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        虎杖苷抑制高糖引起新生鼠心肌細(xì)胞鈣漏流的作用及其機(jī)制研究

        2017-03-02 19:07:21陳澤龍余懷新陳淑娟劉君英劉文娟
        中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年30期

        陳澤龍 余懷新 陳淑娟 劉君英 劉文娟 鄧建新 閻德文

        [摘要] 目的 研究虎杖苷(polydatin,PD)抑制高糖引起心肌細(xì)胞局部鈣信號紊亂的機(jī)制,探討其對糖尿病心肌病的保護(hù)作用。 方法 分離1~3 d SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,隨機(jī)分為四組:對照組、高糖組、虎杖苷組和高糖+虎杖苷組。培養(yǎng)48 h后采用激光共聚焦顯微成像技術(shù)檢測局部鈣釋放單位鈣火花發(fā)放頻率及其形態(tài);利用Western blot方法檢測受磷蛋白PLB和肌漿網(wǎng)SERCA 2a蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 高糖組心肌細(xì)胞鈣自發(fā)鈣火花發(fā)放水平顯著增加(P<0.01),且略微增加鈣火花時程。在虎杖苷組中,高糖引起的高頻鈣火花發(fā)放顯著抑制(P<0.01)。與對照組相比,高糖增加心肌細(xì)胞內(nèi)靜息期細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,給予PD治療則抑制高糖引起鈣超載。PD抑制高糖引起的心肌細(xì)胞ROS水平增加。高糖下調(diào)PLB和SERCA 2a蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 PD通過降低細(xì)胞自發(fā)鈣火花的頻率,抑制肌漿網(wǎng)鈣漏流、增加鈣穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)PLB/SERCA 2a蛋白比例,從而有效糾正高糖所致心肌細(xì)胞局部鈣調(diào)控紊亂。因此,PD可能在糖尿病心肌病患者中發(fā)揮著重要的心肌保護(hù)作用。

        [關(guān)鍵詞] 虎杖苷;高糖;心肌細(xì)胞;鈣漏流;鈣火花

        [中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2016)30-0020-04

        虎杖苷是從傳統(tǒng)中藥虎杖(Polygonum Cuspidatun Sieb.et Zucc)中提取的單體,因其化學(xué)結(jié)構(gòu)為白黎蘆醇與葡萄糖的結(jié)合產(chǎn)物,故又稱白黎蘆醇苷(piceid),屬羥基二苯乙烯類化合物。研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷具有多種生物活性,尤其對心腦血管系統(tǒng)具有獨(dú)特的改善效果。

        隨著糖尿病發(fā)病的日益流行,獨(dú)立于冠狀動脈粥樣硬化之外的糖尿病心肌病,其發(fā)病比例顯著增高。其中無癥狀性左室舒張功能不全是2型糖尿病心肌病的早期病變,隨著疾病進(jìn)展,左室收縮期功能受損,最終導(dǎo)致心衰發(fā)生。研究表明糖尿病患者70%以上死于心血管疾病,是非糖尿病人群心血管系統(tǒng)疾病病死率2~3倍。故深入研究糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制,為早期保護(hù)心臟功能,提高糖尿病患者生活質(zhì)量,尤為重要[1,2]。糖尿病患者多伴隨有高血糖,長期的高血糖帶來的危害是持續(xù)、多面性的。然而高血糖對心肌細(xì)胞局部鈣信號的調(diào)控仍不清楚。因此,本研究探明高糖對心肌細(xì)胞的局部鈣信號的調(diào)控,并探討虎杖苷糾正高糖引起心肌細(xì)胞鈣紊亂的作用及其機(jī)制。

        1 資料與方法

        1.1 材料與試劑

        1~3 d SD大鼠乳鼠20只,從廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心購買,動物許可證號:SCXK(粵)2013-0002?;⒄溶沼缮钲诤M跎镉邢薰咎峁豢筍ERCA蛋白抗體(Ab1)、PLB抗體購于美國Alomone公司;蛋白質(zhì)測定試劑盒購于Bio-Rad公司;ECL檢測試劑盒購于Invitrogen公司;膠原酶Ⅱ購于Worthington公司;5-溴脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶(Sigma,美國);DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國);新生牛血清(NBCS)為Gibco;Fluo-4 AM和H2DCFDA購于Invitrogen公司,其余無特別說明為國產(chǎn)分析純。主要的實(shí)驗(yàn)儀器為:Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡(Zeiss,德國)。

        1.2 方法

        1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 采用胰蛋白酶消化的方法分離乳鼠心肌細(xì)胞[3]。取 1~3 d 齡SD大鼠,在無菌條件下開胸,采用眼科鑷快速取下心臟并置于冰冷的PBS緩沖液中清洗3次。取心尖部組織剪為1 mm3碎塊,再用PBS液清洗,以清除血細(xì)胞。加入0.08%濃度胰蛋白酶37℃水浴消化10 min,棄上清,剩余組織塊中加入混合消化酶(0.08%胰蛋白酶加 0.04%~0.06%Ⅱ型膠原酶等量加入的混合液)置37℃水浴消化5~10 min多次,將各次消化制成的細(xì)胞懸液合并后,通過150目孔徑的不銹鋼網(wǎng)濾過。將細(xì)胞懸液接種于60 mm培養(yǎng)板中,采取差速法貼壁心肌細(xì)胞:37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h,分離純化心肌細(xì)胞。將純化的細(xì)胞按0.8×105/m2~1.0×105/m2的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中。

        1.2.2 分組 細(xì)胞被隨機(jī)分成四組:對照組(Control)、高糖組(High glucose,HG)、虎杖苷組(polydatin,PD)和高糖+虎杖苷組(HG+PD)。對照組給予甘露醇25 mM,高糖組給予25 mM葡萄糖,虎杖苷組給予30 μM PD +25 mM甘露醇,高糖+虎杖苷組給予30 μMPD+25 mM D-Glu,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行鈣信號檢測和Western blot檢測。

        1.2.3 熒光染料的加載 在室溫下避光下把鈣熒光指示劑Fluo-4 AM(5 μmol/L)與細(xì)胞共同孵育8 min。染色后將細(xì)胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺上,并灌以臺氏液。

        1.2.4 鈣火花的采集 采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡線掃描方式,在400倍鏡下,選取合適的細(xì)胞、保持相同采樣速率為3.84 ms/線,連續(xù)采集1000條線。在采集過程中放大倍數(shù)和采樣速度應(yīng)盡量保持一致,以方便后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。激發(fā)光波長為488 nm,收集波長為505 nm以上的發(fā)射光。

        1.2.5 ROS的檢測 細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用2,7-dichlorodihydro fluorescein diacetate(H2DCFDA)熒光探針進(jìn)行檢測。在室溫下將細(xì)胞和熒光探針(10 μM)共同孵育10 min。采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡面掃描的方式,激發(fā)光波長為488 nm,收集波長為505 nm以上的發(fā)射光。為了保持結(jié)果的可比性,熒光探針的加載條件和熒光的采集條件需要完全一致。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        鈣火花圖像和ROS信號的處理及分析采用IDL 6.3(Research Systems,Inc.,Boulder,CO)軟件進(jìn)行分析[4]。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,統(tǒng)計(jì)方法為單向方差分析,方差齊時采用LSD法,方差不齊時組間比較采用Welch檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 虎杖苷抑制高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞鈣漏流

        結(jié)果顯示(圖1B),高糖引起的心肌細(xì)胞自發(fā)鈣火花發(fā)放頻率顯著增加,由對照組的(1.69±0.07)增加到高糖組的(4.26±0.27),(t=-1.309,P<0.01);PD組稍微增加鈣火花的發(fā)放頻率(1.89±0.08),(vs 對照組:P<0.05);通過給予PD治療后可以抑制由高糖引起的鈣火花發(fā)放頻率,由HG組的(4.26±0.27)降為(2.48±0.15),(P<0.01)。對鈣火花的形態(tài)特性進(jìn)一步分析見圖1C~F,高糖組鈣火花的幅度(F/F0)減小(vs 對照組:2.19±0.03 vs 2.32±0.05,P<0.05),持續(xù)時程(full-duration of half maximum,F(xiàn)DHM)延長(vs 對照組:40.06±0.94 vs 32.41±1.57,t=2.152,P<0.05),而不改變鈣火花的寬度(full-width of half maximum,F(xiàn)WHM)。

        2.2 PD抑制高糖引起的心肌細(xì)胞鈣超載

        在細(xì)胞的染色條件和所有的采集參數(shù)保持一致,采用激光共聚焦線掃描的方式,對四組心肌細(xì)胞靜息期細(xì)胞內(nèi)鈣水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:高糖引起心肌細(xì)胞的靜息鈣水平顯著性升高,從對照組的(50.12±2.24)(n=100)升高到(70.53±3.54)(n=125),(t=-3.727,P<0.01)。給予PD治療后,高糖引起的心肌細(xì)胞鈣超載得到有效恢復(fù)(61.28±3.31)(n=200)[vs高糖組的(70.53±3.54)(n=125),P<0.05](圖2)。

        2.3 PD恢復(fù)高糖引起的心肌細(xì)胞ROS增加

        與對照組的熒光值(56.13±3.24)相比,高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后,高糖組心肌細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平顯著增高(98.13±6.32,t=4.923,P<0.01)。當(dāng)給予PD治療后,HG+PD組的心肌細(xì)胞ROS顯著降低(vs 高糖組:64.28±5.31,t=3.336,P<0.01),單純的PD組則不影響心肌細(xì)胞的ROS水平。

        2.4高糖抑制受磷蛋白PLB和SERCA 2a蛋白的表達(dá)

        如圖4B、C顯示,與對照組相比,高糖使得PLB蛋白表達(dá)有所降低(0.77±0.05 vs 0.98±0.04,t=-1.995,P<0.05,n=5);同時對SERCA 2a蛋白水平也有下調(diào)作用(0.58±0.05 vs 1.03±0.03,t=-3.988,P<0.01,n=5);但是高糖對SERCA 2a蛋白的抑制作用更為明顯,PLB/SERCA 2A蛋白的比值有所升高(1.31±0.11 vs 0.96±0.04,t=3.023,P<0.01,n=5)(圖4D)。給予PD治療后,PLB蛋白和SERCA 2a蛋白的表達(dá)有所恢復(fù)。

        3 討論

        鈣離子作為細(xì)胞第二信使,在心肌細(xì)胞的興奮收縮偶聯(lián)(E-C coupling)中起著不可或缺的作用。心肌細(xì)胞對鈣離子復(fù)雜而又精細(xì)的調(diào)控,維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動態(tài)平衡,從而保證細(xì)胞正常的舒縮功能。一旦鈣離子的動態(tài)平衡被打亂,心臟功能甚至結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生異常。糖尿病是胰島素分泌相對或絕對不足,并以高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征。研究表明,高糖血癥會導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和活性氧化產(chǎn)物(ROS)的增加[5]、激活 RAS系統(tǒng),致脂質(zhì)、蛋白、核酸損傷,相應(yīng)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多,另外,高糖可致抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)酶活性如SOD、過氧化氫酶的活性下降[6,7]。長期高糖血癥導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝異常通路激活、氧化應(yīng)激壓力增加和線粒體功能異常,引起心肌細(xì)胞鈣超載,即靜息期胞漿鈣離子濃度升高,可能是導(dǎo)致心肌功能障礙的重要原因[8-11]。

        虎杖苷,是從傳統(tǒng)中藥虎杖中提取的單體,具有抗血栓、抗氧化、降血糖、抗休克、調(diào)節(jié)蛋白激酶等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[12]。在本課題組之前的系列研究中發(fā)現(xiàn),PD具有很好的心血管保護(hù)作用,可以減緩肥大、防治燒傷后心功能的損傷的功效[13,14]。本研究中發(fā)現(xiàn),PD通過改變鈣火花發(fā)放頻率和鈣火花形態(tài)學(xué),顯著抑制高糖引起的心肌細(xì)胞鈣超載,進(jìn)而減少肌漿網(wǎng)鈣漏流的發(fā)生,增加鈣穩(wěn)定性,進(jìn)一步豐富了PD在心血管保護(hù)中的作用機(jī)制。

        引起心肌細(xì)胞鈣超載的原因不是單一因素,肌漿網(wǎng)中的鈣泵 SERCA 2a 活性和功能影響著鈣回收的效果。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道,心衰時SERCA 2a 活性明顯下降,同時伴有Ca2+攝取減少,胞質(zhì)內(nèi)Ca2+聚集,影響心臟的舒張功能[15]。受磷蛋白對SERCA 2a起著調(diào)控的作用,PLB 在非磷酸化狀態(tài)下抑制SERCA 2a的活性,從而抑制SERCA 2a攝取Ca2+,PLB磷酸化可逆轉(zhuǎn)這一抑制作用[16]。當(dāng)PLB/SERCA 2a比值升高時,SERCA 2a和Ca2+的親和力下降,心肌細(xì)胞舒縮功能受損。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),高糖刺激使得SERCA 2a和PLB表達(dá)均下降,但SERCA 2a降低更為顯著,PLB/SERCA 2a比值升高,從而引起鈣泵的功能受損,引起心肌細(xì)胞的鈣超載。

        近年來大量研究表明,氧化應(yīng)激是糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ),抗氧化可以抑制糖尿病心肌病的進(jìn)展,改善心功能。本研究中發(fā)現(xiàn),PD通過抑制高糖引起的心肌細(xì)胞ROS增加,恢復(fù)SERCA 2a和PLB表達(dá)水平,提示糖尿病心肌病時鈣調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異??赡芘c氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)有關(guān)。

        綜上所述,糖尿病心功能障礙的一個重要機(jī)制是SR鈣漏流增加及鈣調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常?;⒄溶湛梢詼p少高糖引起的肌漿網(wǎng)鈣漏流,緩解心肌細(xì)胞鈣超載,增加心肌細(xì)胞鈣離子的穩(wěn)定性;同時抑制氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)蛋白表達(dá),增加心功能,從而起到心肌保護(hù)作用。對于糖尿病心肌病患者,虎杖苷減少心肌漿網(wǎng)鈣漏流有可能是早期治療糖尿病心肌病的一個新的靶點(diǎn)。本研究提示虎杖苷可以抑制糖尿病心肌病的進(jìn)展,改善心功能,為糖尿病心功能障礙的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

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        (收稿日期:2016-08-16)

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