劉 棟,宋曉紅,湯長明,王麗軍,張建邦(解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室,鄭州 450042)
HPLC法同時測定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量
劉 棟*,宋曉紅,湯長明,王麗軍,張建邦(解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室,鄭州 450042)
目的:建立同時測定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Wondasil C18,流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測波長為230 nm(芍藥苷)、286 nm(丹酚酸B),柱溫為30℃,進樣量為10 μL。結(jié)果:芍藥苷和丹酚酸B檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79~195.80 μg/mL(r=0.999 9)、11.45~229.00 μg/mL(r=0.999 9);定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg,檢測限分別為0.005 4、0.004 3 μg;精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD<2.0%;加樣回收率分別為98.67%~102.22%(RSD=1.26%,n=9)、99.72%~103.28%(RSD=1.05%,n=9)。結(jié)論:該方法快速、靈敏、準確,可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時測定。
軟肝縮脾丸;芍藥苷;丹酚酸B;含量測定;高效液相色譜法
軟肝縮脾丸[批準文號:濟制字(2011)F12004]為解放軍第一五三中心醫(yī)院二十多年的臨床經(jīng)驗方,由赤芍、丹參、黃芪、紫河車、大黃、三七等中藥材組成,具有益氣活血破瘀、軟堅散結(jié)消痞之功效,適用于各種病因引起的慢性肝炎、肝硬化或無癥狀病毒攜帶者[1-4];該制劑臨床療效確切、口碑較好。但該制劑的質(zhì)量標準不夠全面,僅有鑒別檢查和丸劑的常規(guī)檢查,缺乏含量測定項目,不能全面控制該制劑的質(zhì)量。依據(jù)“中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高計劃”要求,同時為了進一步控制該制劑的質(zhì)量,本試驗采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量,以期為完善該制劑的質(zhì)量標準提供參考。
1.1 儀器
LC-10A型HPLC儀,包括SPD-10A型紫外檢測器、手動進樣器、LCsolutionLite型色譜工作站(日本Shimadzu公司);pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠);BT125D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司);AS3120A型超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器公司,功率:120 W,頻率:40 kHz)。
1.2 藥品與試劑
軟肝縮脾丸(解放軍第一五三中心醫(yī)院自制,批號:150316、150419、150420,規(guī)格:48 g/瓶);芍藥苷對照品(批號:110736-201136,純度:96.0%)、丹酚酸B對照品(批號:111562-201313,純度:97.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為重蒸水。
2.1 色譜條件
色譜柱:Wondasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(洗脫程序見表1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm(芍藥苷)、286 nm(丹酚酸B);柱溫:30℃;進樣量:10 μL。
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取待測成分對照品適量,置于同一10 mL量瓶中,加稀乙醇(量取乙醇529 mL,加水稀釋至1 000 mL,下同)溶解并定容,搖勻,即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.979、1.145 mg/mL的混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液1 mL,置于10 mL量瓶中,加稀乙醇定容,搖勻,即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為97.90、114.50μg/mL的混合對照品溶液。
表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program
2.2.2 供試品溶液 取樣品適量,除去包衣,研細,取約1 g,精密稱定,置于100 mL具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理1 h,放冷;再次稱定質(zhì)量,用稀乙醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例,分別制備缺赤芍和丹參的單一陰性樣品,再按“2.2.2”項下方法制備單一陰性對照溶液。
2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗
分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜,詳見圖1。由圖1可知,在該色譜條件下各成分均能達到基線分離(分離度>1.5);芍藥苷和丹酚酸B的保留時間分別在10.2 min和25.6 min左右;供試品溶液在混合對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處有相同的吸收峰,而陰性對照溶液則沒有相同的吸收峰。
圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms
2.4 線性關(guān)系考察
精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備液適量,用稀乙醇逐步稀釋制成芍藥苷質(zhì)量濃度分別為9.79、19.58、48.95、97.90、146.85、195.80 μg/mL,丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為11.45、22.90、57.25、114.50、171.75、229.00 μg/mL的系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸,得芍藥苷、丹酚酸B的回歸方程為分別y=14 927x—5 914.1(r=0.999 9)、y=14 616x—1 282.6(r=0.999 9)。結(jié)果表明,芍藥苷和丹酚酸B檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79~195.80、11.45~229.00 μg/mL。
2.5 定量限與檢測限考察
取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,倍比稀釋,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄峰面積。當信噪比為10∶1時,得芍藥苷和丹酚酸B的定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg;當信噪比為3∶1時,得芍藥苷和丹酚酸B的檢測限分別為0.005 4、0.004 3 μg。
2.6 精密度試驗
精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.26%、0.72%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗
取“2.2.2”項下供試品溶液(批號:150316)適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.85%、0.80%(n=6),表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.8 重復性試驗
取同一批樣品(批號:150420)適量,按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算芍藥苷和丹酚酸B的含量。結(jié)果,芍藥苷和丹酚酸B的平均含量分別為2.882、2.985 mg/g,RSD分別為1.17%、1.14%(n=6),表明本方法重復性良好。
2.9 加樣回收率試驗
取樣品(批號150420)適量,除去包衣,研細,精密稱取9份粉末,每份約0.5 g,分別加入一定質(zhì)量的芍藥苷和丹酚酸B對照品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結(jié)果見表2。
2.10 樣品含量測定
取3批樣品各適量,分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算芍藥苷和丹酚酸B的含量,結(jié)果見表3。
表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab 2 Results of recovery tests(n=9)
表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3,mg/g)Tab 3 Results of contents determination of samples(n=3,mg/g)
3.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)化
筆者在試驗過程中先后考察了提取溶劑、提取方式、提取時間、提取溶劑用量對樣品所測指標成分提取效果的影響。提取溶劑分別選取75%甲醇、75%乙醇、50%甲醇、稀乙醇進行對比試驗,結(jié)果稀乙醇的提取率優(yōu)于前三者。提取方式考察了超聲處理1 h、回流提取1 h和浸泡過夜(18 h),結(jié)果芍藥苷采用3種方式的芍藥苷提取率沒有明顯差異,但采用超聲處理和回流提取的丹酚酸B含量要明顯高于浸泡過夜(18 h)提取方式,考慮到超聲處理簡單、方便、安全,故采用超聲處理。筆者將超聲處理時間設(shè)置為0.5、1、1.5、2 h,結(jié)果芍藥苷和丹酚酸B的含量在超聲處理1、1.5、2 h時基本相同,并均明顯高于超聲處理0.5 h。筆者考察了稀乙醇用量(15、25、40、50 mL),發(fā)現(xiàn)提取溶劑用量為25、40、50 mL時,芍藥苷和丹酚酸B的提取量基本相同,并均高于提取溶劑用量為15 mL時的提取量。為了節(jié)約時間、節(jié)約試劑,因此本試驗最終確定制備供試品溶液的方式為25 mL稀乙醇,超聲處理1 h。
3.2 流動相的考察
筆者先后考察了不同比例的乙腈-磷酸二氫鉀溶液[5-6]、甲醇-磷酸溶液[7]、乙腈-甲醇-0.5%磷酸溶液[8-9]、乙腈-0.1%磷酸溶液[10-11]為流動相進行梯度洗脫。結(jié)果,有機相含有甲醇時丹酚酸B峰與相鄰峰分離度差,水相含有磷酸二氫鉀時芍藥苷峰形有拖尾現(xiàn)象;而以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時,芍藥苷和丹酚酸B峰與相鄰色譜峰分離度良好,且峰形對稱。因此,本試驗選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。
3.3 檢測波長的選擇
取待測成分對照品適量,分別用稀乙醇溶解并稀釋成每1 mL含藥藥苷和丹酚酸B各100μg的混合對照品溶液,在200~400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示,芍藥苷和丹酚酸B最大吸收波長分別為230、286 nm。為減少測定誤差,本試驗在230 nm波長下測定芍藥苷的含量,在286 nm波長下測定丹酚酸B的含量。
3.4 制劑制備及貯藏注意事項
試驗過程中筆者發(fā)現(xiàn),取生產(chǎn)日期較早(2年前的批次,已過期)的軟肝縮脾丸測定時,丹酚酸B含量下降明顯,且其色譜峰后出現(xiàn)一個半峰寬較大的未知峰,推測可能原因是丹酚酸B化學結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基和酯基,易發(fā)生氧化降解和水解。故軟肝縮脾丸制備過程中要嚴格控制水分含量,并包糖衣或薄膜衣,同時,建議其說明書的貯藏項下增加“密閉、防潮”字樣。
綜上所述,本方法快速、靈敏、準確,可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時測定。
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(編輯:劉 柳)
Simultaneous Determination of Paeoniflorin and SalvianolicAcid B in Ruangan Suopi Pill by HPLC
LIU Dong,SONG Xiaohong,TANG Changming,WANG Lijun,ZHANG Jianbang(Dept.of Preparation,No.153 Central Hospital of PLA,Zhengzhou 450042,China)
OBJECTIVE:To establish a method for simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.METHODS:HPLC was performed on the column of Wondasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL/min,the detection wavelength was 230 nm for paeoniflorin and 286 nm for salvianolic acid B,the column temperature was 30℃,and the injection volume was 10 μL.RESULTS:The linear range was 9.79-195.80 μg/mL(r=0.999 9)for paeoniflorin,11.45-229.00 μg/mL(r=0.999 9)for salvianolic acid B;the limits of quantification were 0.018 1,0.014 4 μg,limits of detection were 0.005 4,0.004 3 μg;RSDs of precision,stability and reproducibility tests were lower than 2.0%;the recoveries were 98.67%-102.22%(RSD=1.26%,n=9)and 99.72%-103.28%(RSD=1.05%,n=9). CONCLUSIONS:The method is rapid,sensitive and accurate,and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.
Ruangan suopi pill;Paeoniflorin;Salvianolic acid B;Content determination;HPLC
R917
A
1001-0408(2017)03-0416-03
2016-01-30
2016-07-16)
*主管藥師,碩士。研究方向:醫(yī)院制劑研發(fā)與質(zhì)量控制。E-mail:liudong13673546650@163.com
DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.36