劉曉慶 李廣林 瞿 亮 王星麗 孫培龍 張安強(qiáng)*

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AB-8型大孔樹脂純化樺褐孔菌三萜的工藝研究

劉曉慶1李廣林1瞿 亮2王星麗2孫培龍1張安強(qiáng)1*

（1. 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)系，浙江杭州 310014；2. 杭州百山祖生物科技有限公司，浙江杭州310026）

為得到純度較高的樺褐孔菌三萜類物質(zhì)，采用大孔樹脂分離純化樺褐孔菌三萜粗提物，并研究其最佳工藝。先通過(guò)靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，確定AB-8型大孔樹脂對(duì)樺褐孔菌三萜具有最佳吸附效果，吸附量為18.81 mg/g，吸附率為89.02 %，解吸率達(dá)到82.51 %。再通過(guò)AB-8型大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)得到樺褐孔菌三萜最佳分離純化條件為上樣樣品濃度1.5 mg/mL，上樣體積1.5 BV，上樣流速1.5 mL/min，上樣pH為溶液本身pH值，洗脫液為95%乙醇、體積5 BV，在此條件下，樺褐孔菌三萜純度可達(dá)69.96%。

樺褐孔菌；大孔樹脂；三萜；分離純化

樺褐孔菌（）又名白樺茸，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，褐臥孔菌屬[1]，主要分布于中國(guó)黑龍江、吉林長(zhǎng)白山和日本北海道、俄羅斯北部及北歐等地[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌含有三萜類化合物、木質(zhì)素、黑色素、葉酸衍生物[3]及多糖[4]等活性物質(zhì)，其中，三萜類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗突變、抗炎等功能[5]，而目前研究多集中在樺褐孔菌的多糖上，對(duì)其三萜類物質(zhì)的研究則較少。

大孔吸附樹脂是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)、人工合成的有機(jī)高分子聚合物，因其特殊的理化性質(zhì)和吸附性能，已經(jīng)廣泛用于化學(xué)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6]。周桃英等利用AB-8型大孔樹脂分離純化了荷葉總黃酮[7]，孟憲軍等用大孔樹脂純化北五味子藤莖中的三萜類物質(zhì)[8]，錢竹等用大孔樹脂成功分離提取了發(fā)酵液中的靈芝三萜類物質(zhì)[9]。筆者在前人的研究基礎(chǔ)上，選用大孔吸附樹脂吸附法對(duì)樺褐孔菌三萜類化合物的吸附量、解吸率及影響因素進(jìn)行了研究，以期探索樺褐孔菌三萜類化合物分離純化的最佳工藝條件。

1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌子實(shí)體由杭州百山祖生物科技有限公司提供，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔡為明研究員鑒定。AB-8、D101型大孔吸附樹脂購(gòu)自上海摩速科學(xué)器材有限公司，白樺脂酸對(duì)照品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，高氯酸、次氯酸、香草醛、甲醇等其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器有AL-104電子天平（METTLER TOLEDO有限公司），F(xiàn)S-1200 型超聲波細(xì)胞破碎器（上海生析儀器公司），SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司），V-1800PC 型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器公司），高速冷凍離心機(jī)（日本日立儀器公司），ALPHA2-4LD真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）。

2 方 法

2.1 樺褐孔菌三萜類化合物的提取

樺褐孔菌子實(shí)體干燥粉粹后過(guò)40目篩，用60%的乙醇超聲輔助提取1 h，取出離心過(guò)濾、減壓濃縮，濃縮物冷凍干燥后得三萜粗提物。

2.2 大孔吸附樹脂的選擇

大孔吸附樹脂預(yù)處理：用95%乙醇密封浸泡樹脂，去除漂浮物，反復(fù)用乙醇浸泡直至浸泡液無(wú)白色渾濁，再用純凈水洗至無(wú)醇味。最后進(jìn)行酸堿處理：先用5%的HCl溶液浸泡3 h，接著用純凈水洗至中性，隨后再用5%的NaOH溶液浸泡3 h，用純凈水洗至中性，反復(fù)3次，完成預(yù)處理[8]。

大孔樹脂的篩選：采用靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后的AB-8和D101兩種大孔樹脂各5.00 g于具塞磨口三角瓶中，分別加入30 mL已測(cè)定質(zhì)量濃度的樺褐孔菌三萜樣品液，置于搖床中，在室溫下以100 r/min振蕩12 h，充分吸附后過(guò)濾，測(cè)定濾液中三萜的濃度[11]。按式（1）、式（2）計(jì)算兩種樹脂對(duì)三萜的吸附容量和吸附率。

將吸附飽和的樹脂放入具塞磨口三角瓶中，加入30 mL無(wú)水乙醇，置于搖床中，在室溫下以100 r/min轉(zhuǎn)速振蕩12 h進(jìn)行解吸，過(guò)濾，測(cè)定濾液中三萜的濃度[12]，按式（3）計(jì)算兩種樹脂對(duì)三萜的解吸率。

式中，為吸附容量，mg/g；0為初始三萜濃度，mg/mL；1為吸附濾液中三萜濃度，mg/mL；1為溶液體積，mL；為大孔吸附樹脂的質(zhì)量，g；1為吸附率，%。2為解吸率，%；2為洗脫濾液中三萜濃度，mg/mL；2為洗脫溶液體積，mL。

2.3 AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附-解吸

（1）AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附-解吸動(dòng)力學(xué)曲線。稱取AB-8大孔樹脂5 g置于具塞磨口三角瓶中，加入30 mL樺褐孔菌三萜溶液，置于搖床 中，在室溫下以100 r/min振蕩，每1 h定時(shí)取樣，測(cè)定吸光值并計(jì)算溶液中三萜的含量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。將已吸附飽和的樹脂放入具塞磨口三角瓶中，加無(wú)水乙醇30 mL，置于搖床中，在室溫下以100 r/min振蕩，每1 h取樣計(jì)算溶液中三萜的含量，繪制靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

（2）AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸的具體操作步驟：

（a）上樣濃度的選擇。配制濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的樺褐孔菌三萜粗提物溶液，上樣量0.75 BV（柱體積），上樣流速1.0 mL/min，收集流出液，測(cè)定其三萜濃度，確定最佳上樣濃度。

（b）上樣量的選擇。上樣濃度為1.5 mg/mL，上樣量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV，上樣流速1.0 mL/min，收集流出液，測(cè)定其三萜含量，確定最佳上樣量。

（c）上樣流速的選擇。上樣濃度為1.5 mg/mL，上樣量1.5 BV，選擇不同流速0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min進(jìn)行上樣，收集流出液，測(cè)定其三萜含量，確定最佳上樣流速。

（d）上樣pH值的選擇。用HCl溶液和NaOH溶液配成pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的三萜溶液，上樣濃度為1.5 mg/mL，上樣量1.5 BV，上樣流速1.5 mL/min，收集流出液，測(cè)定其三萜含量，確定最佳上樣pH值。

（e）洗脫液濃度的選擇。上樣濃度為1.5 mg/mL，上樣量1.5 BV，上樣流速1.5 mL/min，分別用不同乙醇含量（30%、40%、50%、60%、75%、95%）的溶液進(jìn)行洗脫，洗脫體積為10 BV，收集各組分的洗脫液，濃縮后測(cè)定其三萜含量。

表1 大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)性能參數(shù)及靜態(tài)吸附-解吸結(jié)果

（f）洗脫液用量的選擇。上樣濃度為1.5 mg/mL，上樣量1.5 BV，上樣流速1.5 mL/min，先用60%乙醇洗脫，最后用95%乙醇洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min，每10 mL收集一管，以吸光值為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

2.4 樺褐孔菌三萜類化合物純度的測(cè)定

（1）三萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參考蔡亞玲等的實(shí)驗(yàn)方法[10]，略有修改。稱取干燥至恒重的白樺脂酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇溶解，并在25 mL容量瓶中定容，得到200 μg/mL溶液標(biāo)準(zhǔn)液。量取0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，分別加入具塞試管中，水浴蒸干溶劑，向各管加入0.4 mL冰醋酸-香草醛溶液和1.5 mL高氯酸，70 ℃水浴15 min后，加入5 mL無(wú)水乙醇，充分振蕩后在554 nm處測(cè)OD值。以白樺脂酸的含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得回歸方程：=0.0054 4-0.0247 9，2=0.999 7。式中：為吸光值；為白樺脂酸含量，μg/mL。

（2）樺褐孔菌三萜類化合物的測(cè)定。對(duì)提取過(guò)程中和最優(yōu)條件下樺褐孔菌三萜類化合物的純度進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)三萜類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其純度。

3 結(jié)果與分析

3.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能比較與篩選

本研究選取AB-8型和D101型大孔吸附樹脂，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，篩選出最佳樹脂。結(jié)果表明：AB-8大孔樹脂的吸附率為89.02%，明顯高于D101大孔樹脂（表1）。樊君等報(bào)道大孔吸附樹脂的吸附作用主要是通過(guò)物理吸附來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其吸附量大小與樹脂的結(jié)構(gòu)性能及被吸附物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)有著重要的關(guān)系。樺褐孔菌三萜的極性與AB-8大孔樹脂極性比較相近，具有特異性吸附[13]。AB-8大孔樹脂平均孔徑較大，促進(jìn)了其對(duì)樺褐孔菌三萜類 物質(zhì)的吸收。D101大孔樹脂的解吸率為85.15%，雖略高于AB-8大孔樹脂的解析率82.51%，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程的工作效率，最終選取AB-8大孔樹脂純化樺褐孔菌三萜類化合物。

3.2 AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附-解吸動(dòng)力學(xué) 曲線

圖1表明，大孔樹脂在前2 h三萜的吸附速率較快，2 h后逐漸減緩，到4 h，吸附基本達(dá)到平衡?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)情況吸附時(shí)間可選擇4 h。

圖2表明，0～2 h內(nèi)，解吸液中的三萜類化合物濃度迅速升高，2 h后，升高緩慢且漸趨于穩(wěn)定。說(shuō)明此時(shí)樺褐孔菌三萜已達(dá)解吸平衡。在實(shí)際生產(chǎn)中，解吸時(shí)間可選擇2 h。

3.3 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸

（1）上樣濃度。理論上，上樣液濃度越高，質(zhì)量濃度差就較大，吸附率也應(yīng)越高。而實(shí)際上若上樣液濃度太高，黏度隨之增大，反會(huì)阻礙目標(biāo)物擴(kuò)散，導(dǎo)致吸收率降低[14]。當(dāng)流出液濃度為上樣液濃度的10%時(shí)便會(huì)出現(xiàn)泄漏。由圖3可知，在濃度為1.5 mg/mL時(shí)，流出液濃度為上樣液濃度的9.1%；而濃度為2.0 mg/mL時(shí)，流出液濃度為上樣液濃度的12.7%，超過(guò)10%?？梢?jiàn)選擇上樣濃度以1.5 mg/mL較為合適。

圖1 樺褐孔菌三萜靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 樺褐孔菌三萜靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

圖3 濃度對(duì)吸附量的影響

圖4 上樣量對(duì)吸附量的影響

（2）上樣量。從圖4可以看出，上樣量愈大，流出液中的三萜化合物含量也愈多。而實(shí)際上當(dāng)上樣量小于1.5 BV時(shí)，流出液中三萜濃度較小，此時(shí)AB-8大孔吸附樹脂吸附效果較好；而當(dāng)上樣液體積達(dá)到2 BV時(shí)，流出液中的三萜濃度為0.26 mg/mL，明顯超過(guò)了上樣液三萜濃度的10%。此后隨著上樣液體積的增加，三萜泄漏愈來(lái)愈多，表明上樣體積為1.5 BV時(shí)，大孔吸附樹脂已經(jīng)達(dá)到吸附平衡。可見(jiàn)選擇1.5倍柱體積為最佳上樣液體積。

（3）上樣流速。如圖5所示，隨著流速增加，吸附量減小，泄漏的三萜也隨之增加。原因是流速較大時(shí)阻礙了溶質(zhì)向大孔樹脂表面擴(kuò)散，不利于互相吸附，從而降低了吸附率；反之，流速越慢，總?cè)圃跇渲型Ａ舻臅r(shí)間越久，越利于兩者的相互吸附；但如果流速過(guò)小，則會(huì)使吸附過(guò)程周期過(guò)長(zhǎng)，降低生產(chǎn)效率[15]。因此，從要有較高的吸附率和縮短工作周期兩個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)，樺褐孔菌三萜溶液的最佳上樣流速應(yīng)為1.5 mL/min。

圖5 上樣流速對(duì)吸附量的影響

（4）上樣pH值的選擇。pH值對(duì)樹脂吸附效果的影響主要取決于被吸附物質(zhì)的酸堿性，酸性物質(zhì)在酸性溶劑中較易吸附，堿性物質(zhì)在堿性溶劑中較易吸附[16]。如圖6所示，大孔樹脂的吸附量在pH 8時(shí)為最大。不過(guò)不同pH環(huán)境，其吸附量相差不多，說(shuō)明溶液的pH值對(duì)AB-8型大孔吸附樹脂吸附樺褐孔菌三萜能力影響不大。為方便實(shí)際操作，可選擇溶液本身的pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖6 上樣pH值對(duì)吸附量的影響

（5）洗脫液濃度的選擇。洗脫液中三萜純度隨洗脫液乙醇濃度的增大而加大（表2）。在乙醇濃度小于60%時(shí)，洗脫液經(jīng)濃縮凍干后呈褐色，雜質(zhì)較多，而95%的乙醇洗脫液洗脫出來(lái)的三萜固形物為淡黃色，且三萜含量較高。因此可先用濃度為60%乙醇進(jìn)行洗脫，棄去非目標(biāo)部分，然后用95%乙醇進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)部分。

表2 洗脫液乙醇濃度對(duì)洗脫效果的影響

（6）洗脫液用量的選擇。由圖7可知，洗脫峰較窄且集中，并無(wú)拖尾現(xiàn)象，在前25管，洗脫液基本不含三萜，三萜物質(zhì)主要集中在25至40管。收集到40管時(shí)，所用的洗脫液為600 mL，約為5 BV。故確定其最佳洗脫液用量為5 BV。

圖7 大孔樹脂洗脫曲線

3.4 最優(yōu)條件下富集的三萜純度

在上樣濃度1.5 mg/mL，上樣體積1.5 BV，流速1.5 mL/min，上樣溶液pH為溶液本身pH值條件下上樣，然后先用60%乙醇洗脫去除雜質(zhì)，收集95%乙醇洗脫下的溶液，濃縮凍干后，測(cè)得三萜純度為69.96%。

4 結(jié) 論

AB-8大孔吸附樹脂更適合用于樺褐孔菌三萜的純化。確定AB-8大孔吸附樹脂純化樺褐孔 菌三萜的最優(yōu)條件：上樣樣品濃度1.5 mg/mL，上樣體積1.5 BV，上樣流速1.5 mL/min，上樣pH為溶液本身pH值，洗脫液為95%乙醇，體積5 BV。在此條件下，樺褐孔菌三萜純度可達(dá)到69.96%。采用大孔樹脂富集樺褐孔菌三萜不僅避免了使用有毒的有機(jī)溶劑，而且大孔吸附樹脂可再生，重復(fù)利用率高、經(jīng)濟(jì)、安全、簡(jiǎn)單，可在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模使用，具有良好的應(yīng)用前景。

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Study on the purification of triterpenes with AB-8 macroporous resin from the fruiting body of

Liu Xiaoqing1Li Guanglin1Qu Liang2Wang Xingli2Sun Peilong1Zhang Anqiang1*

（1. Department of Food Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2. Hangzhou Baishanzu Biological Technology Co., Ltd, Hangzhou, 310026, China）

In order to obtain triterpenes with high purity from, macroporous resins were used to purify triterpenes and confirm optimum process parameters. According to the static adsorption and desorption experiments, AB-8 macroporous resin was more suitable for enriching triterpenes from, it’s adsorption capacity, adsorption rate and desorption rate were 18.81 mg/g, 89.02% and 82.51%, respectively. Besides, through the dynamic adsorption and desorption experiments, the optimum process parameters as followed: the sample concentration 1.5 mg/mL, the volume of sample 1.5 BV, flow rate 1.5 mL/min, sample solution pH at natural pH level, elution solution was 95% ethanol and eluent volume 5 BV. Under this condition, the purity of triterpenes fromreached 69.96%.

; macroporous resin; triterpenes; isolation and purification

S646

B

2095-0934（2017）01-040-06

國(guó)家十二五科技支撐項(xiàng)目“食用菌深加工產(chǎn)品開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化”（2013BAD16B07）

劉曉慶（1992-），女，研究生

張安強(qiáng)，男，副教授，E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn