杜小正 袁博 王金海 方曉麗 張星華 田亮 張婷卓 李興蘭 曾華宗

摘要：目的 通過測定寒證類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）模型家兔滑膜組織內(nèi)源性代謝物，探討熱補(bǔ)針法治療RA的特異性機(jī)制。方法 采用卵蛋白誘導(dǎo)聯(lián)合低溫冷凍法復(fù)制寒證RA模型。將40只清潔級青紫藍(lán)家兔隨機(jī)分為正常組、模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組、熱補(bǔ)針法組，每組8只。除正常組和模型組外，其余各組分別施以平補(bǔ)平瀉、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法、熱補(bǔ)針法針刺“足三里”，1次/d，留針30 min，連續(xù)7 d。干預(yù)結(jié)束后分離家兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，應(yīng)用氣相色譜-四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜采集各組滑膜代謝物譜圖，利用主成分分析和偏最小二乘判別分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果 與正常組比較，模型組家兔滑膜組織代謝物變化主要體現(xiàn)于三羧酸循環(huán)、糖類及脂肪酸代謝相關(guān)物質(zhì)增高（P<0.05）；與模型組比較，各針刺組家兔滑膜組織代謝物變化主要體現(xiàn)于上述各種代謝相關(guān)物質(zhì)降低（P<0.05），且熱補(bǔ)針法組三羧酸循環(huán)與糖代謝相關(guān)物質(zhì)明顯低于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組（P<0.05）。結(jié)論 熱補(bǔ)針法治療RA的特異性體現(xiàn)在對三羧酸循環(huán)及糖代謝通路的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：熱補(bǔ)針法；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜組織；代謝組學(xué)；氣相色譜-質(zhì)譜法；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.015

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0055-05

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主的慢性自身免疫性疾病，該病病程遷延、反復(fù)發(fā)作，對患者的生活造成嚴(yán)重影響。針灸療法具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]，對RA具有確切的臨床療效[4-5]。熱補(bǔ)針法是鄭魁山教授簡化燒山火手法和進(jìn)火法而形成的一種復(fù)式手法，具有補(bǔ)益正氣、溫陽散寒之功用。課題組前期研究表明，熱補(bǔ)針法治療RA在鎮(zhèn)痛方面具有相對特異性[6-9]，但這些初步研究尚不能體現(xiàn)針灸多靶點(diǎn)、多途徑、多層次、類似于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用特點(diǎn)，缺乏對針刺后機(jī)體產(chǎn)生的全部生物信息的綜合分析。

代謝組學(xué)是一門新興的系統(tǒng)生物學(xué)，通過考察生物體系在外因刺激下其代謝路徑及代謝產(chǎn)物的變化，從系統(tǒng)生物學(xué)角度研究機(jī)體發(fā)病及治療機(jī)制的新技術(shù)[10-11]。該研究手段的優(yōu)勢與針灸作用特點(diǎn)甚相吻合。為了進(jìn)一步深入研究熱補(bǔ)針法治療RA的特異性機(jī)制，課題組前期以寒證RA模型家兔為載體，對家兔尿液內(nèi)源性代謝物進(jìn)行了分析[12]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察熱補(bǔ)針法干預(yù)對家兔模型關(guān)節(jié)滑膜組織代謝物的影響，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討熱補(bǔ)針法治療RA的特異性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

2～3月齡清潔級健康青紫藍(lán)家兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，蘭州生物制品研究所，動(dòng)物許可證號SCXK（甘）2012-0001。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃，相對濕度（50±10）%，每日光照時(shí)間12 h，自由進(jìn)食飲水。

1.2 針具、主要試劑與儀器

針灸針（華成牌，蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司）。卵蛋白干粉（批號A5253-250G）、弗氏完全佐劑（批號F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，國藥集團(tuán)；尿素酶、甲氧胺鹽酸吡，Sigma公司。Agilent GC/MS系統(tǒng)、毛細(xì)管色譜柱，J&W; Scientific公司。

1.3 分組及造模

家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組、模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組、熱補(bǔ)針法組，每組8只。采用卵蛋白誘導(dǎo)聯(lián)合低溫冷凍進(jìn)行RA寒證模型復(fù)制[13-14]。實(shí)驗(yàn)正式開始前3 d，剃去家兔背部肩胛骨間的毛。將4 mg/mL卵蛋白溶液與等量弗氏完全佐劑混勻，充分震蕩成乳化劑，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均勻選定的6個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同劑量重復(fù)皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔雙后腿膝關(guān)節(jié)周圍的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒雙膝關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)內(nèi)注入20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL。24 h內(nèi)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫觸痛，表明模型復(fù)制成功。成模后第2日，乙醇消毒兩后腿足，上、下、左、右圍置冰袋，溫度降至-20～-25 ℃冷凍1.5 h，45 ℃溫水復(fù)溫5 min。冷凍后14 d，家兔表現(xiàn)為精神萎靡不振，兩后肢匍伏跛行，膝關(guān)節(jié)腫脹、周徑明顯大于正常組，局部青紫、皮溫不高，表示成功建立RA寒證模型。

1.4 針刺方法

先將家兔固定，選取后腿“足三里”[15]。各針刺組分別施以相應(yīng)針法。熱補(bǔ)針法操作參照《鄭氏針灸全集》[16]：左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內(nèi)8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續(xù)捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應(yīng)的部位，連續(xù)重插輕提5次；拇指再向前連續(xù)捻按5次，反復(fù)操作1 min；最后使針下沉緊，留針30 min。平補(bǔ)平瀉法、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法操作參照《刺法灸法學(xué)》[17]。平補(bǔ)平瀉法：針刺得氣后，前后均勻捻轉(zhuǎn)，不單向捻轉(zhuǎn)，指力均勻，角度180～360?，頻率60～90 r/min，反復(fù)操作1 min。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法：針刺得氣后，小幅度前后捻轉(zhuǎn)針體（角度180～360?，頻率60～90 r/min），拇指向前左轉(zhuǎn)時(shí)用力重、指力沉重向下，拇指向后右轉(zhuǎn)還原時(shí)用力輕，反復(fù)操作1 min。每日1次，每次留針30 min，連續(xù)7 d。

1.5 樣本采集

針刺干預(yù)結(jié)束后，耳后緣靜脈注射空氣處死家兔，分離各組家兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，于凍存管內(nèi)置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 樣品衍生化處理

室溫解凍后，取100 μL樣本于1.5 mL EP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品∶甲醇=1∶4，渦旋30 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取200 μL上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待測。將進(jìn)樣小瓶置于溫和氮?dú)庀麓蹈?，加?0 μL甲氧胺吡啶（20 mg/mL）溶液，劇烈震蕩30 s，37 ℃肟化反應(yīng)90 min，取出后加30 μL BSTFA（含1%TMCS）進(jìn)行衍生，70 ℃反應(yīng)60 min，室溫靜置30 min備檢。

1.7 氣相色譜-質(zhì)譜條件

進(jìn)樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度>99.999%）作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，維持2 min，10 ℃/min速度升至320 ℃，維持6 min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測范圍為50～550 m/z。采用隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，避免儀器信號波動(dòng)所造成的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在R軟件平臺下采用XCMS軟件對GC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并在Excel2010軟件中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量（保留時(shí)間、質(zhì)荷比）、觀察量（樣本）和峰強(qiáng)。然后將所有數(shù)據(jù)歸一化到總信號積分。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P13.0進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），最后獲得差異物質(zhì)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原始色譜圖的可視化檢查

每組樣本的離子流色譜圖（TIC）見圖1。儀器的保留時(shí)間重現(xiàn)性良好，儀器穩(wěn)定，因而提高了儀器分析和數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。

結(jié)果顯示，模型組滑膜組織代謝物變化較正常組主要體現(xiàn)于三羧酸循環(huán)、糖類及脂肪酸代謝的代謝物升高（P<0.05）；各針刺組代謝物變化較模型組主要體現(xiàn)于脂肪酸代謝各種代謝相關(guān)物質(zhì)降低（P<0.05），且各針刺組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各針刺組干預(yù)后三羧酸循環(huán)、糖類代謝相關(guān)代謝物下調(diào)，且熱補(bǔ)針法組三羧酸循環(huán)與糖代謝相關(guān)物質(zhì)如檸檬酸、烏頭酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、乳酸、?；撬崦黠@低于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組（P<0.05）。

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要病理改變的自身免疫性疾病，滑膜炎是RA中重要的病理改變，與血液、尿液比較，關(guān)節(jié)滑膜組織代謝物信息的變化可能更能準(zhǔn)確、靈敏地反映RA的發(fā)病機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，在RA機(jī)體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝等發(fā)生了變化[18-20]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA與三羧酸循環(huán)、糖類及脂肪酸代謝相關(guān)，與上述研究相符，表明RA的發(fā)病機(jī)制涉及途徑廣、層次多等復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度而言，其發(fā)病機(jī)制與針灸多靶點(diǎn)、多途徑、多層次、類似于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的整體作用特點(diǎn)亦甚相符。

自由基理論認(rèn)為，其親核氨基可與水分子作用產(chǎn)生大量的自由基，造成細(xì)胞膜和線粒體等氧化應(yīng)激性損傷[21]，自由基的增多，會(huì)引起脂質(zhì)氧化代謝紊亂、線粒體損傷等一系列連鎖反應(yīng)，最終造成細(xì)胞膜的損傷，癸二酸、壬二酸、亞麻酸作為不飽和脂肪酸，其含量升高就是脂質(zhì)過氧代謝的表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了這一說法。線粒體的損傷會(huì)引發(fā)三磷酸腺苷（ATP）的合成障礙。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組琥珀酸、檸檬酸、烏頭酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸的含量增加，這些物質(zhì)均是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，三羧酸循環(huán)是糖的有氧代謝的主要途徑，它與催化糖的有氧分解等相關(guān)的酶分布在線粒體基質(zhì)中，線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成ATP的主要場所，它為細(xì)胞的活動(dòng)提供了能量。因此，這些代謝物的異常變化反映了線粒體功能的損害[22]。

細(xì)胞膜的損傷可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，RA是一種以滑膜炎為主的疾病，有人認(rèn)為與RA相關(guān)的白細(xì)胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6等促炎性細(xì)胞因子[23-24]具有多種促炎作用，可刺激前列腺素E的產(chǎn)生，而前列腺素作為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，其含量在RA發(fā)生后含量會(huì)增加，從而使其前體物質(zhì)花生四烯酸的含量降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組花生四烯酸含量較正常組下降、前列腺素E2甲酯升高，與上述描述相一致。

正常生理狀態(tài)下，葡萄糖在無氧情況下，經(jīng)糖酵解途徑分解成乳酸，并釋放出少量能量，乳酸成為這一糖酵解過程的最終產(chǎn)物；?；撬崾菣C(jī)體非必需氨基酸之一，是體內(nèi)一種重要的含硫氨基酸，它一般以游離形式存在于人及動(dòng)物組織細(xì)胞和體液中，?；撬釁⑴c糖代謝的調(diào)節(jié)，加速糖酵解。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組乳酸和牛磺酸含量較正常組增加，提示RA滑膜組織糖酵解活性增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。正氣虛弱是RA發(fā)病的內(nèi)因，風(fēng)寒濕邪侵犯是外因，風(fēng)寒濕邪乘虛侵入四肢關(guān)節(jié)筋骨，陽氣虛不能驅(qū)邪外出，邪氣黏滯纏綿，閉阻經(jīng)絡(luò)，發(fā)為此病。因此，中醫(yī)治療須標(biāo)本同治，在祛散邪氣的同時(shí)兼顧溫補(bǔ)陽氣，即為“陽氣并則陰凝散”。熱補(bǔ)針法是鄭魁山教授臨床治療RA的經(jīng)驗(yàn)結(jié)晶，具有補(bǔ)益正氣、溫陽散寒的作用。從中醫(yī)角度而言，熱補(bǔ)針法的功用與RA的病機(jī)特點(diǎn)相吻合。

綜上，針刺干預(yù)后參與脂肪酸代謝的上述物質(zhì)普遍下調(diào)，且各針刺組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示針刺對RA具有抗氧化損傷及抗炎的作用；針刺干預(yù)后參與三羧酸循環(huán)及糖代謝的上述代謝物均顯著降低（P<0.05），尤以熱補(bǔ)針法組下調(diào)明顯（P<0.05），說明熱補(bǔ)針法可能通過修復(fù)線粒體功能損傷（ATP合成受限）、改善糖酵解來調(diào)節(jié)RA的三羧酸循環(huán)及糖代謝。

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（收稿日期：2016-02-03）

（修回日期：2016-03-01；編輯：華強(qiáng)）