豆黃聰 琳郭敏 王曉琳 姜華

摘要：目的 對藏藥鐮形棘豆及其易混偽品進行分子鑒定，以確保該藥材的質(zhì)量及臨床療效。方法 提取樣本基因組DNA，對核基因ITS2片段進行PCR擴增并測序，并對所得序列進行同源性比較，利用MEGA軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，并構(gòu)建基于ITS2序列的鄰接（NJ）樹。結(jié)果 鐮形棘豆物種種內(nèi)K2P遺傳距離為0，與其他混偽品的K2P遺傳距離分布于0.068～0.084，構(gòu)建的NJ樹表明ITS2序列能夠區(qū)分鐮形棘豆與其他易混偽品。結(jié)論 ITS2序列作為DNA條形碼可以方便快捷地鑒別鐮形棘豆及其易混偽品，為其種質(zhì)資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鐮形棘豆；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019

中圖分類號：R282.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0076-03

鐮形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我國青藏高原常用的民間草藥之一，收載于1995年頒布的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第一冊。全草入藥，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎療效，被譽為藏醫(yī)“三大抗炎藥”之一，是奇正消痛貼膏、青鵬膏劑、流感丸、藏紅花油、棘豆扶正膠囊等多種藏藥復(fù)方或成藥的主要藥物。王棟等[2]實驗研究顯示，鐮形棘豆具有良好的外周鎮(zhèn)痛活性，對急性炎癥和慢性炎癥都有較好的作用。其黃酮類成分具有抗炎與抗氧化活性[3]。有研究報道，鐮形棘豆活性成分對胃癌、肝癌細(xì)胞株具有較強的細(xì)胞毒

但至目前為止，對藏藥鐮形棘豆生藥鑒定方面的研究還非常薄弱，并且只見于利用傳統(tǒng)方法進行鑒定[8]。棘豆屬近緣種植物，尤其是同生境分布的近緣種，產(chǎn)地來源相同、表型具有趨同性、形態(tài)特征相似，往往很難通過傳統(tǒng)的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定等方法進行準(zhǔn)確鑒別。因此，本研究提出采用DNA條形碼（DNA barcoding）的方法對鐮形棘豆及其易混偽品砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等進行分子鑒定。

DNA條形碼技術(shù)利用短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列片段對物種進行分子鑒定[9]。因其是基于物種基因的檢測，而不是與環(huán)境密切相關(guān)的表現(xiàn)型，避免了人為因素和客觀條件的影響，為生藥鑒定提供了本質(zhì)依據(jù)，適用于對中藥材進行真?zhèn)舞b定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之間，在物種水平的變異較快，已被用于多個物種的DNA條形碼鑒定[11-13]。本研究利用ITS2條形碼對鐮形棘豆及其易混偽品進行比較研究，旨在為該藥材的質(zhì)量控制、臨床安全用藥及合理開發(fā)利用提供分子依據(jù)。

1 儀器與試藥

共20個樣本，來自7個物種，包括樣品及Genbank下載序列。樣品由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授盛紅梅進行鑒定，憑證標(biāo)本保存于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所。樣品及GenBank下載序列見表1。

低溫高速離心機（Eppendorf，德國），恒溫水浴鍋（科哲，中國上海），PCR儀（Bio-Rad，美國），水平電泳儀（Bio-Rad，美國），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）。

植物DNA提取試劑盒、dNTP Mix、PCR buffer（10×）、Taq酶，北京天根生物技術(shù)有限公司；定量Marker DS2000，廣東東盛生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 樣品總DNA提取

稱取100 mg樣品組織，在預(yù)冷的研缽中進行快速充分研磨，然后利用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 目的序列PCR擴增

ITS2序列擴增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3'，反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應(yīng)體系25 μL，包括：DNA模板0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 20 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程有限公司完成測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對測序峰圖進行校對，去除引物區(qū)，使用基于HMM的注釋方法[14]，去除兩端5.8s和28s區(qū)段，獲得ITS2間隔區(qū)序列。將所有序列用Clustal X軟件進行多序列比對，利用MEGA軟件分析比對，并基于K2P模型計算序列間進化距離，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。利用自展Bootstrap檢驗評價各分支的支持率，1000次重復(fù)。

3 結(jié)果

3.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測

采用ITS2序列引物對采集樣本基因組DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)。

3.2 種內(nèi)與種間變異分析

20個樣本的ITS2序列平均長度為211 bp；GC含量差異較小，分布于51.2%～52.8%，平均GC含量為51.8%。K2P遺傳距離分析表明，鐮形棘豆種內(nèi)的遺傳距離為0，鐮形棘豆與其易混偽品種間平均K2P距離為0.075，分布于0.068～0.084。

3.3 聚類分析

基于ITS2序列，利用軟件MEGA構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹顯示，不同來源的鐮形棘豆樣本聚為一支，表現(xiàn)出單系性，自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆也分別聚為獨立的支，與鐮形棘豆區(qū)分明顯。

4 討論

由于棘豆屬一些物種形態(tài)相似，鐮形棘豆與相同生境的同屬近緣植物難以辨識。棘豆屬其他植物如甘肅棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16]，采食有毒棘豆屬植物后常會引發(fā)動物發(fā)生中樞神經(jīng)抑制、呼吸抑制，引起中毒乃至死亡，或?qū)е聞游锪鳟a(chǎn)、畸形[17]。偽品混用嚴(yán)重影響真品鐮形棘豆的用藥安全，因此，對鐮形棘豆藥材的準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，ITS2作為DNA條形碼序列，可以有效便捷地鑒別鐮形棘豆與砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等易混偽品，具有重要的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2015-09-09）

（修回日期：2015-11-02；編輯：陳靜）