侯俊杰,倪志強,楊 影,周 穎,譚 巖,方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院 腫瘤綜合治療科,吉林 長春130021)

二甲雙胍對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231體外抑制作用的研究

侯俊杰,倪志強,楊 影,周 穎,譚 巖,方艷秋*

(吉林省人民醫(yī)院 腫瘤綜合治療科,吉林 長春130021)

目的 探討二甲雙胍對三陰乳腺癌細胞的抑制作用和可能的損傷機制。方法 利用MTT、流式細胞儀檢測二甲雙胍對MDA-MB-231乳腺癌細胞周期的影響及誘導凋亡作用；應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測加藥后MDA-MB-231乳腺癌細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1 / 2)磷酸化表達水平變化。結(jié)果 不同濃度二甲雙胍作用MDA-MB-231乳腺癌細胞系24、48 h后細胞增殖被不同程度抑制，并呈時間和濃度依賴性(P<0.05)；可促進MDA-MB-231乳腺癌細胞系凋亡，并呈濃度依賴性(P<0.05)；細胞周期檢測，與對照組比較，G0/G1期比例增加(P<0.05)，S期比例逐漸降低(P<0.05)，G2/M期比例無明顯變化(P>0.05)；藥物處理MDA-MB-231乳腺癌細胞系24 h后，Western blot檢測示隨藥物濃度的增加，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)磷酸化表達水平下降(P<0.05)。結(jié)論 二甲雙胍對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖有抑制作用，下調(diào)P-ERK1/2的表達可能是其抗腫瘤機制之一，可能成為三陰乳腺癌潛在的維持治療藥物。

二甲雙胍;乳腺癌；損傷

三陰性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的亞型，其特異性地指缺乏雌激素受體、孕酮受體和人表皮生長因子受體-2表達的乳腺癌，發(fā)生率占乳腺癌的15%，常發(fā)生在40歲以下的女性，具有特殊的生物學行為特征，如高病理組織學分級、不良預后、3年復發(fā)率高、5年生存率低、侵襲性強、易局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移等[1]。 目前，TNBC已分為基底樣TNBC(BL-TNBC)和非基底樣TNBC(NB-TNBC)[2]。 因為無ER、PR的表達和缺乏HER-2過表達，TNBC對內(nèi)分泌治療和曲妥珠單抗的靶向治療均無反應(yīng)，化療是TNBC的主要治療手段，并且目前無有效且耐受性好的維持治療藥物，因此，相對于其它類型乳腺癌治療手段有限，預后差。二甲雙胍是一種抗糖尿病藥物，也是一種公認的潛在抗腫瘤抗腫瘤藥物。最近一項研究證明：二甲雙胍能抑制MCF-7細胞的增殖、阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡等[3]。然而，MCF-7細胞僅代表乳腺癌一種亞型，不能預知其對三陰乳腺癌細胞的治療反應(yīng)情況，鑒于這種情況，我們在體外觀察二甲雙胍對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231作用，探討二甲雙胍對三陰乳腺癌細胞的抑制作用和可能的損傷機制，為二甲雙胍成為三陰乳腺癌維持治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 MDA-MB-231細胞為我院醫(yī)學診治實驗中心提供。

1.1.2 試劑及其來源 二甲雙胍片劑(0.85 g/片)由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)；DMEM培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清由四季青公司生產(chǎn)；MTT由上海綠鳥科技有限公司提供; 用于檢測Annexin-V / PI細胞凋亡和PI單克隆細胞周期檢測的試劑盒由BaoTech公司生產(chǎn)；兔抗人P-ERK1/2一抗由Cell Signaling 公司生產(chǎn)，鼠抗兔二抗為北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品；RNA酶、TEMED，PVDF膜均購自鼎國公司; 分子量標記物購自Po-Tektronix；蛋白酶抑制劑Cocktail片劑購自Roche公司。定影劑，顯影劑和膠片是柯達產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231細胞在含有10%滅活的胎牛血清(含有2 mmol / L谷氨酰胺)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。24-48 h傳代1次，用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測 應(yīng)用MTT法檢測細胞增殖：在對數(shù)生長期收獲MDA-MB-231細胞，以1×106/ml接種于96孔板，每孔100 μl，每組時設(shè)5個復孔，加入二甲雙胍(終濃度10、20、40、80、160 mmol/L)作用24和48 h后，棄去上清，每孔加入20 μl MTT，在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng)4 h，加入(10%SDS 10 g+5%異丁醇5 ml+10 mol/L HCl 0.1 ml)過夜。 通過紫外分光光度計測量570 nm處的吸光度(A)值。 細胞增殖的抑制率計算如下：抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照A值)×100%。

1.2.3 Annexin V/PI染色法檢測細胞凋亡 取生長對數(shù)期的細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，接種于6孔板，每孔2 ml，分別加入不同濃度二甲雙胍(終濃度分別為10、20、40、80 mmol/L)，每組設(shè)3個復孔，培養(yǎng)24 h收集各組細胞，按照PI單染說明書，上流式細胞儀檢測細胞DNA含量，分析細胞周期。按照Annexin V/PI試劑盒說明書，取1×106個/ml細胞以PBS洗滌2次，加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻后避光室溫孵育10 min，4 ℃離心棄上清后，先后加入 AnnexinV-FITC 190 μl、PI 10 μl，避光冰浴反應(yīng)10 min,經(jīng)流式細胞儀(FACS)檢測，用Cell Quest軟件分析細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.4 PI單染色法檢測細胞周期情況 在對數(shù)生長期將細胞密度調(diào)節(jié)至1×106個細胞/ml。將細胞接種在具有2 ml每個孔的6孔板中。 二甲雙胍的終濃度分別為10,20,40 mmol / L和空白對照組。 在培養(yǎng)后24 h收集細胞。 根據(jù)PI染色的說明將細胞濃度調(diào)節(jié)至1×106個細胞/ml，離心5 min，棄上清，加入1 ml冰浴預冷PBS，輕輕搖動細胞懸液，再離心5 min，棄上清，每管樣品中加入碘化丙啶染色液(預先配好)0.5 ml，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30 min，24 h內(nèi)通過流式細胞術(shù)檢測，Cell Quest軟件分析。

1.2.5 Western blot檢測P-ERK1/2蛋白表達 將密度為1×106個/ml的MDA-MB-231細胞加入不同濃度二甲雙胍溶液中，于37℃含5%CO2孵箱中孵育24 h后，冰PBS洗滌，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃下15 000轉(zhuǎn)離心3 min，收集上清液測定蛋白濃度。取等量總蛋白進行SDS-PAGE的蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入P-ERK1/2抗體，孵育過夜后加入二抗，再孵育、顯色。結(jié)果使用圖像處理器進行灰度分析，使用β-肌動蛋白作為內(nèi)部參照。

使用SPSS18.3統(tǒng)計軟件， 結(jié)果表示為平均值±標準差，獨立樣本t檢驗分析，P<0.05的差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞增殖抑制

MTT法檢測不同濃度的二甲雙胍對MDA-MB-231細胞不同時間后其吸光度A值的變化，繪制二甲雙胍對細胞抑制率曲線(圖1)。結(jié)果提示，二甲雙胍對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用呈時間濃度依賴性，時間越長，濃度越大，抑制率越高。

圖1 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞抑制率曲線

2.2 流式細胞儀PI法檢測二甲雙胍對MDA-MB-231細胞周期的影響

結(jié)果提示，隨藥物濃度增加，G0/G1期比例增加，S期比例逐漸降低，G2/M期比例無明顯變化，提示二甲雙胍對MDA-MB-231細胞阻滯在G1期(表1、圖2)。

表1 二甲雙胍作用24 h后MDA-MB-231細胞 周期變化

注：與陰性對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.3 流式細胞儀AnnexinV/PI法檢測細胞凋亡

通過AnnexinV/PI測定檢測凋亡細胞(見表2，圖3)。 結(jié)果表明，當濃度為10-80 mmol/L時，凋亡率隨藥物濃度的增加而增加，在80 mmol/L時達到最高(P<0.01)，與對照組比較，在藥物濃度20-80 mmol/L之間時，誘導MDA-MB-231細胞凋亡呈藥物濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。

圖2 流式細胞儀PI法檢測二甲雙胍MDA-MB-231細胞周期影響

圖3 不同濃度二甲雙胍對MDA-MB-231細胞2凋亡影響

Concentrationofdrug(mmol/l)Earlyapoptoticrate(%)Totalapoptoticrate(%)0(control)100.41±0.03 3.41±0.51 1.21±0.30 7.37±0.92 2040808.23±0.38**11.27±1.31** 16.72±2.62** 15.77±2.94** 21.41±1.83**25.10±2.25**

注：與陰性對照組比較，**P<0.01

2.4 western bolt技術(shù)檢測二甲雙胍對P-ERK1/2蛋白表達的影響

不同濃度二甲雙胍處理MDA-MB-231細胞24小時后，western blot檢測P-ERK1/2的表達，光密度掃描。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加P-ERK1 / 2蛋白表達下降 (圖4)。

3 討論

二甲雙胍的抗腫瘤活性及其可能作為傳統(tǒng)腫瘤治療中的維持治療藥物，在許多類型的癌癥中已經(jīng)得到證實[4-6]。然而，二甲雙胍對不同乳腺癌細胞譜

圖4 western blot檢測P-ERK1/2的表達

系的作用仍然知之甚少。因此，應(yīng)用乳腺癌細胞系MDA-MB-231來驗證二甲雙胍的作用。本實驗證實，二甲雙胍能夠抑制乳腺癌細胞系MDA-MB-231的增殖，且其作用呈現(xiàn)時間劑量依賴性，與常見實體腫瘤細胞橫向比較，本研究的抑制率高于相關(guān)研究[7]，同時該藥可誘導MDA-MB-231細胞凋亡、G1/S期阻滯，并抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞外磷酸化信號調(diào)節(jié)激酶1和2(P-ERK1 / 2)的表達。

目前，細胞周期阻滯的機制受到越來越多的關(guān)注。 細胞周期阻滯也是腫瘤治療的重要靶標。 G1/S是細胞周期細胞分裂和增殖中最重要的調(diào)節(jié)點。 如果在G1/S期發(fā)生異常，可能導致正調(diào)節(jié)功能過度增強或負調(diào)節(jié)功能減弱或缺失，從而誘導腫瘤發(fā)生[8]。 此外，G1/S也是DNA復制、損傷和修復的關(guān)鍵時期，當損傷的DNA可以修復時，則繼續(xù)存活，如果DNA損傷不能有效修復，則細胞開始凋亡程序[9- 10]，所以調(diào)節(jié)細胞周期并促進其凋亡已成為治療腫瘤的靶標之一。本實驗說明隨二甲雙胍藥物濃度的增加MDA-MB-231乳腺癌細胞G0/G1期百分比亦逐漸升高，S期百分比逐漸下降，G2/M期變化無統(tǒng)計學意義，提示在二甲雙胍的作用下，可能影響了MDA-MB-231乳腺癌細胞的細胞周期分布，使大多數(shù)細胞阻滯在G0/ G1期，阻礙其向S期轉(zhuǎn)化，阻滯了細胞的DNA合成及有絲分裂，因此抑制了MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖，所以，二甲雙胍對MDA-MB-231乳腺癌細胞周期的調(diào)節(jié)是其抑制腫瘤細胞增殖的機制之一。

P-ERK1/2的已被認為是在腫瘤細胞的遷移和侵襲的關(guān)鍵分子之一，是絲裂原活化蛋白激酶的重要成員 (MAPK)家族之一，也是IGF1/MEK/P-ERK/S6通路上關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，在促進腫瘤細胞增殖、遷移、細胞因子分泌等方面起到至關(guān)重要的作用[11-14]。

本研究在不同濃度二甲雙胍處理細胞24小時后， Western blot檢測提示：隨藥物濃度的增加，磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(P-ERK1/2)表達下降，以上研究結(jié)果表明：二甲雙胍作用MDA-MB-231乳腺癌細胞24小時后，抑制了P-ERK1/2蛋白合成，由于P-ERK1/2是腫瘤生長信號通路IGF1/MEK/P-ERK/S6中關(guān)鍵正性調(diào)控因子及調(diào)節(jié)酶，所以二甲雙胍可能通過下調(diào)P-ERK1/2表達，必然干擾了該通路信號傳導，直接和或間接地破壞了腫瘤微環(huán)境，從而起到抑制三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖作用。

綜上所述，二甲雙胍可能通過直接抑制MDA-MB-231細胞P-ERK1/2蛋白合成、干擾或阻斷IGF1/MEK/P-ERK/S6通路、阻滯細胞的G1/S期等對MDA-MB-231細胞系行多途徑、多靶點抑制。

目前，乳腺癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年增加且年輕化[15]，雖然新藥及臨床試驗層出不窮，主要針對激素依賴性乳腺癌，而對三陰乳腺癌復發(fā)耐藥及維持治療等方面并不樂觀，缺少有效既經(jīng)濟又耐受性良好的維持治療藥物。二甲雙胍是II型糖尿病治療的一線藥物，目前研究證明，其為“多用途”藥物，除能調(diào)節(jié)血糖外，被證實其新用途是能抑制腫瘤細胞增值、促進腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期等，具有廣泛抗瘤活性[16]，且廉價，患者易耐受，利于臨床應(yīng)用。因此，根據(jù)二甲雙胍對三陰乳腺癌細胞的抗瘤機制及三陰乳腺癌發(fā)病機制，二甲雙胍有可能成為三陰乳腺癌潛在的臨床維持治療藥物。

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本文受吉林省衛(wèi)生計生委項目(NO.20132093)資助

1007-4287(2017)02-0295-05

R737.9

A

侯俊杰(1979-) ，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤綜合治療方面的研究；方艷秋(1968-) ，女，博士，教授，主要從事 惡性腫瘤的診斷與治療的臨床與科研工作。

2016-11-08)

*通訊作者