於洪建，李赫宇，于瀅慧，李歡，吳春福，4，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)社會(huì)藥學(xué)研究中心，遼寧沈陽(yáng)110016；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；3.天津蕓熙生物技術(shù)有限公司，天津300457；4.沈陽(yáng)藥科大學(xué)食品藥學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110016）

紅酒泥成分的UPLC-Q-TOF-MS分析

於洪建1，李赫宇2，于瀅慧2，李歡3，吳春福1，4，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)社會(huì)藥學(xué)研究中心，遼寧沈陽(yáng)110016；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；3.天津蕓熙生物技術(shù)有限公司，天津300457；4.沈陽(yáng)藥科大學(xué)食品藥學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110016）

為了更好地綜合開發(fā)利用紅酒泥，本試驗(yàn)采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)，對(duì)紅酒泥中主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析及鑒定。結(jié)果表明：經(jīng)分析共鑒定出23種化學(xué)成分，主要分為以下五類：有機(jī)酸類，酚酸類，多酚類，黃酮類，以及糖苷類。

紅酒泥；化學(xué)成分；UPLC-Q-TOF-MS；多酚；抗氧化

紅酒泥是指葡萄酒生產(chǎn)中產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)，是葡萄酒釀造過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，其生成量約占葡萄酒產(chǎn)量的4%～5%[1-2]。在葡萄酒成熟期間，酒泥中的酵母自溶，形成了核苷、核苷酸、氨基酸、肽、葡聚糖、甘露蛋白等[3-5]，不僅增加了酒的結(jié)構(gòu)感和圓潤(rùn)度，提高澄清度，同時(shí)也是功能性食品中的主要營(yíng)養(yǎng)成分[6-7]。葡萄酒帶酒泥在橡木桶中陳釀數(shù)月，酒泥能抑制其氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行，并產(chǎn)生多種具有良好的抗氧化作用的有效成分[8-9]。

超高效液相聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF-MS）具有高分辨率、高靈敏度、高選擇性、用時(shí)短、掃描范圍廣等特點(diǎn)，是一種在定性分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的液質(zhì)聯(lián)用儀。本試驗(yàn)以紅酒泥為原料，采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)紅酒泥中主要成分進(jìn)行了分析，根據(jù)化學(xué)成分的質(zhì)譜信息及與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，共鑒定出23種化學(xué)成分，為更好地開發(fā)利用紅酒泥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司，型號(hào)ACQUITY UPLC，配置Waters AcquityUPLCBEH C18色譜柱；質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司，型號(hào)Q-TOF Premier，配有LockSpray離子質(zhì)量校正器和電噴霧離子源（ESI），工作站為Masslynx4.1；超純水儀：美國(guó)Millipore公司，型號(hào)Milli-Q；超聲波儀：美國(guó)Branson公司，型號(hào)CPX8800-C；分析天平：美國(guó)Sartorius公司，型號(hào)BSA224S-CW；離心機(jī)：德國(guó)Hettich公司，型號(hào)MIKRO 220R。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜級(jí)；紅酒泥：由天津益倍建生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

稱取10mg紅酒泥粉末，置于2mLEP管中，加入1mL 75%甲醇超聲溶解30min（40 kHz，500W），冷卻至室溫，12 000 r/min高速離心15min，取上清液以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取4μL用于UPLC-Q-TOFMS檢測(cè)，其余濾液留作待測(cè)樣品備用。

1.3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

1.3.2.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）；柱溫30℃；進(jìn)樣量4μL；流動(dòng)相：乙腈（A），0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（B），梯度洗脫，流動(dòng)相流速為0.4mL/min，流動(dòng)相洗脫表見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫表Table1 Mobile phase elution table

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

本試驗(yàn)使用Waters Synapt G2 HDMS質(zhì)譜儀，測(cè)量采用電噴霧離子源（ESI），數(shù)據(jù)采集采用Masslynx 4.1工作站。

正離子模式：毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度110℃；錐孔電壓30 V；錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑霧化氮?dú)鉁囟?50℃；脫溶劑霧化氮?dú)饬髁?00 L/h；檢測(cè)器電壓為1 900 V；采樣頻率0.1 s，掃描間隔延時(shí)0.02 s；質(zhì)量數(shù)檢測(cè)范圍100Da～1 500Da；內(nèi)參校準(zhǔn)液Lockmass采用亮氨酸腦啡肽（LEA），內(nèi)參設(shè)定為[M+H]+= 555.293 1。

負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓2.5 kV；離子源溫度110℃；錐孔電壓45V；錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑霧化氮?dú)鉁囟?50℃；脫溶劑霧化氮?dú)饬髁?00 L/h；檢測(cè)器電壓1900V；采樣頻率0.1 s，掃描間隔延時(shí)0.02 s；質(zhì)量數(shù)檢測(cè)范圍100Da～1 500Da；內(nèi)參校準(zhǔn)液Lockmass采用亮氨酸腦啡肽（LEA），內(nèi)參設(shè)定為[M-H]-=553.2775。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅酒泥UPLC-Q-TOF-MS圖譜

紅酒泥UPLC-Q-TOF-MS圖譜如圖1所示，從圖中可以清晰地看出紅酒泥中的各成分被很好地分離開。

2.2 紅酒泥中化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 紅酒泥UPLC-Q-TOF-MS分析Fig.1 The UPLC-Q-TOF-MS analysis of wine lees

各組分經(jīng)UPLC分離后，通過(guò)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF-MS）對(duì)紅酒泥中的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。由于不同的化學(xué)成分在不同的模式下響應(yīng)度不同，因此本試驗(yàn)分別在正、負(fù)兩種離子模式下分別對(duì)紅酒泥進(jìn)行分析。一級(jí)質(zhì)譜測(cè)定得到化合物的[M+H]+或[M-H]-等準(zhǔn)分子離子峰的相關(guān)信息，通過(guò)這些物質(zhì)的精確分子量，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜中的碎片信息和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，以及標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，可推測(cè)化合物可能的結(jié)構(gòu)式。通過(guò)上述分析方法，在紅酒泥中共鑒定出23種化學(xué)成分，具體鑒定結(jié)果見表2。

表2 紅酒泥中化學(xué)成分鑒定分析表Table2 The chemical composition analysis table of wine lees

以10號(hào)峰為例，闡述鑒定過(guò)程。由一級(jí)質(zhì)譜圖可知其負(fù)離子模式下質(zhì)荷比（m/z）為289.076 0，可視其為得到一個(gè)電子，即[M-H]-=289.076 0，因此實(shí)際測(cè)得成分分子量應(yīng)為290.076 0。根據(jù)元素組成分析可推測(cè)其化學(xué)式應(yīng)為C15H14O6，理論分子量為290.078 5，實(shí)測(cè)值為290.076 0。分析其二級(jí)質(zhì)譜圖可知，分子量為271的碎片可視為原結(jié)構(gòu)脫離一個(gè)水分子即[M-H-H2O]-；分子量為245的碎片可視為原結(jié)構(gòu)脫離一個(gè)二氧化碳即[M-H-CO2]-。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]紅酒泥中含有兒茶素，其相對(duì)分子質(zhì)量為290，相同質(zhì)譜條件下兒茶素對(duì)照品與其裂解規(guī)律一致，因此推斷10號(hào)峰為兒茶素。按照此方法可推斷出其它物質(zhì)結(jié)構(gòu)。各成分具體結(jié)構(gòu)見圖2。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)紅酒泥中所含主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，共鑒定出23種化學(xué)成分。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，紅酒泥中的化學(xué)成分主要分為以下幾類：有機(jī)酸類（酒石酸、蘋果酸），酚酸類（肉桂酸、紫丁香酸、咖啡酸等），多酚類（白藜蘆醇、兒茶素、白皮杉醇等），黃酮類（山奈酚、槲皮素、楊梅素等），以及糖苷類（芍藥素-3-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-3-O-葡萄糖苷、Petunidin-3-O-glucoside等）成分。

從圖譜中可以看出，兒茶素、表兒茶素、矮牽牛素、槲皮素等黃酮成分在紅酒泥中含量較高，可能作為紅酒泥中的主要成分。其次，紅酒泥中含有大量的鄰二酚羥基、間二酚羥基結(jié)構(gòu)，除了槲皮素、兒茶素等成分，原花青素、白藜蘆醇等也具有強(qiáng)還原性，這些成分可能在紅酒泥的抗氧化效果中起主要作用。此外，鞣花酸是新被證實(shí)的抗衰老的明星分子urolithin A的前體，當(dāng)其被攝入機(jī)體后可以被腸道中生存的微生物轉(zhuǎn)化成為urolithin A。而urolithin A的分子可以幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞中線粒體的功能，從而延緩機(jī)體衰老。

圖2 紅酒泥中各成分化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structure of composition in wine lees

4 展望

隨著葡萄酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)每年會(huì)產(chǎn)生4萬(wàn)噸的葡萄酒泥，在實(shí)際生產(chǎn)中，大多數(shù)企業(yè)直接排放，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。然而，通過(guò)上述試驗(yàn)對(duì)紅酒泥主要化學(xué)成分的分析可知，紅酒泥中富含多種對(duì)人體有益的天然活性成分，如對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究開發(fā)，將其應(yīng)用在在化妝品，保健品以及天然藥物方面，不僅可以充分利用資源、減少環(huán)境壓力，還可以創(chuàng)造客觀的經(jīng)濟(jì)效益。

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The UPLC-Q-TOF-MS Analysis of Wine Lees

YU Hong-jian1，LI He-yu2，YU Ying-hui2，LI Huan3，WU Chun-fu1，4，*
（1.Social Medicine Research Center of Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，Liaoning，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Yunxi Biotech Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；4.Food and Medicine Teaching and Research Section of Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，Liaoning，China）

This experiment adopts the method of UPLC-Q-TOF-MS to analyze the main ingredient in wine lees，for better comprehensive exploitation and utilization of the wine lees.The results showed that，by the analysis identified 23 kinds of chemicals，mainly divided into the following five categories including phenolic acids，polyphenols，flavonoid and glycoside.

wine lees；chemical composition；UPLC-Q-TOF-MS；polyphenol；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.035

2016-10-14

於洪建（1967—），男（漢），高級(jí)工程師，博士，研究方向：植物提取物和健康食品的開發(fā)。

*通信作者：吳春福（1959—），男（漢），教授，博士，研究方向：中藥藥理。