孫 科，陳 冉，陸世惠（1.右江民族醫(yī)學(xué)院生化教研室，廣西百色 533000；.右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西百色 533000）

雙波長(zhǎng)HPLC法同時(shí)測(cè)定兩面針?biāo)幉闹?種成分的含量Δ

孫 科1＊，陳 冉2，陸世惠3#（1.右江民族醫(yī)學(xué)院生化教研室，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西百色 533000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定兩面針?biāo)幉闹?種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為L(zhǎng)una C18，流動(dòng)相為乙腈-水（含0.2%磷酸、0.25%三乙胺）（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為273、284 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.8～200、0.2～50、0.44～110、0.208～52、0.944～236 μg/mL（r均為0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為101.47%～103.92%（RSD＝0.92%，n＝9）、102.52%～104.68%（RSD＝0.63%，n＝9）、97.55%～101.22%（RSD＝1.09%，n＝9）、103.35%～104.93%（RSD＝0.71%，n＝9）、99.31%～103.86%（RSD＝1.34%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于兩面針?biāo)幉闹?種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜法；兩面針；別隱品堿；鹽酸血根堿；氯化兩面針堿；白屈菜紅堿；芝麻素；含量

兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.，為蕓香科花椒屬植物，根部入藥，主要分布在我國(guó)南方等地[1]，主治風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、牙痛、毒蛇咬傷等癥。兩面針中富含多種抗腫瘤的活性成分，如別隱品堿、鹽酸血根堿[2]、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿[3]、芝麻素[4]等，上述成分還具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛活性[5-9]。目前關(guān)于兩面針中活性成分的測(cè)定局限于主要成分，如氯化兩面針堿、白屈菜紅堿[10-11]，目標(biāo)組分單一，不能全面反映兩面針?biāo)幉牡馁|(zhì)量。本試驗(yàn)旨在建立一種高效、快速的高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定兩面針中別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素多種組分的含量，為完善該藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括PDA二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Dionex公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；FA2004N型電子分析天平（上海民析精密科學(xué)儀器公司）；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器公司）。

1.2 試劑

別隱品堿對(duì)照品（北京盛世康譜化工技術(shù)研究院，批號(hào)：B-059-140727）、鹽酸血根堿對(duì)照品（批號(hào)：510001-201101）、氯化兩面針堿對(duì)照品（批號(hào)：110848-200603）、白屈菜紅堿對(duì)照品（批號(hào)：111718-201402）、芝麻素對(duì)照品（批號(hào)：110386-201005）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈為色譜純，乙醇、甲醇、磷酸、三乙胺為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

兩面針?biāo)幉模óa(chǎn)地：廣西）經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（含0.2%磷酸和0.25%三乙胺，B），梯度洗脫（0～6 min，25%A；6～25 min，25%→32%A；25～29 min，32%→60%A；29～42 min，60%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：273、284 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素質(zhì)量濃度分別為1.00、0.25、1.10、0.52、1.18 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別量取上述單一對(duì)照品貯備液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素質(zhì)量濃度分別為200、50、110、52、236 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（粒徑≤0.5 mm）適量，精密稱定20.0 g，加60%乙醇超聲提取20 min，重復(fù)提取3次（料液比均為1∶6），合并提取液，加乙醇定容至360 mL，微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，理論板數(shù)以別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素峰計(jì)分別為9 824、16 113、30 250、37 974、188 114；分離度均＞1.5，各成分基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.02、0.25、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素回歸方程分別為y＝0.191x—0.412（r＝0.999 9）、y＝1.697x—0.704（r＝0.999 9）、y＝1.860x—0.947（r＝0.999 9）、y＝1.629x+0.751（r＝0.999 9）、y＝0.498x—0.644（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.8～200、0.2～50、0.44～110、0.208～52、0.944～236 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素峰面積的RSD分別為0.45%、0.37%、0.25%、0.64%、0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、8、10、12、24、48、96 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素峰面積的RSD分別為0.41%、0.39%、0.28%、0.59%、0.67%（n＝8），表明供試品溶液在室溫放置96 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素平均含量分別為0.544、0.078、0.982、0.234、0.055 mg/g，RSD分別為0.91%、0.78%、0.90%、0.37%、1.06%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品適量，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取樣品適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用PAD二極管陣列檢測(cè)器對(duì)5種待測(cè)成分對(duì)照品進(jìn)行三維圖譜分析，結(jié)果顯示別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素的最大吸收波長(zhǎng)分別在284、273、273、268、284 nm處，其中，白屈菜紅堿在268和273 nm波長(zhǎng)處的吸收值相近、其余4種組分在284和273 nm波長(zhǎng)處的吸收值相差較大，為提高檢測(cè)靈敏度，采用雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定的模式進(jìn)行測(cè)定。選擇在284 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)別隱品堿、芝麻素，273 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.2 流動(dòng)相的選擇

色譜柱固定相硅膠表面的硅羥基（SiOH）pKa值為2～3，當(dāng)流動(dòng)相的pH＞3時(shí)，部分SiOH電離以SiO-形式存在，會(huì)與待分析的堿性生物堿發(fā)生很強(qiáng)的吸附作用，造成生物堿的色譜峰展寬、拖尾、保留時(shí)間漂移、分離效果不佳。改性劑三乙胺因與SiO-具有更強(qiáng)作用力，可以顯著降低待分析生物堿的吸附作用，且對(duì)色譜柱損傷小，因此是作為色譜峰拖尾抑制劑的較佳選擇[12]。本試驗(yàn)選擇在流動(dòng)相中加入一定量的三乙胺，通過(guò)加磷酸調(diào)節(jié)pH，結(jié)果各組分的保留時(shí)間隨pH的升高而增加，且峰展寬，峰型變差，因此選擇低pH的緩沖液，但C18難以承受pH＜2的酸度。綜合考慮，最終選擇以乙腈-0.2%磷酸-0.25%三乙胺（pH 2.5）為流動(dòng)相進(jìn)行分析測(cè)定，樣品中待測(cè)組分峰形好，且總體保留時(shí)間適中。

3.3 樣品處理方法的優(yōu)化

筆者考察了不同溶劑（40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醇-丙酮、丙酮、乙酸乙酯、乙酸乙酯-正丁醇、正丁醇）對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示，別隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿在60%和80%甲醇中提取率較高，這是由于這4種生物堿的極性較強(qiáng)，用強(qiáng)極性溶劑更易于提取，但有機(jī)溶劑含量太低，又不利于其溶解，因此用40%乙醇提取效果較差。最終采用60%乙醇作為提取溶劑。

本試驗(yàn)通過(guò)HPLC-PAD方法，首次完成兩面針?biāo)幉闹袆e隱品堿、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、芝麻素5種成分含量的同時(shí)測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可為兩面針?biāo)幉牡拈_(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

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Simultaneous Determination of 5 Components in Zanthoxylum nitidum by Dual-wavelength HPLC

SUN Ke1，CHEN Ran2，LU Shihui3（1.Dept.of Biochemistry，Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China；2.Science Experiment Center，Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China；3.School of Pharmacy，Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of 5 components in Zanthoxylum nitidum. METHODS：HPLC was performed on the column of Luna C18with mobile phase of acetonitrile-water（containing 0.2%phosphoric acid，0.25%triethylamine）（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 273，284 nm，column tem-perature was 30℃，and the injection volume was 20 μL.RESULTS：The linear range was 0.8-200 μg/mL for allocryptopine（r＝0.999 9），0.2-50 μg/mL for sargentine hydrochloride（r＝0.999 9），0.44-110 μg/mL for nitidine chloride（r＝0.999 9），0.208-52 μg/mL for toddaline（r＝0.999 9）and 0.944-236 μg/mL for sesamin（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 101.47%-103.92%（RSD＝0.92%，n＝9），102.52%-104.68%（RSD＝0.63%，n＝9），97.55%-101.22%（RSD＝1.09%，n＝9），103.35%-104.93%（RSD＝0.71%，n＝9），99.31%-103.86%（RSD＝1.34%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of 5 components in Z.nitidum.

HPLC；Zanthoxylum nitidum；Allocryptopine；Sargentine hydrochloride；Nitidine chloride；Toddaline；Sesamin；Content

R284.1；R917

A

1001-0408（2017）03-0393-04

2016-02-21

2016-05-09）

（編輯：張 靜）

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2014GXNSFBA118185）

＊助理實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生。研究方向：藥物分析。E-mail：1571474488@qq.com

#通信作者：高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士研究生。研究方向：天然產(chǎn)物的提取分離鑒定及其生物活性。E-mail：lushihui0818@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.30