張秀麗 孟盼 向韻 雷昌 劉芳 黃丹 蔡川 蔡光先 王宇紅

摘要：目的 篩選補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方的最佳配伍，并進(jìn)行驗(yàn)證。方法 采用H2O2誘導(dǎo)建立PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型?？疾觳煌瑵舛?.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)體外氧化應(yīng)激模型細(xì)胞的保護(hù)作用，確定最佳作用濃度。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將補(bǔ)陽(yáng)還五湯各單味藥隨機(jī)配伍分成補(bǔ)陽(yáng)還五湯不同拆方組及對(duì)照組（僅加細(xì)胞培養(yǎng)基）、正常組（無(wú)H2O2和藥物處理）、模型組，考察對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，篩選精簡(jiǎn)方，確定精簡(jiǎn)方各單味藥的配伍比例，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。采用大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法復(fù)制局灶性腦缺血模型，SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和精簡(jiǎn)方高、中、低劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，驗(yàn)證篩選結(jié)果。結(jié)果 與其他拆方組比較，黃芪+川芎+地龍對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用最佳（P<0.05），且與補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方相當(dāng)；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組及精簡(jiǎn)方各劑量組均能改善模型大鼠大腦皮層梗死面積、降低腦組織水腫程度（P<0.05），且以精簡(jiǎn)方中劑量組最佳。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方最佳配伍為黃芪、川芎、地龍，其比例為10∶3∶1。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)陽(yáng)還五湯；拆方；局灶性腦缺血模型；氧化應(yīng)激模型；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.014

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）02-0049-06

中國(guó)腦卒中防治報(bào)告（2015）提示，腦卒中作為我國(guó)第1位死亡原因，其造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)每年高達(dá)400億元[1]。因此，如何有效防治腦卒中已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究和臨床工作急需解決的難題和重要任務(wù)。臨床應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥療效較好。但其藥味眾多，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難以明確。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯進(jìn)行體外拆方研究，篩選最佳精簡(jiǎn)方，并采用永久性局灶性腦缺血（MCAO）模型，對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g）和各單味藥及篩選獲得的精簡(jiǎn)方干浸膏均由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥所提供。補(bǔ)陽(yáng)還五湯和精簡(jiǎn)方干浸膏分別相當(dāng)于原藥材4.5、4.7 g/g。所有藥物均采用無(wú)菌水溶解，配制成一定濃度的母液，0.25 μm濾膜過(guò)濾除菌，使用時(shí)無(wú)菌PBS稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞和動(dòng)物

PC12細(xì)胞系（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞），高分化，長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。SPF級(jí)10周齡SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于室溫（20±1）℃，濕度60%～70%，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone），胎牛血清（FBS，GIBCO），D-Hanks（Solarbio），胰蛋白酶（Solarbio），MTT（Sigma）。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Eppendorf），超純水分離系統(tǒng)（ELGA），超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司），倒置顯微鏡（ZEISS），CO2培養(yǎng)箱（NEW BRUN-SWICK），多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scien Tific）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立

參照文獻(xiàn)[2]方法。將PC12細(xì)胞接種于TC處理的培養(yǎng)瓶，采用含10%胎牛血清DEME高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，待細(xì)胞貼壁融合至90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，替換為無(wú)血清培基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再用H2O2終濃度為0.3 mmol/L無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

2.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯拆方分組原則及對(duì)PC12模型細(xì)胞保護(hù)作用的考察

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將補(bǔ)陽(yáng)還五湯7個(gè)單味藥隨機(jī)配伍分成補(bǔ)陽(yáng)還五全方組、黃芪+當(dāng)歸+赤芍+川芎+紅花組、黃芪+當(dāng)歸+桃仁+地龍組、黃芪+赤芍+桃仁組、黃芪+川芎+地龍組、黃芪+紅花組、當(dāng)歸+紅花+桃仁組、當(dāng)歸+川芎組、當(dāng)歸+赤芍+地龍組、川芎+紅花+桃仁+地龍組、赤芍+紅花+地龍組、赤芍+川芎+桃仁組。補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方考察濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL，不同拆方中單味藥濃度按照補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方中單味藥比例進(jìn)行確定。將細(xì)胞與藥物共同作用2 h，再加入H2O2繼續(xù)培育2 h。另設(shè)對(duì)照組（僅加細(xì)胞培養(yǎng)基）、正常組（無(wú)H2O2和藥物處理）、模型組（僅加H2O2處理）。MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率[（OD值處理組―OD值空白對(duì)照組）÷（OD值正常組―OD值空白對(duì)照組）×100%]。

2.3 體內(nèi)動(dòng)物模型制備、分組、給藥及指標(biāo)測(cè)定

采用大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法復(fù)制MCAO大鼠模型[3]。按體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和精簡(jiǎn)方高、中、低劑量組，每組10只。術(shù)后第1日開(kāi)始給藥，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯（相當(dāng)于干浸膏3.15 g/kg），精簡(jiǎn)方各劑量組給予低（干浸膏1.68 g/kg）、中（干浸膏2.41 g/kg）、高劑量（干浸膏3.44 g/kg）灌胃[4]。模型組和假手術(shù)組給予等量無(wú)菌蒸餾水。給藥體積均為0.05 mL/kg，每日1次。自由飲食、活動(dòng)，連續(xù)給藥7 d后脫頸處死取材備用。

2.3.1 腦梗死面積比檢測(cè) 取大鼠腦組織-20 ℃冷凍20 min后去掉嗅球、小腦和腦干部分，取最大缺血斷面，即漏斗柄部位及后葉尾極之間的腦組織。腦片37 ℃避光、2%紅四氮唑染色30 min，正常組織呈深紅色，梗死組織則為白色。斷面拍照采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，計(jì)算腦梗死面積。腦梗死面積（%）=（健側(cè)總面積-患側(cè)非梗死區(qū)面積）÷2×健側(cè)總面積×100%。

2.3.2 腦干濕重比檢測(cè) 取大鼠腦組織，濾紙吸干其表面殘留血漬，置于小稱(chēng)量瓶?jī)?nèi)稱(chēng)取濕重，再將稱(chēng)量瓶放入恒溫干燥箱內(nèi)，105 ℃恒溫烤48～96 h至恒重（3次稱(chēng)樣差別≤0.2 mg）。稱(chēng)干重后，計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）÷濕重×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，2組獨(dú)立樣本間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 不同濃度補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方對(duì)氧化應(yīng)激模型細(xì)胞保護(hù)作用的影響

0.2 mg/mL補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方干預(yù)即可對(duì)抗H2O2的氧化損傷，對(duì)PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，其細(xì)胞存活率均高于模型組（P<0.05）；在1 mg/mL范圍內(nèi)，隨著藥物濃度升高細(xì)胞存活率增加，有效防止H2O2的過(guò)氧化；當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增大，則對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒副作用，細(xì)胞存活率顯著降低，見(jiàn)圖1。因此，確定補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方對(duì)H2O2導(dǎo)致的過(guò)氧化損傷發(fā)揮保護(hù)作用的最佳作用濃度為1 mg/mL。

.3.1 各單味藥黃芪、川芎、地龍對(duì)模型細(xì)胞最佳保護(hù)作用濃度 根據(jù)補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，我們?cè)O(shè)定單味藥黃芪考察濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，川芎和地龍的考察濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

在較高濃度（0.5～4.0 mg/mL）范圍內(nèi)，黃芪濃度與模型細(xì)胞存活率呈正相關(guān)，對(duì)H2O2致?lián)p的PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。由于2.0、4.0 mg/mL黃芪對(duì)模型細(xì)胞的保護(hù)作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從節(jié)約資源和減輕對(duì)細(xì)胞毒副作用的角度，確定黃芪最佳給藥劑量為2.0 mg/mL。川芎和地龍則相反，在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率明顯高于模型組，而更高濃度沒(méi)有保護(hù)作用，甚至產(chǎn)生毒副作用。見(jiàn)圖3。因此，川芎和地龍的最佳劑量均為0.2 mg/mL。

5 討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯系清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立的治療半身不遂辨證屬氣虛血瘀證的經(jīng)典名方。本課題組前期大量研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、調(diào)控caveolin-1、Toll樣受體等多種途徑有效防治腦缺血損傷[5-12]。但因其藥味眾多，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難以闡明，不能完全滿(mǎn)足國(guó)際市場(chǎng)的標(biāo)準(zhǔn)，阻礙了其在國(guó)際市場(chǎng)上廣泛流通。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯重用生黃芪，大補(bǔ)元?dú)?，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。配以當(dāng)歸尾活血和血，且有化瘀不傷血之妙，是為臣藥。川芎、赤芍、桃仁、紅花助當(dāng)歸尾活血祛瘀，地龍長(zhǎng)于行散走竄、通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。各藥合用，使氣足以推動(dòng)血行，瘀去絡(luò)通，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用反向藥理學(xué)方法，通過(guò)正交試驗(yàn)研究了補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其不同拆方對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方與黃芪+川芎+地龍的配伍對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用最好，正交直觀(guān)分析和方差分析亦顯示最佳配伍組合為黃芪+川芎+地龍，為精簡(jiǎn)方的方藥配伍提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究考察了黃芪、川芎、地龍各單味藥對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用，確定黃芪的最佳給藥劑量為2.0 mg/mL，川芎和地龍最佳作用劑量為0.2 mg/mL，驗(yàn)證了中藥配伍中“重用君藥”的理論。黃芪、川芎、地龍兩兩配伍研究表明，最佳作用濃度的黃芪、川芎、地龍不同配伍組均能對(duì)模型細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用；精簡(jiǎn)方最佳配伍比例為黃芪∶川芎∶地龍=10∶3∶1。對(duì)PC12細(xì)胞的生物相容性的考察發(fā)現(xiàn)，精簡(jiǎn)方組在24 h內(nèi)細(xì)胞存活率遠(yuǎn)高于100%，與PC12細(xì)胞的生物相容性非常好，為其臨床用藥的安全性提供了數(shù)據(jù)支持。

以MCAO模型大鼠為研究載體的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和精簡(jiǎn)方中劑量改善模型大鼠大腦皮層梗死面積、降低腦組織水腫程度的作用最佳，且二者療效相當(dāng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了篩方結(jié)果。以上結(jié)果為進(jìn)一步明確精簡(jiǎn)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與其藥物作用分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王隴德.中國(guó)腦卒中防治報(bào)告（2015）[M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2015.

[2] MA S， LIU X， XUN Q， et al. Neuroprotective effect of Ginkgolide K against H2O2-induced PC12 cell cytotoxicity by ameliorating mitochondrial dysfunction and oxidative stress[J]. Biol Pharm Bull，2014，37（2）：217-225.

[3] SWANSON R A. A semiautomated method for measuring brain infarct volume[J]. J Ceveb Blood Flow Metab，1990，10（2）：293-295.

[4] 劉芳，王宇紅，蔡光先，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方（腦健片）對(duì)腦缺血大鼠海馬組織CDK4/Cyclin D1表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2015， 40（20）：4058-4062.

[5] 佘顏，易健，邵樂(lè)，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（1）：58-61.

[6] 劉芳，楊巖濤，賀福元，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯類(lèi)方成分的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（7）：82-86.

[7] 尹天雷，李雅，李鶴白，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血模型大鼠腦損傷的保護(hù)作用[J].世界中醫(yī)藥，2007，2（4）：241-242.

[8] 劉芳，白雪松，劉柏炎，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（1）：9-12.

[9] 俞悅，易健，蔡光先，等.Caveolin-1敲除對(duì)C57BL/6小鼠繁殖性能及子代離乳前體質(zhì)量的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（11）：7-9.

[10] 劉柏炎，蔡光先，劉維，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體Flk1的影響[J].中草藥，2007，38（3）：394- 396.

[11] 周賽男.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞增殖及腦組織TLR2、TLR4、NF-κB、MyD88表達(dá)的影響[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[12] 易健，黃昕，俞悅，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠腦缺血后白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2010，22（10）：599-601.

（收稿日期：2016-04-12）

4.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯不同拆方對(duì)氧化應(yīng)激模型細(xì)胞保護(hù)作用的影響

將10 mg補(bǔ)陽(yáng)還五湯溶于10 mL PBS中，配制成1 mg/mL。按補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方配伍比例，確定10 mL拆方中黃芪為8.4 mg，當(dāng)歸為0.4 mg，赤芍為0.3 mg，川芎、紅花、桃仁、地龍均為0.2 mg。MTT法觀(guān)察不同配伍對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方與黃芪+川芎+地龍的配伍對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用最佳，見(jiàn)圖2。將結(jié)果進(jìn)行正交直觀(guān)分析和方差分析，表明精簡(jiǎn)方最佳配伍組合為黃芪+川芎+地龍，見(jiàn)表1、表2。