蒲 源，王 丹，錢 駿，陳建峰

(1.北京化工大學(xué) 有機(jī)無機(jī)復(fù)合材料國家重點實驗室，北京 100029)(2.浙江大學(xué) 現(xiàn)代光學(xué)儀器國家重點實驗室，浙江 杭州 310058)

特約專欄

熒光納米材料及其生物成像應(yīng)用

蒲 源1，王 丹1，錢 駿2，陳建峰1

(1.北京化工大學(xué) 有機(jī)無機(jī)復(fù)合材料國家重點實驗室，北京 100029)(2.浙江大學(xué) 現(xiàn)代光學(xué)儀器國家重點實驗室，浙江 杭州 310058)

熒光成像是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣的成像技術(shù)之一。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，具有優(yōu)良特性的熒光納米材料不斷涌現(xiàn)。相比于傳統(tǒng)的熒光分子，熒光納米材料具有光學(xué)穩(wěn)定性高、形貌尺寸易調(diào)控、多功能化等優(yōu)點。利用熒光納米材料作為探針的生物熒光成像能夠為研究者提供從細(xì)胞、離體組織到活體生物樣本的結(jié)構(gòu)和動態(tài)信息等方面全面細(xì)致的探測方法，成為當(dāng)前材料、光學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉領(lǐng)域的研究熱點。結(jié)合近年來熒光納米材料及其生物成像應(yīng)用的發(fā)展趨勢以及本課題組前期的研究工作基礎(chǔ)，歸納概述了幾種類型熒光納米材料的特性，包括基于有機(jī)熒光染料的納米顆粒、半導(dǎo)體量子點、碳基熒光納米材料以及稀土摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料，結(jié)合具體例子介紹了熒光納米材料在生物醫(yī)學(xué)成像中的應(yīng)用，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

熒光納米材料；半導(dǎo)體量子點；碳基量子點；上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒；生物成像

1 前 言

生物影像信息時生命科學(xué)研究中最重要、最直接的研究證據(jù)之一，有時甚至是唯一的證據(jù)。隨著各種先進(jìn)影像學(xué)方法和技術(shù)的發(fā)展，人們能夠獲得生命體實時、定量、原位、活體和高靈敏的生物學(xué)信息，為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[1]。目前生物影像技術(shù)如X射線、B超、電子計算機(jī)斷層掃描(CT)、正電子發(fā)射型計算機(jī)斷層顯像(PET)、磁共振成像(MRI)等，存在輻射大、成本高、操作復(fù)雜的缺點。光學(xué)成像尤其是生物熒光成像因其組織破壞性小、無有害電磁輻射、成像設(shè)備成本低等優(yōu)點，表現(xiàn)出取代上述成像手段的潛力[2]。

生物熒光成像是利用生物體熒光特性的變化來獲得光學(xué)圖像。由于在很多生物結(jié)構(gòu)和生物過程中都缺少內(nèi)源熒光材料，很難利用生物樣本的本征熒光進(jìn)行成像和探測，因此多數(shù)情況下需要引入外源熒光材料作為造影劑，對特定細(xì)胞或組織器官進(jìn)行標(biāo)定[3]。熒光蛋白作為一種無損的活細(xì)胞熒光標(biāo)記物，在光學(xué)生物成像領(lǐng)域占有舉足輕重的地位，為細(xì)胞生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)的研究帶來了革命性的變化[4]。利用熒光蛋白標(biāo)記與雙光子熒光成像、活體熒光成像等技術(shù)相結(jié)合，能夠“看到”生物活體內(nèi)特定蛋白的表達(dá)，原位、動態(tài)跟蹤細(xì)胞內(nèi)部的分子事件。但是熒光蛋白存在抗光漂白性差、紅外吸收和發(fā)射熒光蛋白研發(fā)困難等問題，制約了熒光蛋白在長時間熒光成像及活體深度成像的應(yīng)用[5]。

熒光納米材料是具有熒光性質(zhì)且至少有一維的尺寸處于1～100 nm量級的超微小材料[6]。在離體細(xì)胞層面，熒光納米材料足夠小的尺寸使其能夠通過擴(kuò)散或經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，作為細(xì)胞熒光成像探針；在活體動物層面，納米顆粒進(jìn)入血液循環(huán)后，能夠從高通透性的腫瘤血管滲出并在腫瘤部位富集，作為腫瘤診斷的探針。另外，通過納米技術(shù)將熒光材料與治療藥物相結(jié)合，開發(fā)具有靶向性、多功能的診療一體化納米顆粒，為疾病的早期檢測和更加有效的治療提供了新的技術(shù)手段[7]。

近年來，熒光納米材料及其生物醫(yī)學(xué)成像研究已成為新材料領(lǐng)域科研工作者關(guān)注的熱點。本文結(jié)合我們前期的研究工作基礎(chǔ)，歸納概述了幾種類型熒光納米材料，包括基于有機(jī)熒光染料的納米顆粒、半導(dǎo)體量子點、碳基熒光納米材料以及稀土摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料，結(jié)合具體例子介紹了熒光納米材料在生物醫(yī)學(xué)成像中的應(yīng)用，并對這些材料的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

2 基于有機(jī)熒光染料的納米顆粒

有機(jī)熒光染料，包括熒光素類以及羅丹明類染料，是目前生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的熒光探針。以有機(jī)熒光材料作為熒光劑的熒光納米顆粒制備主要有兩種方式，一種是利用有機(jī)聚合物或者無機(jī)納米顆粒把有機(jī)染料分子包裹到納米顆粒內(nèi)部[8-10]，一種是通過化學(xué)或者物理的方法使有機(jī)染料分子吸附在納米顆粒的表面[11,12]。將有機(jī)染料分子同納米顆粒相結(jié)合，能夠提高染料分子在生物體環(huán)境的穩(wěn)定性，防止有機(jī)染料分子在生物組織內(nèi)的擴(kuò)散[8]。另外通過表面修飾在納米顆粒表面連接蛋白或者生物分子，能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞及活體腫瘤組織的特異性生物標(biāo)記與熒光成像[9]。圖1展示了錢駿等[8]利用二氧化硅納米顆粒包覆有機(jī)熒光分子(PpIX)的過程示意圖。包裹有熒光染料分子的二氧化硅納米顆粒(PpIX@SiO2)平均尺寸為25 nm，在水中具有良好的分散性，適于用作離體細(xì)胞和活體成像的納米探針。我們利用對PpIX@SiO2納米探針與HeLa細(xì)胞共同孵育，隨后采用雙光子熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)構(gòu)表明在波長為800 nm的飛秒激光激發(fā)下，細(xì)胞內(nèi)部能夠觀察到PpIX分子的雙光子熒光信號，表明該熒光納米顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可以用作細(xì)胞標(biāo)記和熒光成像的探針。

圖1 (a)用二氧化硅納米小球包覆PpIX的反應(yīng)流程示意圖； (b)PpIX@SiO2納米顆粒的TEM照片；(c)PpIX@SiO2納米顆粒在波長為400 nm的連續(xù)激光激發(fā)(1-photon excited)和波長為800 nm的飛秒激光激發(fā)(2-photon excited)下的熒光光譜曲線；雙光子激發(fā)的細(xì)胞熒光成像 (d)不作任何處理的對照組HeLa細(xì)胞，(e)同PpIX@SiO2納米顆粒共同孵育2 h后的HeLa細(xì)胞(插圖：細(xì)胞內(nèi)熒 光信號的光譜曲線)[8]Fig.1 (a) Synthesis illustration of PpIX@SiO2 nanoparticles, (b) a typical TEM image of PpIX@SiO2 nanoparticles, (c) one-and two-photon excited fluorescence spectra of PpIX@SiO2 nanoparticles, two-photon excited fluorescence images of HeLa cells treated (d) without and (e) with PpIX@SiO2 nanoparticles (insert: fluorescence spectra in cells) [8]

理想情況下，利用納米顆粒包覆有機(jī)熒光染料分子，納米顆粒中包覆的染料分子越多，顆粒的熒光效率越高。實際情況是傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料分子是具有大π共軛體系的剛性平面分子，在稀溶液中能夠發(fā)射很強(qiáng)的熒光，而在高濃度溶液或聚集狀態(tài)下，強(qiáng)烈的分子間相互作用產(chǎn)生大量的非輻射失活，使得有機(jī)染料分子的熒光強(qiáng)度大幅度降低，即聚集導(dǎo)致熒光猝滅。2001年，香港科技大學(xué)唐本忠院士團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)硅雜環(huán)戊二烯(Silole)衍生物在稀溶液中基本沒有發(fā)光，而在聚集態(tài)時呈現(xiàn)非常明亮的熒光發(fā)射，即聚集誘導(dǎo)發(fā)光(Aggregation Induced Emission, AIE)[13]。 AIE材料具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，能夠在很大程度上減小分子間相互作用，同時大幅限制熒光染料分子在聚集態(tài)時的分子內(nèi)轉(zhuǎn)動，有效地抑制單分子的非輻射失活過程，使其在固態(tài)或聚集狀態(tài)下的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其在稀溶液中的熒光強(qiáng)度[14]。本課題組[9]利用一種雙親性聚合物mPEG-DSPE包裹一種疏水性的AIE材料(分子式簡稱為StCN)，制備了具有熒光特性的納米膠束(StCN@PEG)，該納米膠束能夠很好地分散在水溶液中，且具有較高的穩(wěn)定性(如圖2)。光譜分析結(jié)果表明，用納米顆粒對AIE材料進(jìn)行高濃度的包覆不會引起熒光猝滅，反而會促使熒光效率的增強(qiáng)；動物實驗表明該熒光納米膠束能夠在腫瘤部位富集，用于腫瘤活體熒光成像的探針。另外，我們將能夠與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽修飾在納米膠束表面，用于提高StCN@PEG納米膠束在腫瘤部位富集的效率，實現(xiàn)靶向的腫瘤組織標(biāo)記和熒光成像診斷。

AIE材料獨特的性質(zhì)使其成為近年來的研究熱點，目前已經(jīng)開發(fā)出能夠覆蓋可見光波段的AIE熒光分子，利用AIE材料制備的熒光納米粒子，已被應(yīng)用于細(xì)胞成像、前哨淋巴結(jié)定位、活體腫瘤診斷、活體血管熒光成像等多項生物醫(yī)學(xué)研究[15-17]。在活體熒光反射成像中，生物組織對光的散射和吸收影響著熒光物質(zhì)的激發(fā)效率以及信號采集。由于生物組織在可見光波段的吸收和散射均比較明顯，因此利用可見光波段的熒光探針難以實現(xiàn)較深層組織的成像。開發(fā)高效的具有近紅外熒光激發(fā)和發(fā)射的AIE材料，對于實現(xiàn)深層組織和高對比度的活體熒光成像具有非常重要的意義[17]。

圖2 (a)StCN@PEG納米膠束制備流程圖；(b)StCN@PEG納米膠束TEM照片；(c)尾靜脈注射StCN@PEG納米探針后活 體小鼠腫瘤熒光成像診斷[9]Fig.2 (a) A schematic illustration for the preparation of StCN@PEG nanomicelles, (b) a representative TEM image of StCN@PEG nanomicelles, and (c) in vivo imaging of mice bearing subcutaneous lung tumor xenografts, injected with StCN@PEG nanomicelles[9]

3 半導(dǎo)體量子點

半導(dǎo)體量子點通常是由II-VI族或III-V族元素組成的納米顆粒，粒徑一般介于1～10 nm之間，由于其尺寸小于或者接近激子波爾半徑，材料內(nèi)部的電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，受激后可以發(fā)射熒光[18]。量子點的熒光發(fā)射取決于導(dǎo)帶與價帶間的能帶間隙，當(dāng)量子點尺寸減小時，能帶帶隙能量會增多大，其吸收和發(fā)射波長向短波方向偏移，因此量子點的熒光發(fā)射波長可以通過選擇適當(dāng)?shù)某叽邕M(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。通過選擇適當(dāng)?shù)牟牧?如CdS、CdSe、CdTe、Ag2S、PbS、PbSe等)制備適當(dāng)尺寸的納米晶體，可以獲得熒光發(fā)射譜覆蓋范圍相當(dāng)寬的系列量子點納米材料(如圖3)[19]。

圖3 典型的量子點組成材料及其對應(yīng)的熒光發(fā)射波長范圍[19]Fig.3 Representative QD core materials scaled as a function of their emission wavelength superimposed over the spectrum[19]

目前生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中半導(dǎo)體量子點主要通過化學(xué)方法制備，分為從有機(jī)相出發(fā)的高溫?zé)峤夥ê铣珊蛷乃喑霭l(fā)的水相沉淀法兩種途徑，其中高溫?zé)峤夥ㄊ亲畛Ｓ靡彩亲罱?jīng)典的量子點化學(xué)制備方法[20]。Murray C B等[21]首次系統(tǒng)地提出了高溫?zé)峤夥ㄖ苽銫dE(E=S, Se, Te)量子點的基本流程，他們將Se粉末分散到正三辛基膦(TOP)中制備TOPSe溶液，再將TOPSe與二甲基鎘(Me2Cd)加入到三辛基氧膦(TOPO)溶液中，在惰性氣體保護(hù)下，將混合溶液加熱到230～260 ℃反應(yīng)制備CdSe量子點納米晶體，通過控制反應(yīng)時間長短，能夠得到不同尺寸的量子點納米晶體。彭笑剛等[22]使用氧化鎘(CdO)、醋酸鎘(Cd(Ac)2)等更為穩(wěn)定的鎘鹽代替Me2Cd，制備了可控尺寸的CdSe量子點納米晶體。總體而言，高溫?zé)峤夥ㄖ苽淞孔狱c是利用TOPO、TOP、十八烯等作為反應(yīng)溶劑，使用不同的前驅(qū)體進(jìn)行反應(yīng)，通過控制反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度條件制備量子點納米晶體。中國科學(xué)院唐芳瓊教授等[23]首次提出在無毒的油酸-液體石蠟體系中合成CdSe量子點的方法，相比于TOPO等有機(jī)溶劑的毒性和污染，油酸和液體石蠟是無毒、無害的綠色試劑，唐教授等的研究為II-VI族量子點的“綠色”制備開辟了新的方向，對半導(dǎo)體量子點的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義[24]。

與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點具有吸收譜寬、發(fā)射譜窄、無光漂白、易于表面修飾等優(yōu)點。1998年， Alivisatos教授[25]和Nie教授[26]在Science雜志的同一期發(fā)表了各自課題組利用量子點作為生物探針用于活細(xì)胞熒光成像的研究論文，開啟了量子點在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域應(yīng)用的新篇章。經(jīng)過近20年的發(fā)展，半導(dǎo)體量子點除了作為生物成像的造影劑[19,25-29]，在光學(xué)生物傳感應(yīng)用方面也有許多令人欣喜的研究成果[20,30-32]。多種類型半導(dǎo)體量子點的化學(xué)制備和表面修飾技術(shù)日趨成熟，已經(jīng)有許多商業(yè)公司能夠為研究者提供性能良好量子點探針，特別是在可見光波段具有熒光發(fā)射的量子點。圖4展示了本課題組采用油酸-液體石蠟的“綠色”合成工藝制備PbS量子點過程示意圖，通過對所得油性PbS量子點進(jìn)行二氧化硅和聚乙二醇雙層包覆，制備了能夠在水溶液中穩(wěn)定分散的近紅外熒光納米探針，利用這種納米熒光探針實現(xiàn)了小鼠活體前哨淋巴結(jié)(SLN)定位[33]。Ag2S量子點是近年來受到極大關(guān)注的一種新型量子點，并被發(fā)展作為一種新型的近紅外II區(qū)(1.0～1.4 μm)生物熒光成像探針，應(yīng)用于淋巴管成像、腫瘤治療實時成像、干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和分布成像以及干細(xì)胞肝損傷示蹤等應(yīng)用研究[34]。武漢大學(xué)Pang等[35]設(shè)計制備了用于瞬時高效標(biāo)簽和全身細(xì)胞衍生微泡的高分辨率多模式實時追蹤的 Ag2Se@錳量子點，所得Ag2Se @錳量子點具有優(yōu)良的近紅外熒光和磁共振成像能力，可用于體內(nèi)微囊泡的高分辨率雙模式實時有效的標(biāo)記跟蹤，對體內(nèi)追蹤外泌體的行為、尋找外泌體傾向的靶器官等方面的研究具有重要推動作用。

圖4 (a)PbS量子點的制備及二氧化硅-聚乙二醇雙層包覆流程圖；(b)PbS量子點和(c)PbS@SiO2@PEG納米顆粒的TEM照片；(d)皮 下注射PbS@SiO2@PEG納米探針以后小鼠活體SLN熒光顯影照片[33]Fig.4 (a) Schematic diagram illustrating the preparation of PbS@SiO2@PEG nanoparticles, TEM images of (b) PbS QDs and (c) PbS@SiO2@ PEG nanoparticles, (d) SLN mapping of a nude mice by NIR fluorescence imaging using PbS@SiO2@PEG as probes[33]

隨著半導(dǎo)體量子點材料在多個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，它們的毒性與生物安全性也引起了科研人員的高度重視[36]。由于多數(shù)半導(dǎo)體量子點含重金屬元素(Cd, Pb, Ag等)，當(dāng)量子點的晶格由于某些作用被破壞以后會釋放出游離的重金屬離子，而大多數(shù)重金屬離子對細(xì)胞和生物組織有很強(qiáng)的毒性作用。盡管能夠通過表面包覆的方法降低量子點中重金屬離子的泄露，其潛在的生物毒性和環(huán)境污染仍舊是無法回避的問題。因此，環(huán)境友好的量子點是一個重要的發(fā)展方向。

4 碳基熒光納米材料

碳元素因其獨特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的物理性質(zhì)，一直都是物理學(xué)、材料科學(xué)以及電子技術(shù)領(lǐng)域研究人員關(guān)注的焦點。碳基熒光納米材料包括納米金剛石、碳納米管、氧化石墨烯納米顆粒、碳基量子點等幾種類型[37]。納米金剛石是尺寸在100 nm以下具有納米金剛石結(jié)構(gòu)的碳材料，通過對納米金剛石進(jìn)行氮、硼等元素?fù)诫s，能夠獲得具有優(yōu)良熒光特性納米金剛石顆粒[38]。在生物體內(nèi)，可以通過單個納米顆粒的追蹤和檢測，研究特定的活細(xì)胞行為[39]。然而納米金剛石制備、元素?fù)诫s困難等問題，限制了納米金剛石作為熒光探針的應(yīng)用。碳納米管(CNT)在近紅外波段的熒光特性[40-43]，使其作為近紅外二區(qū)(1000～1700 nm)的熒光成像探針，在活體動物熒光成像領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。美國斯坦福大學(xué)Dai等[44]將水溶性碳納米管注射到活體小鼠血液中，然后利用近紅外二區(qū)熒光成像技術(shù)，能夠獲得活體動物血管成像信息。盡管碳納米管近紅外熒光特性在生物醫(yī)學(xué)成像研究中具有獨特優(yōu)勢，由于碳納米管尺寸較大難以在體內(nèi)代謝并且有潛在的毒性問題[45,46]，限制了其在作為生物探針在活體動物中的應(yīng)用，發(fā)展具有更高生物兼容性的近紅外二區(qū)納米熒光探針具有重要價值。

氧化石墨烯(GO)納米材料是只有一層碳原子的典型的二維納米結(jié)構(gòu)材料，它的邊緣邊緣和基面帶有豐富的羧基、羥基等含氧基團(tuán)，因此這種材料具有良好的生物相容性其易于表面功能化。對于不含氧化基團(tuán)的石墨烯材料而言，由于沒有能帶間隙，所以基本上不能發(fā)熒光，而GO材料由于表面存在一些缺陷和含氧基團(tuán)，使得GO產(chǎn)生了帶隙，因此能夠產(chǎn)生熒光現(xiàn)象[47]。Sun等[48]研究并報道了GO在近紅外波段的熒光特性，利用聚乙二醇修飾的GO作為近紅外熒光成像探針，實現(xiàn)了離體細(xì)胞的熒光成像。Li等[49]報道了GO的雙光子熒光特性，并且利用轉(zhuǎn)鐵蛋白和聚乙二醇共同修飾的GO作為探針，實現(xiàn)了離體細(xì)胞的雙光子熒光成像。本課題組[50]報道了GO在飛秒激光激發(fā)下的雙光子/三光子熒光效應(yīng)，并且利用雙光子熒光成像技術(shù)觀察到了GO熒光納米顆粒在活體小鼠靜脈內(nèi)的分布與代謝(如圖5)。

圖5 (a)由石墨經(jīng)強(qiáng)酸氧化制備GO熒光納米顆粒的過程示意圖； (b)GO熒光納米顆粒的吸收光譜，及405 nm光激發(fā)下的熒 光光譜；(c)GO熒光納米顆粒在波長為800 nm和波長為 1260 nm的飛秒脈沖激光激發(fā)下的光致發(fā)光光譜；(d)雙光 子激發(fā)的GO熒光納米顆粒在活體小鼠耳部血管的熒光成像[50]Fig.5 (a) Synthesis of GO nanoparticles from bulk graphite, (b) extinction spectrum and one-photon induced luminescence spectrum of an aqueous dispersion of GO nanoparticles, (c) two-and three-photon induced luminescence spectra of GO nanoparticles, (d) two-photon excited fluorescence imaging of the blood vessel of mouse based on GO nanoparticles[50]

碳基量子點( Carbon Quantum Dots，CQDs)，又稱碳點或者碳納米點，是近年來出現(xiàn)的一類新型熒光納米材料[51]。在光學(xué)性能方面，碳基量子點具有同傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點相比擬的優(yōu)點，如激發(fā)光譜寬且連續(xù)、熒光穩(wěn)定性高、熒光波長可調(diào)等[52]。此外，由于碳基量子點的主要元素組成為C, H, O, N等，與重金屬基半導(dǎo)體量子點相比，具有良好的生物相容性，引起了研究者的廣泛關(guān)注[53,54]。碳基量子點的制備方法已有很多報道，主要包括“自上而下(Top-Down)”法和“自下而上(Bottom-Up)”法兩類[53]。自上而下的工藝是從大尺寸的碳靶剝離或粉碎而獲得小尺寸的碳量子點，包括電弧放電法、激光銷蝕法和電化學(xué)剝離等方法[55,56]；自下而上的工藝是指用小分子作前驅(qū)體通過聚合碳化等化學(xué)反應(yīng)形成納米尺寸的碳量子點，主要有燃燒法、熱解法、微波法等方法[57,58]。圖6展示了我們課題組利用牛奶作為碳源，在微波加熱條件下制備碳基量子點的示意圖，所制得的碳基量子點平均粒徑為3 nm，能夠作為熒光探針對HeLa細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[58]。

圖6 (a)牛奶作為碳源經(jīng)微波加熱制備碳基量子點的反應(yīng)過程 示意圖；(b)碳基量子點的TEM照片；雙光子激發(fā)的細(xì)胞 熒光成像(c)不作任何處理的對照組HeLa細(xì)胞，(d)同碳 基量子點共同孵育2 h后的HeLa細(xì)胞[58]Fig.6 (a) A schematic diagram for the preparation of CDs from milk by microwave cooking, (b) a typical TEM image of CDs, two-photon excited fluorescence intensity images of HeLa cells (c) without the CD treatment and (d) incubated with CDs for 2 h[58]

穩(wěn)定的熒光特性、低生物毒性，使碳基量子點成為理想的生物熒光成像探針材料。Zhou 等[59]用多環(huán)芳香碳?xì)浠衔镒鳛榍膀?qū)體，采用自下而上的方法合成了碳基量子點，所制備的碳基量子點能夠進(jìn)入MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，與傳統(tǒng)的細(xì)胞熒光成像染料(Alexa Fluor 488)及熒光素相比，碳基量子點在激光持續(xù)照射下，熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定，能夠適應(yīng)長期熒光追蹤和成像的需求。通過在碳量子點表面連接胰島分子，Zheng 等[60]利用全內(nèi)反射熒光成像技術(shù)，實時觀察到了碳量子點在細(xì)胞膜表面的動態(tài)過程。Nurunnabi 等[61]將碳量子點通過尾靜脈注射到長有腫瘤的小鼠體內(nèi)，一定時間后，通過活體熒光成像技術(shù)在腫瘤組織部位觀察到了碳量子點的熒光信號。Ge等[62]利用聚噻吩衍生物作為碳源，制備了具有近紅外熒光發(fā)射的碳量子點，該類型碳量子點在光照條件下，能夠通過多重敏化產(chǎn)生活性氧，用于殺死腫瘤細(xì)胞，從而實現(xiàn)腫瘤的光動力治療。

理想的生物熒光成像探針需要滿足以下基本要求：生物媒介中具有很好的分散性，與目標(biāo)單位特異性結(jié)合的能力，較高的近紅外吸收和光致發(fā)光效率，良好的化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性等基本要求[63]。因此設(shè)計并制備具有近紅外熒光特性的碳基量子點是熒光納米探針開發(fā)方面的一個重要方向。另外，通過納米技術(shù)和納米化學(xué)的方法，制備同時具有熒光成像和疾病治療等多功能的熒光碳納米材料，研究熒光碳納米材料在疾病治療方面的獨特優(yōu)勢，有望為臨床腫瘤治療提供新的解決方案。

5 稀土摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料是摻雜有稀土元素的納米晶體，可以吸收兩個或兩個以上的紅外光子，發(fā)射一個可見光子或近紅外光子[64]。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料、量子點等發(fā)光材料相比，上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料用于生物光子學(xué)研究有著眾多不可替代的優(yōu)勢。比如，較低的細(xì)胞毒性和較高的生物兼容性；幾乎為零的背景噪聲；區(qū)別于普通熒光染料的長熒光壽命；無光漂白性等[65,66]。美國紐約州立大學(xué)布法羅分校Prasad教授研究課題組[67]通過尾靜脈注射上轉(zhuǎn)換熒光納米材料到小鼠體內(nèi)，利用活體熒光成像手段檢測到了上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在小鼠肝臟和脾臟內(nèi)的分布，獲得了具有非常高對比度的深層光學(xué)成像結(jié)果。復(fù)旦大學(xué)李富友教授課題組[68,72]在上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的表面修飾、活體分布研究及生物毒性分析等方面做了大量的原創(chuàng)性工作。蘇州大學(xué)劉莊教授課題組[73,74]設(shè)計了基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的多功能納米結(jié)構(gòu), 可以利用一種納米材料同時實現(xiàn)熒光成像、磁共振成像及光熱治療。新加坡國立大學(xué)Zhang Y課題組[75-76]對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒進(jìn)型多孔二氧化硅包覆的同時將光動力藥物包覆在多孔結(jié)構(gòu)中，在二氧化硅層表面修飾葉酸分子提高納米顆粒的在腫瘤組織部位的聚集效率，隨后用近紅外激光照射腫瘤部位，由于上轉(zhuǎn)化發(fā)光納米顆?？梢詫⒔t外激發(fā)光轉(zhuǎn)化為可見光并將能量轉(zhuǎn)移給光動力藥物，光動力藥物吸收能量后能夠產(chǎn)生活性氧從而殺死腫瘤細(xì)胞。這種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒的近紅外激發(fā)光動力治療技術(shù)為深層光學(xué)生物治療提供了可能。

詹求強(qiáng)等[77]發(fā)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像技術(shù)中傳統(tǒng)激發(fā)模式980 nm激光存在高熱損傷組織和深度成像能力差等問題，通過理論計算和實驗進(jìn)行激發(fā)模式優(yōu)化，指出了商業(yè)化的915 nm激光器在上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料用于細(xì)胞和組織成像中的低熱效應(yīng)以及深度組織成像中的優(yōu)勢(如圖7)。這一新的成像方式得到了廣泛關(guān)注和認(rèn)可，為基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的生物光學(xué)成像技術(shù)的研究提供了新的思路[66]。

圖7 實驗測量的(a) 915 nm和(b) 980 nm激光照射老鼠活體表 皮加熱溫度在時刻0, 1, 3和5 min時的空間分布情況以 及(c)光束中心區(qū)域直徑方向上的溫度曲線 [77]Fig.7 Experimental temperature distributions after different irradiation times for (a) 915 nm laser irradiated mouse skin and (b) 980 nm laser irradiated mouse skin, (c) the corresponding temperature line profiles [77]

6 結(jié) 語

基于熒光納米材料的生物成像研究是一個多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域，涉及到物理、化學(xué)、光學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多方面的知識，在這個快速發(fā)展的研究領(lǐng)域，新材料、新技術(shù)、新應(yīng)用層出不窮。本文結(jié)合我們前期的研究基礎(chǔ)，概述了基于有機(jī)熒光染料的納米顆粒、半導(dǎo)體量子點、碳基熒光納米材料和稀土摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料等幾種類型熒光納米材料，涉及了熒光納米材料在細(xì)胞成像、活體腫瘤診斷、淋巴與血管成像、手術(shù)的可視化指導(dǎo)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的諸多應(yīng)用。但由于我們的研究和論文篇幅有限，難以囊括熒光納米材料及其生物成像應(yīng)用的全部主題[63,65,78-80]。通過本文的論述可以看到，盡管國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)取得了很多研究成果，要想將這些成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，一些挑戰(zhàn)性的問題仍然存在：近紅外熒光成像的應(yīng)用是生物熒光成像的發(fā)展趨勢，設(shè)計制備具有低生物毒性的近紅外熒光納米材料是生物醫(yī)用熒光探針發(fā)展的一個重要方向；與傳統(tǒng)的單光子熒光激發(fā)模式相比，多光子熒光成像所需激發(fā)光波長更長，在生物組織的吸收和散射較小，能夠顯著提高生物成像分辨率及成像深度，已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的重要工具，納米材料的多光子熒光特性研究，對于開發(fā)新型的多光子激發(fā)熒光探針具有重要價值；納米材料的細(xì)胞毒性、組織器官毒性等生物醫(yī)學(xué)評估研究，是人們認(rèn)識新材料、應(yīng)用新材料必不可少的環(huán)節(jié)通過對材料毒性的研究分析，也能夠指導(dǎo)材料的設(shè)計和制備，對于開發(fā)具有更好生物兼容性的生物醫(yī)用材料，具有非常重要的意義。

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(編輯 吳 琛)

Fluorescent Nanomaterials and Their Applications in Bioimaging

PU Yuan1，WANG Dan1，QIAN Jun2，CHEN Jianfeng1

(1.State Key Laboratory of Organic-Inorganic Composites, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)(2.State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentations, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Fluorescence imaging is one of the most widely used imaging techniques in biomedical research. Along with the rapid development of nanotechnology, different kinds of fluorescent nanomaterials with excellent properties are constantly emerging. Compared to traditional fluorescent molecules, fluorescent nanomaterials show many advantages, such as superior photostability, tunable morphology and size, as well as multifunction. Fluorescence imaging based on nanomaterials offers a unique approach that can be used to visualize morphological details for bio-species, ranging from living cells to animals, forming a major thrust in the fields of materials, optics, biomedical and so on. In this article, we will present a focused review on various types of fluorescent nanomaterials, including organic dye doped nanoparticles, semiconductor quantum dots, and fluorescent carbon nanomaterials. The applications of these nanomaterials in bioimaging will be summarized with examples. We will also discuss some challenges and opportunities for the use of fluorescent nanomaterials in biomedical diagnosis and therapy.

fluorescent nanomaterials; semiconductor quantum dots; carbon dots;upconversion nanophosphors; bioimaging

2016-08-31

國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項目(51641201)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(BUCTRC201601)

蒲 源，女，1980 年生，副教授

王 丹，男，1988 年生，副教授，碩士生導(dǎo)師， Email：wangdan@mail.buct.edu.cn

10.7502/j.issn.1674-3962.2017.02.04

TB383.1

A

1674-3962(2017)02-0103-09