趙 萍,王 森,歐水平,任 麗,王玉和#(.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴州遵義 563006;.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義 563003)
HPLC法同時(shí)測(cè)定虎杖膏中4種成分的含量Δ
趙 萍1*,王 森1,歐水平2,任 麗1,王玉和2#(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴州遵義 563006;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義 563003)
目的:建立同時(shí)測(cè)定虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Xtimate C18,流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果:虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為10~60 μg/mL(r=0.999 4)、2.5~15 μg/mL(r=0.999 7)、5~30 μg/mL(r=0.999 8)、2~12 μg/mL(r=0.999 6);定量限分別為0.87、0.44、0.45、0.15 μg/mL,檢測(cè)限分別為0.46、0.15、0.17、0.07 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%;加樣回收率分別為95.00%~102.00%(RSD=2.25%,n=9)、95.00%~103.00%(RSD=2.97%,n=9)、95.00%~99.56%(RSD=2.05%,n=9)、97.50%~102.50%(RSD=1.59%,n=9)。結(jié)論:該方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便,可用于虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的同時(shí)測(cè)定。
高效液相色譜法;虎杖膏;虎杖苷;白藜蘆醇;大黃素;大黃素甲醚;含量測(cè)定
虎杖膏是由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院協(xié)定處方,由虎杖粉、冰片等組成,具有清熱解毒、消腫定痛之功效,主要用于紅腫而未潰爛的瘡、癰、疔、癤及無(wú)名腫毒等癥的治療,療效明顯[1]?,F(xiàn)有虎杖膏的臨床研究較多[2],尚未有同時(shí)測(cè)定該制劑中多個(gè)成分的報(bào)道,鑒于此,本課題組采用高效液相色譜法(HPLC)[3]建立了同時(shí)測(cè)定虎杖膏中君藥虎杖的主要成分虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的含量,以期為虎杖膏的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。
1.1 儀器
1260型HPLC儀,包括1260型紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司);ME204E型電子分析天平(瑞士Mettl-er-Toledo公司);BT125D型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司);HH-S6型二列方孔水浴(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);Exceed-Cd-20型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(成都艾科水處理設(shè)備有限公司);TGL-16c型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。
1.2 藥品與試劑
虎杖膏(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自制,批號(hào):20151125、20151126、20151127,規(guī)格:25 g/盒);虎杖苷對(duì)照品(批號(hào):111575-200502)、大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756-201512)、白藜蘆醇對(duì)照品(批號(hào):111535-200502)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào):110758-201415)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度均>98%;乙腈為色譜純,磷酸、乙醇為分析純,水為超純水。
2.1 色譜條件
色譜柱:Xtimate C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(洗脫程序見表1);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):286 nm;柱溫:30℃,進(jìn)樣量:10 μL。
表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取虎杖苷對(duì)照品20.0 mg、白藜蘆醇對(duì)照品5.0 mg、大黃素對(duì)照品10.0 mg、大黃素甲醚對(duì)照品4.0 mg,分別置于不同的100 mL量瓶中,加乙醇溶解并定容,作為單一對(duì)照品貯備液。精密吸取上述各對(duì)照品貯備液各2.5 mL,置于同一10 mL量瓶中,加95%乙醇定容,制成每1 mL分別含虎杖苷50 μg、白藜蘆醇12.5 μg、大黃素25 μg、大黃素甲醚10 μg的混合對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液 取樣品約0.5 g,精密稱定,加95%乙醇30 mL,于50℃水浴加熱2 h,以半徑為5 cm、2 000 r/min離心10 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)慮液,即得。
2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝,取除虎杖外的其他輔料制備陰性對(duì)照品,再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜,詳見圖1。由圖1可知,理論板數(shù)以虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚計(jì)均≥3 000,分離度均>2;各成分基線分離良好,且陰性對(duì)照無(wú)干擾。
2.4 線性關(guān)系考察
分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL,分別置于10 mL量瓶中,加乙醇定容,制得系列線性溶液。取上述溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以待測(cè)成分質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的回歸方程分別為y=87.964x+ 146.03(r=0.999 4)、y=47.841x—6.273 3(r=0.999 7)、y=45.651x—2.36(r=0.999 8)、y=12.474x—0.12(r=0.999 6)。結(jié)果,虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為10~60、2.5~15、5~30、2~12 μg/mL。
圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms
2.5 定量限與檢測(cè)限考察
取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,等倍逐步稀釋,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí),得定量限(LOQ);當(dāng)信噪比為3∶1時(shí),得檢測(cè)限(LOD)。結(jié)果,虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的LOQ分別為0.87、0.44、0.45、0.15 μg/mL,LOD分別為0.46、0.15、0.17、0.07 μg/mL。
2.6 精密度試驗(yàn)
取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果,虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.35%、0.59%、0.39%、0.89%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào):20151125)適量,分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果,虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.59%、0.89%、0.94%、1.27%(n=8),表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.8 重復(fù)性試驗(yàn)
精密稱取同一批樣品(批號(hào):20151125)適量,共6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果,虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為2.098、0.445、1.402、0.155 mg/g,RSD分別為1.20%、0.96%、1.69%、1.54%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。
2.9 加樣回收率試驗(yàn)
取已知含量的樣品(批號(hào):20151125)適量,共6份,分別加入低、中、高質(zhì)量的虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品各適量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2。
表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 Results of recovery test(n=9)
2.10 樣品含量測(cè)定
取3批樣品各適量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的含量,結(jié)果見表3。
3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇
表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3,mg/g)Tab 3 Results of contents determination of samples(n=3,mg/g)
虎杖作為虎杖膏中的君藥,其主要化學(xué)成分為二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等,其中二苯乙烯類主要有白藜蘆醇和虎杖苷(白藜蘆醇苷)等化合物,蒽醌類主要有大黃素、大黃素甲醚、大黃素苷等化合物[4]。近年來(lái),有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)虎杖有確切的抗菌、抗病毒、抗炎作用,其抗菌、抗病毒、抗炎作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)可能與其所含二苯乙烯類以及蒽醌類成分有關(guān)[5]。因此,本試驗(yàn)選擇虎杖中二苯乙烯類(虎杖苷和白藜蘆醇)和蒽醌類(大黃素、大黃素甲醚)化學(xué)成分為測(cè)定指標(biāo)。
3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
本試驗(yàn)參考了相關(guān)文獻(xiàn)中對(duì)虎杖相關(guān)成分的測(cè)定波長(zhǎng)[6](230、280、285、290、303 nm),其中280、285、290 nm 3個(gè)波長(zhǎng)較接近,因此本課題組選取“2.2.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液在250~300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚在286 nm處均有較強(qiáng)的吸收,因此選擇230、286、303 nm進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果,在230 nm波長(zhǎng)處各成分基線不穩(wěn),在286、303 nm波長(zhǎng)處各成分基線穩(wěn)定,檢測(cè)限均能滿足含量測(cè)定要求,且各峰的峰形較好,理論板數(shù)較高,但大黃素甲醚在303 nm波長(zhǎng)處的紫外吸收較低,因此本試驗(yàn)選擇286 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
綜上所述,本方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便,可用于虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的同時(shí)測(cè)定。
[1] 易學(xué)東,楊建文,吳曾賢.虎杖膏微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011(3):250-251.
[2] 周矜宏,譚先群,代群燕,等.虎杖膏外敷用于Ⅰ期壓瘡的效果觀察[J].吉林醫(yī)學(xué),2012,33(28):6121-6122.
[3] 易學(xué)東,張倩茹,張小英.高效液相色譜法測(cè)定虎杖膏中大黃素的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2011,31(17):1483-1484.
[4] 劉莉,季金茍,唐南南,等.虎杖中大黃素的分離純化工藝研究[J].中成藥,2013,35(9):2034-2037.
[5] 賈玉梅,王君明,崔瑛.基于二苯乙烯類為主要活性成分的虎杖藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(9):263-269.
[6] 陳華國(guó),趙宏賓,趙超,等.虎杖提取物HPLC指紋圖譜歸屬分析及譜效關(guān)系初探[J].中國(guó)藥房,2010,21(19):1775-1776.
Simultaneous Determination of 4 Components in Reynoutria japonica Cream by HPLC
ZHAO Ping1,WANG Sen1,OU Shuiping2,REN Li1,WANG Yuhe2(1.College of Pharmacy,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563006,China;2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563003,China)
OBJECTIVE:To establish a method for the simultaneous determination of polydatin,resveratrol,emodin and physcion in Reynoutria japonica Cream.METHODS:HPLC was performed on the column of Xtimate C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%Phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL/min,the detection wavelength was 286 nm,column temperature was 30℃,and the injection volume was 10 μL.RESULTS:The linear range was 10-60 μg/mL for polydatin(r=0.999 4),2.5-15 μg/mL for resveratrol(r=0.999 7),5-30 μg/mL for emodin(r=0.999 8)and 2-12 μg/mL for physcion(r=0.999 6);limit of quantitation was 0.87,0.44,0.45,0.15 μg/mL,limit of detection was 0.46,0.15,0.17,0.07 μg/mL;RSDs of precision,stability and reproducibility tests were lower than 2.0%;recoveries were 95.00%-102.00%(RSD=2.25%,n=9),95.00%-103.00%(RSD=2.97%,n=9),95.00%-99.56%(RSD=2.05%,n=9)and 97.50%-102.50%(RSD=1.59%,n=9),respectively.CONCLUSIONS:The method is reliable,simple,and can be used for the simultaneous determination of polydatin,resveratrol,emodin and physcion in R.japonica Cream.
HPLC;Reynoutria japonica Cream;Polydatin;Resveratrol;Emodin;Physcion;Content determination
R917
A
1001-0408(2017)03-0405-03
2016-06-15
2016-11-11)
(編輯:劉 柳)
貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合字〔2015〕7481號(hào)、黔科合LH字〔2015〕7548號(hào));貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(No.QZYY-2015-077);貴州省藥劑學(xué)研究生卓越人才培養(yǎng)計(jì)劃(黔教研合ZYRC〔2014〕019);遵義市科技計(jì)劃課題(遵市科合社字〔2014〕96號(hào));遵義醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)招標(biāo)課題(遵醫(yī)院辦發(fā)〔2014〕10號(hào))
*碩士研究生。研究方向:醫(yī)院藥學(xué)、藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)。E-mail:865593634@qq.com
#通信作者:主任藥師,教授,碩士生導(dǎo)師。研究方向:醫(yī)院藥學(xué)。電話:0851-28609699。E-mail:1149076068@qq.com
DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.33