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        HPLC法同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量

        2017-03-03 06:45:21宋曉紅湯長(zhǎng)明王麗軍張建邦解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室鄭州450042
        中國(guó)藥房 2017年3期
        關(guān)鍵詞:酚酸芍藥乙腈

        劉 棟,宋曉紅,湯長(zhǎng)明,王麗軍,張建邦(解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室,鄭州 450042)

        HPLC法同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量

        劉 棟*,宋曉紅,湯長(zhǎng)明,王麗軍,張建邦(解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室,鄭州 450042)

        目的:建立同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Wondasil C18,流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm(芍藥苷)、286 nm(丹酚酸B),柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果:芍藥苷和丹酚酸B檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79~195.80 μg/mL(r=0.999 9)、11.45~229.00 μg/mL(r=0.999 9);定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg,檢測(cè)限分別為0.005 4、0.004 3 μg;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2.0%;加樣回收率分別為98.67%~102.22%(RSD=1.26%,n=9)、99.72%~103.28%(RSD=1.05%,n=9)。結(jié)論:該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確,可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時(shí)測(cè)定。

        軟肝縮脾丸;芍藥苷;丹酚酸B;含量測(cè)定;高效液相色譜法

        軟肝縮脾丸[批準(zhǔn)文號(hào):濟(jì)制字(2011)F12004]為解放軍第一五三中心醫(yī)院二十多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方,由赤芍、丹參、黃芪、紫河車、大黃、三七等中藥材組成,具有益氣活血破瘀、軟堅(jiān)散結(jié)消痞之功效,適用于各種病因引起的慢性肝炎、肝硬化或無癥狀病毒攜帶者[1-4];該制劑臨床療效確切、口碑較好。但該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠全面,僅有鑒別檢查和丸劑的常規(guī)檢查,缺乏含量測(cè)定項(xiàng)目,不能全面控制該制劑的質(zhì)量。依據(jù)“中國(guó)人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃”要求,同時(shí)為了進(jìn)一步控制該制劑的質(zhì)量,本試驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量,以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        LC-10A型HPLC儀,包括SPD-10A型紫外檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、LCsolutionLite型色譜工作站(日本Shimadzu公司);pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);BT125D型十萬分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司);AS3120A型超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器公司,功率:120 W,頻率:40 kHz)。

        1.2 藥品與試劑

        軟肝縮脾丸(解放軍第一五三中心醫(yī)院自制,批號(hào):150316、150419、150420,規(guī)格:48 g/瓶);芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-201136,純度:96.0%)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào):111562-201313,純度:97.0%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為重蒸水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Wondasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(洗脫程序見表1);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm(芍藥苷)、286 nm(丹酚酸B);柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品適量,置于同一10 mL量瓶中,加稀乙醇(量取乙醇529 mL,加水稀釋至1 000 mL,下同)溶解并定容,搖勻,即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.979、1.145 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液1 mL,置于10 mL量瓶中,加稀乙醇定容,搖勻,即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為97.90、114.50μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

        表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

        2.2.2 供試品溶液 取樣品適量,除去包衣,研細(xì),取約1 g,精密稱定,置于100 mL具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理1 h,放冷;再次稱定質(zhì)量,用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例,分別制備缺赤芍和丹參的單一陰性樣品,再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備單一陰性對(duì)照溶液。

        2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)

        分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜,詳見圖1。由圖1可知,在該色譜條件下各成分均能達(dá)到基線分離(分離度>1.5);芍藥苷和丹酚酸B的保留時(shí)間分別在10.2 min和25.6 min左右;供試品溶液在混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的吸收峰,而陰性對(duì)照溶液則沒有相同的吸收峰。

        圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

        2.4 線性關(guān)系考察

        精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液適量,用稀乙醇逐步稀釋制成芍藥苷質(zhì)量濃度分別為9.79、19.58、48.95、97.90、146.85、195.80 μg/mL,丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為11.45、22.90、57.25、114.50、171.75、229.00 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得芍藥苷、丹酚酸B的回歸方程為分別y=14 927x—5 914.1(r=0.999 9)、y=14 616x—1 282.6(r=0.999 9)。結(jié)果表明,芍藥苷和丹酚酸B檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79~195.80、11.45~229.00 μg/mL。

        2.5 定量限與檢測(cè)限考察

        取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,倍比稀釋,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí),得芍藥苷和丹酚酸B的定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg;當(dāng)信噪比為3∶1時(shí),得芍藥苷和丹酚酸B的檢測(cè)限分別為0.005 4、0.004 3 μg。

        2.6 精密度試驗(yàn)

        精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.26%、0.72%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào):150316)適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.85%、0.80%(n=6),表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

        取同一批樣品(批號(hào):150420)適量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算芍藥苷和丹酚酸B的含量。結(jié)果,芍藥苷和丹酚酸B的平均含量分別為2.882、2.985 mg/g,RSD分別為1.17%、1.14%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。

        2.9 加樣回收率試驗(yàn)

        取樣品(批號(hào)150420)適量,除去包衣,研細(xì),精密稱取9份粉末,每份約0.5 g,分別加入一定質(zhì)量的芍藥苷和丹酚酸B對(duì)照品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2。

        2.10 樣品含量測(cè)定

        取3批樣品各適量,分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算芍藥苷和丹酚酸B的含量,結(jié)果見表3。

        3 討論

        表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 Results of recovery tests(n=9)

        表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3,mg/g)Tab 3 Results of contents determination of samples(n=3,mg/g)

        3.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

        筆者在試驗(yàn)過程中先后考察了提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間、提取溶劑用量對(duì)樣品所測(cè)指標(biāo)成分提取效果的影響。提取溶劑分別選取75%甲醇、75%乙醇、50%甲醇、稀乙醇進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),結(jié)果稀乙醇的提取率優(yōu)于前三者。提取方式考察了超聲處理1 h、回流提取1 h和浸泡過夜(18 h),結(jié)果芍藥苷采用3種方式的芍藥苷提取率沒有明顯差異,但采用超聲處理和回流提取的丹酚酸B含量要明顯高于浸泡過夜(18 h)提取方式,考慮到超聲處理簡(jiǎn)單、方便、安全,故采用超聲處理。筆者將超聲處理時(shí)間設(shè)置為0.5、1、1.5、2 h,結(jié)果芍藥苷和丹酚酸B的含量在超聲處理1、1.5、2 h時(shí)基本相同,并均明顯高于超聲處理0.5 h。筆者考察了稀乙醇用量(15、25、40、50 mL),發(fā)現(xiàn)提取溶劑用量為25、40、50 mL時(shí),芍藥苷和丹酚酸B的提取量基本相同,并均高于提取溶劑用量為15 mL時(shí)的提取量。為了節(jié)約時(shí)間、節(jié)約試劑,因此本試驗(yàn)最終確定制備供試品溶液的方式為25 mL稀乙醇,超聲處理1 h。

        3.2 流動(dòng)相的考察

        筆者先后考察了不同比例的乙腈-磷酸二氫鉀溶液[5-6]、甲醇-磷酸溶液[7]、乙腈-甲醇-0.5%磷酸溶液[8-9]、乙腈-0.1%磷酸溶液[10-11]為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果,有機(jī)相含有甲醇時(shí)丹酚酸B峰與相鄰峰分離度差,水相含有磷酸二氫鉀時(shí)芍藥苷峰形有拖尾現(xiàn)象;而以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),芍藥苷和丹酚酸B峰與相鄰色譜峰分離度良好,且峰形對(duì)稱。因此,本試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

        3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

        取待測(cè)成分對(duì)照品適量,分別用稀乙醇溶解并稀釋成每1 mL含藥藥苷和丹酚酸B各100μg的混合對(duì)照品溶液,在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示,芍藥苷和丹酚酸B最大吸收波長(zhǎng)分別為230、286 nm。為減少測(cè)定誤差,本試驗(yàn)在230 nm波長(zhǎng)下測(cè)定芍藥苷的含量,在286 nm波長(zhǎng)下測(cè)定丹酚酸B的含量。

        3.4 制劑制備及貯藏注意事項(xiàng)

        試驗(yàn)過程中筆者發(fā)現(xiàn),取生產(chǎn)日期較早(2年前的批次,已過期)的軟肝縮脾丸測(cè)定時(shí),丹酚酸B含量下降明顯,且其色譜峰后出現(xiàn)一個(gè)半峰寬較大的未知峰,推測(cè)可能原因是丹酚酸B化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基和酯基,易發(fā)生氧化降解和水解。故軟肝縮脾丸制備過程中要嚴(yán)格控制水分含量,并包糖衣或薄膜衣,同時(shí),建議其說明書的貯藏項(xiàng)下增加“密閉、防潮”字樣。

        綜上所述,本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確,可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時(shí)測(cè)定。

        [1] 申德林,張成道,王全楚,等.軟肝縮脾丸治療慢性肝纖維化的臨床與實(shí)驗(yàn)研究[J].世界華人消化雜志,2000,8(10):1199-1200.

        [2] 張成道,王全楚,申德林,等.拉米夫啶聯(lián)合軟肝縮脾丸對(duì)肝炎患者肝纖維化及肝細(xì)胞損傷的作用[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2005,22(11):973-974.

        [3] 杜慧芳,王全楚.軟肝縮脾丸治療慢性肝病120例[J].河南中醫(yī),2008,28(7):53-54.

        [4] 王全楚,申德林,張燕,等.重型肝炎恢復(fù)期干擾素聯(lián)合軟肝縮脾丸抗肝纖維化的研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2008,17(9):741-742.

        [5] 田潤(rùn).HPLC法同時(shí)測(cè)定婦炎康片中丹酚酸B、隱丹參酮和芍藥苷[J].中成藥,2013,35(1):93-96.

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        [8] 姜暉,王紹志,張熙潔,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定利腦心膠囊中6種成分的含量[J].中國(guó)藥房,2015,26(3):374-376.

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        (編輯:劉 柳)

        Simultaneous Determination of Paeoniflorin and SalvianolicAcid B in Ruangan Suopi Pill by HPLC

        LIU Dong,SONG Xiaohong,TANG Changming,WANG Lijun,ZHANG Jianbang(Dept.of Preparation,No.153 Central Hospital of PLA,Zhengzhou 450042,China)

        OBJECTIVE:To establish a method for simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.METHODS:HPLC was performed on the column of Wondasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL/min,the detection wavelength was 230 nm for paeoniflorin and 286 nm for salvianolic acid B,the column temperature was 30℃,and the injection volume was 10 μL.RESULTS:The linear range was 9.79-195.80 μg/mL(r=0.999 9)for paeoniflorin,11.45-229.00 μg/mL(r=0.999 9)for salvianolic acid B;the limits of quantification were 0.018 1,0.014 4 μg,limits of detection were 0.005 4,0.004 3 μg;RSDs of precision,stability and reproducibility tests were lower than 2.0%;the recoveries were 98.67%-102.22%(RSD=1.26%,n=9)and 99.72%-103.28%(RSD=1.05%,n=9). CONCLUSIONS:The method is rapid,sensitive and accurate,and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.

        Ruangan suopi pill;Paeoniflorin;Salvianolic acid B;Content determination;HPLC

        R917

        A

        1001-0408(2017)03-0416-03

        2016-01-30

        2016-07-16)

        *主管藥師,碩士。研究方向:醫(yī)院制劑研發(fā)與質(zhì)量控制。E-mail:liudong13673546650@163.com

        DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.36

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