豆黃聰 琳郭敏 王曉琳 姜華

摘要：目的 對(duì)藏藥鐮形棘豆及其易混偽品進(jìn)行分子鑒定，以確保該藥材的質(zhì)量及臨床療效。方法 提取樣本基因組DNA，對(duì)核基因ITS2片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，并對(duì)所得序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，并構(gòu)建基于ITS2序列的鄰接（NJ）樹。結(jié)果 鐮形棘豆物種種內(nèi)K2P遺傳距離為0，與其他混偽品的K2P遺傳距離分布于0.068～0.084，構(gòu)建的NJ樹表明ITS2序列能夠區(qū)分鐮形棘豆與其他易混偽品。結(jié)論 ITS2序列作為DNA條形碼可以方便快捷地鑒別鐮形棘豆及其易混偽品，為其種質(zhì)資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鐮形棘豆；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019

中圖分類號(hào)：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）02-0076-03

鐮形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我國(guó)青藏高原常用的民間草藥之一，收載于1995年頒布的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第一冊(cè)。全草入藥，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎療效，被譽(yù)為藏醫(yī)“三大抗炎藥”之一，是奇正消痛貼膏、青鵬膏劑、流感丸、藏紅花油、棘豆扶正膠囊等多種藏藥復(fù)方或成藥的主要藥物。王棟等[2]實(shí)驗(yàn)研究顯示，鐮形棘豆具有良好的外周鎮(zhèn)痛活性，對(duì)急性炎癥和慢性炎癥都有較好的作用。其黃酮類成分具有抗炎與抗氧化活性[3]。有研究報(bào)道，鐮形棘豆活性成分對(duì)胃癌、肝癌細(xì)胞株具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒

但至目前為止，對(duì)藏藥鐮形棘豆生藥鑒定方面的研究還非常薄弱，并且只見于利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定[8]。棘豆屬近緣種植物，尤其是同生境分布的近緣種，產(chǎn)地來源相同、表型具有趨同性、形態(tài)特征相似，往往很難通過傳統(tǒng)的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定等方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。因此，本研究提出采用DNA條形碼（DNA barcoding）的方法對(duì)鐮形棘豆及其易混偽品砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等進(jìn)行分子鑒定。

DNA條形碼技術(shù)利用短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列片段對(duì)物種進(jìn)行分子鑒定[9]。因其是基于物種基因的檢測(cè)，而不是與環(huán)境密切相關(guān)的表現(xiàn)型，避免了人為因素和客觀條件的影響，為生藥鑒定提供了本質(zhì)依據(jù)，適用于對(duì)中藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之間，在物種水平的變異較快，已被用于多個(gè)物種的DNA條形碼鑒定[11-13]。本研究利用ITS2條形碼對(duì)鐮形棘豆及其易混偽品進(jìn)行比較研究，旨在為該藥材的質(zhì)量控制、臨床安全用藥及合理開發(fā)利用提供分子依據(jù)。

1 儀器與試藥

共20個(gè)樣本，來自7個(gè)物種，包括樣品及Genbank下載序列。樣品由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授盛紅梅進(jìn)行鑒定，憑證標(biāo)本保存于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所。樣品及GenBank下載序列見表1。

低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），恒溫水浴鍋（科哲，中國(guó)上海），PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)），水平電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）。

植物DNA提取試劑盒、dNTP Mix、PCR buffer（10×）、Taq酶，北京天根生物技術(shù)有限公司；定量Marker DS2000，廣東東盛生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 樣品總DNA提取

稱取100 mg樣品組織，在預(yù)冷的研缽中進(jìn)行快速充分研磨，然后利用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 目的序列PCR擴(kuò)增

ITS2序列擴(kuò)增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3'，反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應(yīng)體系25 μL，包括：DNA模板0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)，去除引物區(qū)，使用基于HMM的注釋方法[14]，去除兩端5.8s和28s區(qū)段，獲得ITS2間隔區(qū)序列。將所有序列用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA軟件分析比對(duì)，并基于K2P模型計(jì)算序列間進(jìn)化距離，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。利用自展Bootstrap檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各分支的支持率，1000次重復(fù)。

3 結(jié)果

3.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

采用ITS2序列引物對(duì)采集樣本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)。

3.2 種內(nèi)與種間變異分析

20個(gè)樣本的ITS2序列平均長(zhǎng)度為211 bp；GC含量差異較小，分布于51.2%～52.8%，平均GC含量為51.8%。K2P遺傳距離分析表明，鐮形棘豆種內(nèi)的遺傳距離為0，鐮形棘豆與其易混偽品種間平均K2P距離為0.075，分布于0.068～0.084。

3.3 聚類分析

基于ITS2序列，利用軟件MEGA構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹顯示，不同來源的鐮形棘豆樣本聚為一支，表現(xiàn)出單系性，自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆也分別聚為獨(dú)立的支，與鐮形棘豆區(qū)分明顯。

4 討論

由于棘豆屬一些物種形態(tài)相似，鐮形棘豆與相同生境的同屬近緣植物難以辨識(shí)。棘豆屬其他植物如甘肅棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16]，采食有毒棘豆屬植物后常會(huì)引發(fā)動(dòng)物發(fā)生中樞神經(jīng)抑制、呼吸抑制，引起中毒乃至死亡，或?qū)е聞?dòng)物流產(chǎn)、畸形[17]。偽品混用嚴(yán)重影響真品鐮形棘豆的用藥安全，因此，對(duì)鐮形棘豆藥材的準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，ITS2作為DNA條形碼序列，可以有效便捷地鑒別鐮形棘豆與砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等易混偽品，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 姜華，胡君茹，劉霞.鐮形棘豆的研究進(jìn)展[J].中草藥，2006，37（2）：314-315.

[2] 王棟，楊歡，童麗，等.藏藥鐮形棘豆的鎮(zhèn)痛抗炎活性[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（2）：90-93.

[3] WANG D， TANG W， YANG G M， et al. Anti-inflammatory， antioxidant and cytotoxic activities of flavonoids from Oxytropis falcate Bunge[J]. Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8（6）：461-465.

[4] 閆海燕.鐮形棘豆中兩種黃酮的結(jié)構(gòu)及生物活性研究[J].寶雞文理學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，28（2）：120-122，126.

[5] 楊光明，張芳芳，王棟，等.鐮形棘豆對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖及MMP-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（9）：1227-1230.

[6] 陳錦珊，洪佳妮，杜青云，等.鐮形棘豆黃酮類化合物對(duì)紫外線輻射引起的角質(zhì)形成細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（4）：289-292.

[7] 戴衍朋，楊歡，童麗，等.鐮形棘豆止血作用初步研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（2）：107-108，126.

[8] 姜華，詹文強(qiáng)，劉霞.藏藥鐮形棘豆的生藥學(xué)鑒定[J].中國(guó)中藥雜志， 2007，32（24）：2664-2666.

[9] MILLER S E. DNA barcoding and the renaissance of taxonomy[J]. Proceedings of the National Academy of Science，2007，104（12）：4775-4776.

[10] 陳士林，姚輝，宋經(jīng)元，等.基于DNA barcoding（條形碼）技術(shù)的中藥材鑒定[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（3）：7-12.

[11] 李妮，陳科力，劉震，等.景天屬藥用植物DNA條形碼研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12（3）：462-467.

[12] TING G， HUI Y， SONG J Y， et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2[J]. Journal of Ethnopharmacology，2010，130（6）：116-121.

[13] 倪梁紅，扎西次仁，趙志禮，等.藏藥冬那端赤的分子生藥學(xué)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（3）：65-68.

[14] KELLER A， SCHLEICHER T， SCHULTZ J， et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J]. Gene，2009，430（1/2）：50-57.

[15] 沈明華，莫重輝，趙寶玉，等.家兔實(shí)驗(yàn)性甘肅棘豆中毒的臨床癥狀和病理形態(tài)學(xué)觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（1）：442-449.

[16] 盧萍，趙萌莉，韓國(guó)棟.小花棘豆毒性的危害與利用[J].草業(yè)科學(xué)， 2009，26（3）：97-101.

[17] 楊小平.動(dòng)物棘豆屬瘋草中毒的臨床癥狀[J].武漢科技學(xué)院學(xué)報(bào)， 2002，15（3）：25-28.

（收稿日期：2015-09-09）

（修回日期：2015-11-02；編輯：陳靜）