功研制T-SPOT.TB試劑盒以來,已經在多個國家獲準用于結核病的診斷。目前國內部分醫(yī)院及檢測機構已采用該檢測方法輔助診斷肺結核,但對脊柱結核及骨關節(jié)結核診斷應用仍較少[14-15]。本研究采用T-SPOT.TB試劑盒對確診的脊柱結核及非結核患者進行檢測,靈敏度為88%,特異度達到94%,明顯高于PPD皮試及抗結核抗體檢測,證實T-SPOT.TB檢測對脊柱結核也具有較高的輔助診斷價值。而在揭示檢測方法準確性的參數中,陽性似然比、陰性似然比屬于能同時反映靈敏度和特異度的復合指標,可全面體現篩檢試驗的診斷價值,非常穩(wěn)定可靠;此外,似然比的計算只涉及到靈敏度與特異度,不受患病率的影響,因此是一個相對獨立的診斷性試驗評估指標。當陽性似然比>10或陰性似然比<0.1時,診斷或排除某種疾病的可能性將顯著增加[16]。本研究中,T-SPOT.TB試驗的陽性似然比為14.667、陰性似然比為0.126,而PPD皮試及抗結核抗體檢測的陽性似然比分別為2.176、3.222,陰性似然比分別為0.393、0.512,綜上結果可判定,T-SPOT.TB檢測的試驗結果更為真實可信。

        3.4 T-SPOT.TB檢測特點

        與傳統(tǒng)結核檢測方法比較,T-SPOT.TB具有以下優(yōu)點:①敏感性及特異性高:不受卡介苗接種及環(huán)境分枝桿菌干擾,亦不受機體免疫狀態(tài)的影響;②取樣簡單:僅需抽取少量外周血;③診斷快速:24 h可報告結果。其不足之處在于:①不能有效區(qū)分潛伏感染、活動性結核病及已治愈的結核病患者;②檢測結果不能明確結核感染的具體部位。

        綜上所述,T-SPOT.TB試驗檢測脊柱結核操作難度小,診斷快速,具有較高的靈敏度及特異度,檢測結果真實可靠。結合患者臨床癥狀、體征、影像學資料及其他輔助檢查,該方法可脊柱結核感染的早期臨床診斷提供有力依據。

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