吳凱強，姜維，郭健，應知偉，宋文東，*

（1.浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316022；2.浙江海洋學院創(chuàng)新應用研究院，浙江舟山316022；3.浙江海洋學院海洋科學與技術學院，浙江舟山316022）

小黃魚內臟蛋白的提取及應用研究

吳凱強1，姜維2，郭健1，應知偉3，宋文東2，*

（1.浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316022；2.浙江海洋學院創(chuàng)新應用研究院，浙江舟山316022；3.浙江海洋學院海洋科學與技術學院，浙江舟山316022）

本文以小黃魚內臟為研究對象，從中分離提取出活性蛋白。通過對緩沖液pH，提取時間，醇液比3個單因素的考察，確定因素水平，并設計正交試驗，對工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝。試驗結果表明最佳提取工藝為：提取時間5h，緩沖液pH9，醇液比0.8∶1（體積比），在此工藝下所提取的蛋白液濃度為3.409mg/mL。最后，用所提取的活性蛋白進行初步應用性試驗，通過美拉德反應，制備食品添加劑，為小黃魚下腳料的應用提供了理論基礎。

小黃魚；廢棄內臟；活性蛋白

小黃魚[1-2]，拉丁名Pseudosciaena polyactis，又名小鮮、黃花魚、花色、黃鱗魚、小春色等，是輻鰭魚綱，鱸形目，石首魚科，黃魚屬。它是中國重要的經濟魚類，與大黃魚、帶魚并稱“中國三大海產”。小黃魚中蛋白質和營養(yǎng)元素含量豐富[3-4]。因此在日常生活中深受人們的喜愛，而在我國南方因大量生產小黃魚干制品而產生大量的魚類下腳料[5]，對其有效地利用成為企業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵[6-7]。

隨著我國水產品加工行業(yè)的發(fā)展，水產品廢棄物的利用越來越受到重視[8-9]。近年來，國內外眾多領域的研究者投入到對此類資源的開發(fā)和利用的研究中去，這其中包含了食品專業(yè)、醫(yī)藥專業(yè)、環(huán)境保護專業(yè)等[10-12]。

目前，雖然有研究者對小黃魚的生物習性及分布進行了研究[13-14]，但尚少有研究過小黃魚內臟中活性蛋白的基本生物學性質以及蛋白的結構性質和遺傳學性質等內容，故本文以小黃魚作為研究對象，用正丁醇優(yōu)化粗提了小黃魚內臟的活性蛋白并對其進行一定的應用型研究，從而解決小黃魚下腳料的閑置浪費問題，為開發(fā)一種天然的食品保鮮劑提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所需小黃魚：舟山臨城老碶菜場[魚身長度（14±5）cm，魚體重量（30±10）g]；堿性蛋白酶（生化試劑，酶活力>30 000U/g）、木瓜蛋白酶（生化試劑，酶活力>50 000U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清蛋白（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為國產分析純；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；PHB-4雷磁便攜式pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-1100分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；TM-767 II攪拌器、AR124CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；BCD-256KT海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；DGG-9030BD電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；CF16RN臺式微量高速離心機：Hitachi Koki Co.Ltd.（JAPAN）。

1.3 方法

1.3.1 主要工藝流程

原料→洗凈→勻漿→離心取上清液→正丁醇提取粗蛋白→硫酸銨分級沉淀→透析→粗蛋白定量→酶解→美拉德反應

1.3.2 勻漿液的制備

用剪刀解剖小黃魚，取內臟，用蒸餾水清洗后稱重。將魚內臟和一定pH值的磷酸鹽緩沖液，按質量體積比為1 g/3mL加入到高速勻漿機中勻漿；取出后4℃下靜置40min；冷凍離心取上清液，置于4℃冰箱內備用。

1.3.3 標準曲線的繪制

準確稱取牛血清白蛋白100mg，置于100mL的容量瓶中，用蒸餾水充分溶解，定容至刻度線，靜置，備用。得到濃度為1mg/mL的標準蛋白溶液。

取9支試管，用移液槍分別準確移取標準蛋白質溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，加水稀釋至10mL，渦流混勻，用紫外分光光度計在波長280 nm處測量吸光值。

1.3.4 單因素試驗的考察

取適量小黃魚內臟和pH分別為5、6、7、8、9的磷酸鹽緩沖液進行勻漿。取出后靜置40min；離心取上清液。分別量取各個pH值下所得的勻漿上清液20mL，分別加入正丁醇12、16、20、24、28mL，攪拌均勻后，在4℃下分別靜置2、3、4、5、6 h后，冷凍離心，收集上清液。

離心所得的上清液用飽和度為20%～50%的硫酸銨分級沉淀法，提取上清液中的活性蛋白后，透析脫鹽24 h，即得小黃魚活性蛋白提取液。采用紫外分光法在波長為280 nm處測量吸光值。

1.3.5 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選取緩沖液pH值為7、8、9，提取時間為3、4、5 h，醇液比為0.6∶1、0.8∶1、1∶1（體積比）。對緩沖液pH值、提取時間、醇液比3個因素進行考察，通過L9（34）正交表進行正交試驗，以粗提液中的蛋白質含量為考察標準，探討優(yōu)化小黃魚內臟活性蛋白的工藝條件，正交水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factor levels orthogonal experiment

1.3.6 一種新型的食品添加劑的粗制備

1.3.6.1 酶解原料的制備

制備最佳工藝條件下的活性蛋白液100mL，在50℃下，pH為7時加入0.5 g的木瓜蛋白酶和0.5 g的堿性蛋白酶反應5 h后，在90℃滅酶20min，冷卻后在8 000 r/min下離心20min，傾出酶解液，置于4℃冰箱內備用。

1.3.6.2 美拉德反應

準確稱取50mL的稀釋若干倍木糖母液和50mL的蛋白酶解液，充分攪拌后，用10%NaOH調節(jié)pH至8；將溶液倒入250mL的蒸餾燒瓶中，在100℃下分別蒸餾2 h；冷卻后，使用紫外分光光度計，在波長為490 nm處測量吸光值。美拉德反應的程度由反應后溶液的吸光度值作為依據，以未反應的溶液作為參比溶液，測量美拉德反應后溶液在波長490nm處的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定及繪制

牛血清蛋白標準曲線如圖1所示。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of Bovine serum albumin

根據圖1得到牛血清蛋白標準線性方程：y= 0.652 4x-0.005 4，相關系數R2=0.999 3。由標準曲線方程，可進行關于提取量的定量，計算公式如下：

式中：m表示提取量，mg；y表示透析液的蛋白濃度，mg/mL。

2.2 緩沖液的pH值對活性蛋白提取量的影響

不同緩沖液pH值對蛋白濃度的影響如圖2所示。

圖2 不同緩沖液pH值對蛋白濃度的影響Fig.2 The influence of different buffer pH value on the protein concentration

由圖2可知，當緩沖液pH在5～9之間逐漸增加時，活性蛋白提取液的濃度是呈先增后減的趨勢。當pH為8時，所測的提取液濃度是最高的。由此可見，緩沖液pH值的酸性太強，或堿性太高都會導致活性蛋白的失活，影響活性蛋白的提取量，因此當pH為8時，活性蛋白的提取量最高。

2.3 提取時間對活性蛋白提取量的影響

不同提取時間對蛋白濃度的影響如圖3所示。

由圖3可知，在提取時間為2 h～6 h時，隨著提取時間的逐漸增加，活性蛋白提取液的濃度先增后減。在4 h時，活性蛋白提取液的濃度是最高的。低于4 h，由于蛋白漿液中的活性蛋白沒有被充分提取出來，而導致提取液濃度過低。而高于4 h，由于提取時間過長，活性蛋白中存在的一些蛋白酶可能會分解蛋白質，而出現蛋白自溶的現象。另外，提取環(huán)境的不穩(wěn)定，也可能會導致在長時間下，一些活性蛋白的失活，而影響活性蛋白提取液的濃度。因此，當提取時間為4 h時，活性蛋白的提取量最高。

圖3 不同提取時間對蛋白濃度的影響Fig.3 The influence of different extraction time on the protein concentration

2.4 醇液比對活性蛋白提取量的影響

不同醇液比對蛋白濃度的影響如圖4所示。

圖4 不同醇液比對蛋白濃度的影響Fig.4 Different alcohol liquid ratio on the protein concentration

由圖4可知，在醇液比在0.6∶1～1.4∶1時，隨著醇液比的增加，活性蛋白提取液的濃度先增后減。在醇液比為0.8∶1（體積比）時，活性蛋白提取液的濃度達到最大。醇液比較少時，由于無法完全提取出蛋白漿液中的蛋白，會導致提取液的蛋白濃度過低。由于丙酮、正丁醇等此類的有機溶劑容易使蛋白質等生物大分子變性失活，所以整個試驗操作必須在低溫下進行。而過量的提取劑，就會導致蛋白漿液中有機溶劑分子過多，使部分蛋白質出現變性失活現象。因此，當醇液比為0.8∶1（體積比）時，活性蛋白的提取量最高。

2.5 正交試驗考查結果

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對美拉德反應條件進行優(yōu)化，結果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，對美拉德反應程度影響的主次關系為B>A>C，即提取時間>緩沖液pH>醇液比，根據正交試驗得到的最佳條件為A3B3C2，即pH為9，提取時間為5 h，醇液比為0.8∶1（體積比）。在此最佳反應條件下進行驗證試驗，得到蛋白濃度為3.409mg/mL，說明此時蛋白濃度最高。由表3可知，緩沖液的pH，醇液比對結果影響顯著。

表2 正交試驗結果Table2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table3 The analysis of variance

2.6 美拉德反應結果分析

根據木糖母液美拉德反應結果可知，平均的吸光值達到0.749，說明樣品中存在揮發(fā)性酯類成分，可進行進一步的分離提純去鑒別分析，為木糖母液以及小黃魚下腳料綜合應用去生成一種新型的食品添加劑提供了理論參考。

3 結論與討論

本次試驗設計了一種新的提取工藝，從小黃魚的內臟中提取出活性蛋白。這是目前在小黃魚研究方面還沒有出現過新方法。整個蛋白提取試驗雖然沒有采用色譜柱分離或凝膠過濾法等高新技術進行分離，但試驗內容合理嚴謹，多次單因素試驗和正交試驗，最終優(yōu)化了內臟活性蛋白的提取工藝，得到較高的提取量。

試驗結果表明，本試驗中設計的提取工藝，最佳工藝條件是提取時間為5 h，緩沖液pH為9，醇液比為0.8∶1（體積比），通過正交試驗驗證得出由此可以看出，此提取工藝穩(wěn)定，效果好，應用性強。另外，本論文中對所提取活性蛋白的應用，也進行了嘗試性試驗。通過美拉德反應，研究出了一種新型食品添加劑[15-17]。這也為進一步開發(fā)利用該資源提供了有益的參考和科學參考。

如今，隨著人口的增長，人們越來越依靠海洋資源。中國水產品的產量持續(xù)上升迎合了市場的需求，但這也帶來了大量水產廢棄物，如果能對這些水產廢棄物的開發(fā)利用進一步研究，會有更大的前景和市場潛力可以被開發(fā)出來。目前，有許多國家都正在致力于開發(fā)研究各種水產品廢棄物的利用，前景十分地被看好。

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Study on Purification of Protease from Pseudosciaena polyactis Offal and Its Application

WU Kai-qiang1，JIANG Wei2，GUO Jian1，YING Zhi-wei3，SONG Wen-dong2，*
（1.College of Food and Medical，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China；2.Innovative Application Research Institute，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China；3.College of Marine Science and Technology，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China）

The small yellow croaker visceral as the research object，designing the extraction process，separating and extracting the active protein from the small yellow croaker visceral.Determining the factor level through the investigation of three single factor，buffer pH，extraction time and alcohol liquid，to optimize the process and obtain the best extraction process by designing the orthogonal experimental L9（33）.The results showed that：5 h of extraction time，9 of buffer pH，0.8∶1（volume ratio）of alcohol liquid ratio made the best extraction，in this process the extracted an average of3.409 mg/mL.Finally，with the extraction of active protein applied experiments，through maillard reaction，the preparation of food additives，provides theoretical basis for the application of small yellow croaker scraps.

Pseudosciaena polyactis；fish offa；active protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.012

2015-12-31

舟山市科技計劃項目（2014C11009）；浙江海洋學院科研啟動項目（21025011013）

吳凱強（1991—），男（漢），在讀碩士，研究方向：海洋資源高值化利用研究。

*通信作者:宋文東（1960—），男，教授，博士，研究方向：海洋資源高值化利用研究