豆黃聰 琳郭敏 王曉琳 姜華
摘要:目的 對藏藥鐮形棘豆及其易混偽品進行分子鑒定,以確保該藥材的質(zhì)量及臨床療效。方法 提取樣本基因組DNA,對核基因ITS2片段進行PCR擴增并測序,并對所得序列進行同源性比較,利用MEGA軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析,并構(gòu)建基于ITS2序列的鄰接(NJ)樹。結(jié)果 鐮形棘豆物種種內(nèi)K2P遺傳距離為0,與其他混偽品的K2P遺傳距離分布于0.068~0.084,構(gòu)建的NJ樹表明ITS2序列能夠區(qū)分鐮形棘豆與其他易混偽品。結(jié)論 ITS2序列作為DNA條形碼可以方便快捷地鑒別鐮形棘豆及其易混偽品,為其種質(zhì)資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。
關(guān)鍵詞:鐮形棘豆;DNA條形碼;ITS2;分子鑒定
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019
中圖分類號:R282.5 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-5304(2017)02-0076-03
鐮形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我國青藏高原常用的民間草藥之一,收載于1995年頒布的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第一冊。全草入藥,具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎療效,被譽為藏醫(yī)“三大抗炎藥”之一,是奇正消痛貼膏、青鵬膏劑、流感丸、藏紅花油、棘豆扶正膠囊等多種藏藥復(fù)方或成藥的主要藥物。王棟等[2]實驗研究顯示,鐮形棘豆具有良好的外周鎮(zhèn)痛活性,對急性炎癥和慢性炎癥都有較好的作用。其黃酮類成分具有抗炎與抗氧化活性[3]。有研究報道,鐮形棘豆活性成分對胃癌、肝癌細(xì)胞株具有較強的細(xì)胞毒
但至目前為止,對藏藥鐮形棘豆生藥鑒定方面的研究還非常薄弱,并且只見于利用傳統(tǒng)方法進行鑒定[8]。棘豆屬近緣種植物,尤其是同生境分布的近緣種,產(chǎn)地來源相同、表型具有趨同性、形態(tài)特征相似,往往很難通過傳統(tǒng)的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定等方法進行準(zhǔn)確鑒別。因此,本研究提出采用DNA條形碼(DNA barcoding)的方法對鐮形棘豆及其易混偽品砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等進行分子鑒定。
DNA條形碼技術(shù)利用短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列片段對物種進行分子鑒定[9]。因其是基于物種基因的檢測,而不是與環(huán)境密切相關(guān)的表現(xiàn)型,避免了人為因素和客觀條件的影響,為生藥鑒定提供了本質(zhì)依據(jù),適用于對中藥材進行真?zhèn)舞b定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之間,在物種水平的變異較快,已被用于多個物種的DNA條形碼鑒定[11-13]。本研究利用ITS2條形碼對鐮形棘豆及其易混偽品進行比較研究,旨在為該藥材的質(zhì)量控制、臨床安全用藥及合理開發(fā)利用提供分子依據(jù)。
1 儀器與試藥
共20個樣本,來自7個物種,包括樣品及Genbank下載序列。樣品由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授盛紅梅進行鑒定,憑證標(biāo)本保存于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所。樣品及GenBank下載序列見表1。
低溫高速離心機(Eppendorf,德國),恒溫水浴鍋(科哲,中國上海),PCR儀(Bio-Rad,美國),水平電泳儀(Bio-Rad,美國),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)。
植物DNA提取試劑盒、dNTP Mix、PCR buffer(10×)、Taq酶,北京天根生物技術(shù)有限公司;定量Marker DS2000,廣東東盛生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2 方法
2.1 樣品總DNA提取
稱取100 mg樣品組織,在預(yù)冷的研缽中進行快速充分研磨,然后利用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 目的序列PCR擴增
ITS2序列擴增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3',反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應(yīng)體系25 μL,包括:DNA模板0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,dNTP mix 0.5 μL,引物各0.5 μL,Taq酶0.5 μL,ddH2O 20 μL。擴增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,由上海生工生物工程有限公司完成測序。
2.3 數(shù)據(jù)處理與分析
對測序峰圖進行校對,去除引物區(qū),使用基于HMM的注釋方法[14],去除兩端5.8s和28s區(qū)段,獲得ITS2間隔區(qū)序列。將所有序列用Clustal X軟件進行多序列比對,利用MEGA軟件分析比對,并基于K2P模型計算序列間進化距離,用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。利用自展Bootstrap檢驗評價各分支的支持率,1000次重復(fù)。
3 結(jié)果
3.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測
采用ITS2序列引物對采集樣本基因組DNA進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)。
3.2 種內(nèi)與種間變異分析
20個樣本的ITS2序列平均長度為211 bp;GC含量差異較小,分布于51.2%~52.8%,平均GC含量為51.8%。K2P遺傳距離分析表明,鐮形棘豆種內(nèi)的遺傳距離為0,鐮形棘豆與其易混偽品種間平均K2P距離為0.075,分布于0.068~0.084。
3.3 聚類分析
基于ITS2序列,利用軟件MEGA構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹顯示,不同來源的鐮形棘豆樣本聚為一支,表現(xiàn)出單系性,自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆也分別聚為獨立的支,與鐮形棘豆區(qū)分明顯。
4 討論
由于棘豆屬一些物種形態(tài)相似,鐮形棘豆與相同生境的同屬近緣植物難以辨識。棘豆屬其他植物如甘肅棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16],采食有毒棘豆屬植物后常會引發(fā)動物發(fā)生中樞神經(jīng)抑制、呼吸抑制,引起中毒乃至死亡,或?qū)е聞游锪鳟a(chǎn)、畸形[17]。偽品混用嚴(yán)重影響真品鐮形棘豆的用藥安全,因此,對鐮形棘豆藥材的準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn),ITS2作為DNA條形碼序列,可以有效便捷地鑒別鐮形棘豆與砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等易混偽品,具有重要的應(yīng)用價值。
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(收稿日期:2015-09-09)
(修回日期:2015-11-02;編輯:陳靜)