劉 棟，宋曉紅，湯長明，王麗軍，張建邦（解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室，鄭州 450042）

HPLC法同時測定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量

劉 棟＊，宋曉紅，湯長明，王麗軍，張建邦（解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室，鄭州 450042）

目的：建立同時測定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Wondasil C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm（芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B），柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：芍藥苷和丹酚酸B檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79～195.80 μg/mL（r＝0.999 9）、11.45～229.00 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg，檢測限分別為0.005 4、0.004 3 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.67%～102.22%（RSD＝1.26%，n＝9）、99.72%～103.28%（RSD＝1.05%，n＝9）。結(jié)論：該方法快速、靈敏、準確，可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時測定。

軟肝縮脾丸；芍藥苷；丹酚酸B；含量測定；高效液相色譜法

軟肝縮脾丸[批準文號：濟制字（2011）F12004]為解放軍第一五三中心醫(yī)院二十多年的臨床經(jīng)驗方，由赤芍、丹參、黃芪、紫河車、大黃、三七等中藥材組成，具有益氣活血破瘀、軟堅散結(jié)消痞之功效，適用于各種病因引起的慢性肝炎、肝硬化或無癥狀病毒攜帶者[1-4]；該制劑臨床療效確切、口碑較好。但該制劑的質(zhì)量標準不夠全面，僅有鑒別檢查和丸劑的常規(guī)檢查，缺乏含量測定項目，不能全面控制該制劑的質(zhì)量。依據(jù)“中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高計劃”要求，同時為了進一步控制該制劑的質(zhì)量，本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量，以期為完善該制劑的質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型HPLC儀，包括SPD-10A型紫外檢測器、手動進樣器、LCsolutionLite型色譜工作站（日本Shimadzu公司）；pHS-3C型酸度計（上海雷磁儀器廠）；BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；AS3120A型超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器公司，功率：120 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

軟肝縮脾丸（解放軍第一五三中心醫(yī)院自制，批號：150316、150419、150420，規(guī)格：48 g/瓶）；芍藥苷對照品（批號：110736-201136，純度：96.0%）、丹酚酸B對照品（批號：111562-201313，純度：97.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm（芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取待測成分對照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加稀乙醇（量取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL，下同）溶解并定容，搖勻，即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.979、1.145 mg/mL的混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，搖勻，即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為97.90、114.50μg/mL的混合對照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，除去包衣，研細，取約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷；再次稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺赤芍和丹參的單一陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備單一陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下各成分均能達到基線分離（分離度＞1.5）；芍藥苷和丹酚酸B的保留時間分別在10.2 min和25.6 min左右；供試品溶液在混合對照品溶液色譜相應的保留時間處有相同的吸收峰，而陰性對照溶液則沒有相同的吸收峰。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備液適量，用稀乙醇逐步稀釋制成芍藥苷質(zhì)量濃度分別為9.79、19.58、48.95、97.90、146.85、195.80 μg/mL，丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為11.45、22.90、57.25、114.50、171.75、229.00 μg/mL的系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得芍藥苷、丹酚酸B的回歸方程為分別y＝14 927x—5 914.1（r＝0.999 9）、y＝14 616x—1 282.6（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，芍藥苷和丹酚酸B檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79～195.80、11.45～229.00 μg/mL。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得芍藥苷和丹酚酸B的定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg；當信噪比為3∶1時，得芍藥苷和丹酚酸B的檢測限分別為0.005 4、0.004 3 μg。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.26%、0.72%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：150316）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.85%、0.80%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品（批號：150420）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算芍藥苷和丹酚酸B的含量。結(jié)果，芍藥苷和丹酚酸B的平均含量分別為2.882、2.985 mg/g，RSD分別為1.17%、1.14%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號150420）適量，除去包衣，研細，精密稱取9份粉末，每份約0.5 g，分別加入一定質(zhì)量的芍藥苷和丹酚酸B對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算芍藥苷和丹酚酸B的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

筆者在試驗過程中先后考察了提取溶劑、提取方式、提取時間、提取溶劑用量對樣品所測指標成分提取效果的影響。提取溶劑分別選取75%甲醇、75%乙醇、50%甲醇、稀乙醇進行對比試驗，結(jié)果稀乙醇的提取率優(yōu)于前三者。提取方式考察了超聲處理1 h、回流提取1 h和浸泡過夜（18 h），結(jié)果芍藥苷采用3種方式的芍藥苷提取率沒有明顯差異，但采用超聲處理和回流提取的丹酚酸B含量要明顯高于浸泡過夜（18 h）提取方式，考慮到超聲處理簡單、方便、安全，故采用超聲處理。筆者將超聲處理時間設置為0.5、1、1.5、2 h，結(jié)果芍藥苷和丹酚酸B的含量在超聲處理1、1.5、2 h時基本相同，并均明顯高于超聲處理0.5 h。筆者考察了稀乙醇用量（15、25、40、50 mL），發(fā)現(xiàn)提取溶劑用量為25、40、50 mL時，芍藥苷和丹酚酸B的提取量基本相同，并均高于提取溶劑用量為15 mL時的提取量。為了節(jié)約時間、節(jié)約試劑，因此本試驗最終確定制備供試品溶液的方式為25 mL稀乙醇，超聲處理1 h。

3.2 流動相的考察

筆者先后考察了不同比例的乙腈-磷酸二氫鉀溶液[5-6]、甲醇-磷酸溶液[7]、乙腈-甲醇-0.5%磷酸溶液[8-9]、乙腈-0.1%磷酸溶液[10-11]為流動相進行梯度洗脫。結(jié)果，有機相含有甲醇時丹酚酸B峰與相鄰峰分離度差，水相含有磷酸二氫鉀時芍藥苷峰形有拖尾現(xiàn)象；而以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，芍藥苷和丹酚酸B峰與相鄰色譜峰分離度良好，且峰形對稱。因此，本試驗選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。

3.3 檢測波長的選擇

取待測成分對照品適量，分別用稀乙醇溶解并稀釋成每1 mL含藥藥苷和丹酚酸B各100μg的混合對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，芍藥苷和丹酚酸B最大吸收波長分別為230、286 nm。為減少測定誤差，本試驗在230 nm波長下測定芍藥苷的含量，在286 nm波長下測定丹酚酸B的含量。

3.4 制劑制備及貯藏注意事項

試驗過程中筆者發(fā)現(xiàn)，取生產(chǎn)日期較早（2年前的批次，已過期）的軟肝縮脾丸測定時，丹酚酸B含量下降明顯，且其色譜峰后出現(xiàn)一個半峰寬較大的未知峰，推測可能原因是丹酚酸B化學結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基和酯基，易發(fā)生氧化降解和水解。故軟肝縮脾丸制備過程中要嚴格控制水分含量，并包糖衣或薄膜衣，同時，建議其說明書的貯藏項下增加“密閉、防潮”字樣。

綜上所述，本方法快速、靈敏、準確，可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時測定。

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[3] 杜慧芳，王全楚.軟肝縮脾丸治療慢性肝病120例[J].河南中醫(yī)，2008，28（7）：53-54.

[4] 王全楚，申德林，張燕，等.重型肝炎恢復期干擾素聯(lián)合軟肝縮脾丸抗肝纖維化的研究[J].胃腸病學和肝病學雜志，2008，17（9）：741-742.

[5] 田潤.HPLC法同時測定婦炎康片中丹酚酸B、隱丹參酮和芍藥苷[J].中成藥，2013，35（1）：93-96.

[6] 黃鳴清，謝友良，王德杭，等.HPLC同時測定婦炎康片中芍藥苷、丹酚酸B、小檗堿[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（22）：68-71.

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[11] 劉靜，談瑄忠，陸兔林，等.HPLC法同時測定烏杞明目口服液中6種成分[J].中成藥，2014，36（8）：1652-1656.

（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of Paeoniflorin and SalvianolicAcid B in Ruangan Suopi Pill by HPLC

LIU Dong，SONG Xiaohong，TANG Changming，WANG Lijun，ZHANG Jianbang（Dept.of Preparation，No.153 Central Hospital of PLA，Zhengzhou 450042，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.METHODS：HPLC was performed on the column of Wondasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 230 nm for paeoniflorin and 286 nm for salvianolic acid B，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 9.79-195.80 μg/mL（r＝0.999 9）for paeoniflorin，11.45-229.00 μg/mL（r＝0.999 9）for salvianolic acid B；the limits of quantification were 0.018 1，0.014 4 μg，limits of detection were 0.005 4，0.004 3 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the recoveries were 98.67%-102.22%（RSD＝1.26%，n＝9）and 99.72%-103.28%（RSD＝1.05%，n＝9）. CONCLUSIONS：The method is rapid，sensitive and accurate，and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.

Ruangan suopi pill；Paeoniflorin；Salvianolic acid B；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）03-0416-03

2016-01-30

2016-07-16）

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院制劑研發(fā)與質(zhì)量控制。E-mail：liudong13673546650@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.36