劉漢輝，李 輝，余嘉洪

骨關節(jié)結核是肺外結核中最常見的類型，其中脊柱結核占50%以上，尤以兒童與青少年多見[1]。早期診斷和早期治療能夠阻止脊柱結核病變的進一步發(fā)展，大大縮短療程，避免或減少畸形發(fā)生，甚至不用手術就能達到治愈目的[2]。但脊柱結核發(fā)病早期一般較隱匿，缺乏典型的臨床癥狀；加上近年來椎間盤型結核、單椎體中心型結核、非連續(xù)性結核等非典型性脊柱結核病例不斷增多，早期X線、CT及其他影像學檢查缺乏特異性，導致脊柱結核在早期易發(fā)生漏診或誤診[3]，延誤治療，引發(fā)脊柱畸形、截癱等嚴重后果。

結核病的傳統(tǒng)診斷手段包括結核菌素純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）皮試、血清結核抗體檢測、結核桿菌DNA PCR檢測、細菌學檢查、影像學檢查、組織病理學檢查等[4]。結核菌素皮試試驗（tuberculin skin test，TST）臨床最為常用，但有較多缺陷[5]，在易受結核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低，而在普遍接種卡介苗的地區(qū)則出現非常高的假陽性率；其他幾種檢測手段因陽性率偏低、結果誤差較大或檢測技術要求高等原因，對脊柱結核的輔助診斷作用亦有限[6]。因此建立更加快速準確的診斷方法，對于早期發(fā)現和診斷脊柱結核至關重要。近年來出現的結核感染T細胞斑點（T-cell spot of tuberculosis，T-SPOT.TB）試驗是診斷結核感染的新方法，在國外已廣泛應用于結核感染的診斷[7-8]。本研究應用T-SPOT.TB試劑盒對經確診的脊柱結核及非結核患者進行檢測，并與其他常規(guī)檢測方法進行比較，目的在于評估T-SPOT.TB檢測對于脊柱結核的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年12月佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科收治并確診的脊柱結核及非結核患者各50例。結核組納入標準：①影像學檢查符合脊柱結核的特征；②術前或術中活檢病灶標本涂片或細菌培養(yǎng)結果證實存在結核分枝桿菌，或病理檢查符合結核改變；③抗結核治療少于2周。排除合并脊柱外結核病例。非結核組納入標準：①無結核患者接觸史；②影像學檢查無結核表現；③排除結核分枝桿菌感染及診斷不明的脊柱疾病。

結核組患者男31例，女19例，年齡9～43歲，平均年齡35.3歲；其中頸椎結核8例、胸椎結核23例、腰椎結核19例。非結核組患者中男28例，女22例，年齡13～56歲，平均年齡41.8歲；其中化膿性感染21例、轉移瘤16例、多發(fā)性骨髓瘤9例、布魯氏菌病4例。

1.2 檢測方法

1.2.1 PPD皮試 抽取結核菌素皮試液0.1 mL（5 IU）于受試者左前臂掌側皮內注射，注射后72 h硬結的橫徑與縱徑平均值≥5 mm為陽性、＜5 mm為陰性。

1.2.2抗結核抗體檢測 抽取受試者3 mL外周血，采用結核桿菌抗體檢測試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司）及全自動生化檢測儀進行抗結核抗體檢測，并記錄檢測結果。

1.2.3 T-SPOT.TB檢測 分別抽取受試者3～4 mL外周抗凝血，以淋巴細胞分層液分離、提純外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），調節(jié)細胞濃度至2.5×106/L。在4個檢測孔內加入不同的對照物：陰性對照孔加入細胞培養(yǎng)液50 μL；陽性質控對照孔加入陽性對照植物血細胞凝集素50 μL；2個測試孔A孔和B孔分別加入結核桿菌混合多肽A（ESAT-6抗原）和混合多肽B（CFP-10抗原）各50 μL。分別在上述孔內加入100 μL 2.5×106/mL的PBMC。將微孔板放入（37±1）℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育l6～20 h。洗板后加入配制的標記抗體工作液50 μL，于2～8℃下孵育60 min；再次洗板后加入底物溶液50 μL，于室溫中顯色反應7 min，洗滌各孔、終止反應，孔內可見深藍色清晰斑點。將微孔板避光置于通風環(huán)境或37℃溫箱中干燥，采用ELISPOT斑點計數并加以記錄。

T-SPOT.TB試驗結果判定標準：①陽性結果：當空白對照孔≤5 SFCs（斑點形成細胞數）時，（A孔－空白對照孔）或（B孔－空白對照孔）≥6 SFCs；當空白對照孔≥6 SFCs時，A孔或B孔細胞數≥空白對照孔2倍；②陰性結果：（A孔－空白對照孔）或（B孔-空白對照孔）＜6 SFCs且陽性對照孔≥20 SFCs；③不確定結果：（A孔－空白對照孔）或（B孔－空白對照孔）＜6 SFCs且陽性對照＜20 SFCs，建議重新送檢；④技術誤差：當空白對照孔≥10 SFCs時建議重新送檢。

1.3 檢測指標

根據檢測結果統(tǒng)計3種檢測方法診斷脊柱結核的敏感度（真陽性率，Se）、特異度（真陰性率，Sp）、陽性似然比（+LR）及陰性似然比（－LR）；對脊柱結核組3種診斷方法的檢測結果進行比較。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x-±s）表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 結果判定

當Se、Sp分別＞80%，可判定該檢測方法對脊柱結核的輔助診斷價值較高；+LR＞10或－LR＜0.1，可判定其檢測結果真實可信，+LR越大或－LR越小，檢測結果可信度則越高[9]。

2 結果

3種診斷方法對脊柱結核的檢測結果見表1，表2提示T-SPOT.TB檢測的Se、Sp、+LR、－LR明顯優(yōu)于其他兩種常規(guī)檢測方法。對脊柱結核組T-SPOT.TB試驗與其他兩種診斷方法的檢測結果進行比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）。

3 討論

3.1 診斷脊柱結核的傳統(tǒng)方法

表1 3種檢測方法診斷脊柱結核的結果比較（n=50，例）

表2 3種檢測方法敏感度、特異度、陽性似然比和陰性似然比的比較（n=50）

結核菌培養(yǎng)是目前臨床診斷結核病的金標準，但敏感性太低，對結核菌培養(yǎng)的實驗室條件及工作人員的素質要求也較高，在基層醫(yī)院較難開展。組織病理學檢測方法對脊柱結核的診斷陽性率亦只有40%左右[10]。原因可能是脊柱結核病變位置較深，組織標本取材難度較高；此外，結核病變早期呈非特異性炎癥反應，而特異性干酪性壞死及結核結節(jié)樣壞死在疾病晚期才出現，因此限制了其對脊柱結核的早期診斷。

表3 脊柱結核組T-SPOT.TB檢測與結核菌素PPD皮試、抗核抗體檢測的比較（n=50，例）

3.3 T-SPOT.TB檢測原理

結核感染的免疫應答反應以細胞免疫為主。作為免疫應答的一部分，T細胞受結核抗原刺激致敏，形成活化的效應T淋巴細胞，包括CD4和CD8。將這些活化的效應T淋巴細胞從全血中單獨分離出來，在體外受特異抗原刺激并計數；在細胞分泌的細胞因子擴散稀釋前，ELISPOT技術能夠立即捕獲細胞周圍所分泌的細胞因子，可以檢測出1/10 000～1/50 000 PBMC中經結核菌抗原刺激后釋放γ-干擾素的細胞，其靈敏度遠超傳統(tǒng)的檢測方法[11-12]。

而T-SPOT.TB試驗是一種以ELISPOT技術檢測結核感染的新方法，其對每個活化的結核特異效應T細胞進行計數，操作更加簡單。該方法使用的抗原是結核分枝桿菌RD1和RD16區(qū)編碼的蛋白，這些蛋白在卡介苗中缺失，因此能夠較好地區(qū)分卡介苗接種和結核分枝桿菌感染[13]。由于排除了卡介苗接種及大多數非結核分枝桿菌的影響，故T-SPOT.TB檢測的特異性和敏感性均較高。

3.3 T-SPOT.TB試驗對脊柱結核的診斷價值

自英國Oxford Immunotec公司成功研制T-SPOT.TB試劑盒以來，已經在多個國家獲準用于結核病的診斷。目前國內部分醫(yī)院及檢測機構已采用該檢測方法輔助診斷肺結核，但對脊柱結核及骨關節(jié)結核診斷應用仍較少[14-15]。本研究采用T-SPOT.TB試劑盒對確診的脊柱結核及非結核患者進行檢測，靈敏度為88%，特異度達到94%，明顯高于PPD皮試及抗結核抗體檢測，證實T-SPOT.TB檢測對脊柱結核也具有較高的輔助診斷價值。而在揭示檢測方法準確性的參數中，陽性似然比、陰性似然比屬于能同時反映靈敏度和特異度的復合指標，可全面體現篩檢試驗的診斷價值，非常穩(wěn)定可靠；此外，似然比的計算只涉及到靈敏度與特異度，不受患病率的影響，因此是一個相對獨立的診斷性試驗評估指標。當陽性似然比＞10或陰性似然比＜0.1時，診斷或排除某種疾病的可能性將顯著增加[16]。本研究中，T-SPOT.TB試驗的陽性似然比為14.667、陰性似然比為0.126，而PPD皮試及抗結核抗體檢測的陽性似然比分別為2.176、3.222，陰性似然比分別為0.393、0.512，綜上結果可判定，T-SPOT.TB檢測的試驗結果更為真實可信。

3.4 T-SPOT.TB檢測特點

與傳統(tǒng)結核檢測方法比較，T-SPOT.TB具有以下優(yōu)點：①敏感性及特異性高：不受卡介苗接種及環(huán)境分枝桿菌干擾，亦不受機體免疫狀態(tài)的影響；②取樣簡單：僅需抽取少量外周血；③診斷快速：24 h可報告結果。其不足之處在于：①不能有效區(qū)分潛伏感染、活動性結核病及已治愈的結核病患者；②檢測結果不能明確結核感染的具體部位。

綜上所述，T-SPOT.TB試驗檢測脊柱結核操作難度小，診斷快速，具有較高的靈敏度及特異度，檢測結果真實可靠。結合患者臨床癥狀、體征、影像學資料及其他輔助檢查，該方法可脊柱結核感染的早期臨床診斷提供有力依據。

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