林佳琪，蘇國成,2，蘇文金,2，周常義,2

1 集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021

2 廈門市食品科技研發(fā)檢測中心，福建 廈門 361021

數(shù)字PCR技術及應用研究進展

林佳琪1，蘇國成1,2，蘇文金1,2，周常義1,2

1 集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021

2 廈門市食品科技研發(fā)檢測中心，福建 廈門 361021

林佳琪, 蘇國成, 蘇文金, 等. 數(shù)字PCR技術及應用研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(2): 170–177.

Lin JQ, Su GC, Su WJ, et al. Progress in digital PCR technology and application. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 170–177.

數(shù)字PCR是繼實時定量PCR之后新興發(fā)展起來的一種絕對定量分析技術。通過將單個DNA分子轉(zhuǎn)移入獨立的反應室，PCR擴增反應后，對熒光信號進行檢測分析，實現(xiàn)單分子的絕對定量。數(shù)字PCR技術擺脫了對標準曲線的依賴，具有更高靈敏度和準確度，在基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及下一代測序等方面均得到廣泛應用。本文介紹數(shù)字PCR技術的定量方法，并評述該技術在主要應用領域的研究進展。

數(shù)字PCR，絕對定量，泊松分布，突變檢測，拷貝數(shù)變異檢測，微生物檢測，轉(zhuǎn)基因食品檢測

1999年，美國學者Kenneth Kinzler與Bert Vogelstein首次提出了“數(shù)字PCR (Digital PCR，dPCR)”的概念[1]，該技術實現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)絕對定量的突破。其主要特點之一在于將目標分子分散入單個反應室中，使每個反應室中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子，是實現(xiàn)數(shù)字PCR高靈敏度和高準確度的關鍵。

1 技術原理

數(shù)字PCR主要原理是將單個DNA分子置于獨立的反應室中，并對其進行PCR擴增，利用TaqMan?化學試劑及染料標記探針檢測特定的靶序列，通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應單元比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學分析，實現(xiàn)樣品的絕對定量。因此，數(shù)字PCR也稱單分子PCR，其檢測過程主要包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴增和熒光信號分析。在PCR反應前，將樣品分散至幾萬個單元 (反應室) 中，使每個單元中只存在單個DNA分子。PCR擴增階段的擴增程序、擴增體系與普通PCR并沒有什么不同。在熒光信號分析階段，采用終端檢測，是對每個反應單元的熒光信號進行采集，然后直接計數(shù)或者借用泊松統(tǒng)計得到樣品的原始濃度或含量 (圖1)。與實時熒光定量PCR不同的是，整個數(shù)字PCR過程不需要擴增標準曲線和看家基因，具有良好的準確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)真正意義上的絕對定量。

基于分液方式的不同，數(shù)字PCR主要分為3種：微流體數(shù)字PCR (Microfluidic digital PCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 和芯片數(shù)字PCR (Chip digital PCR，cdPCR)。分別通過微流體通道、微液滴或微流體芯片實現(xiàn)分液，分隔開的每個微小區(qū)域都可進行單獨的PCR反應，其中mdPCR基于微流控技術，對DNA模板進行分液，微流控技術能實現(xiàn)樣品納升級或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代；ddPCR技術，是相對成熟的數(shù)字PCR平臺，利用油包水微滴生成技術，目前的儀器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200 微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)，其中Bio-rad公司的dPCR系統(tǒng)利用油包水生成技術將含有核酸分子的反應體系生成20 000個納升級微滴，經(jīng)PCR擴增后，微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測；cdPCR利用微流控芯片技術將樣品的制備、反應、分離和檢測等集成到一塊芯片上，目前的儀器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark?基因分析系統(tǒng)和Life Technologies公司的QuantStudio系統(tǒng)。利用集成流體通路技術在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實現(xiàn)生物樣品的分液、混合、PCR擴增，實現(xiàn)絕對定量。

圖1 數(shù)字PCR原理[2]Fig. 1 The schematic diagram of digital PCR[2].

2 數(shù)字PCR的優(yōu)勢

傳統(tǒng)PCR技術是將目的基因經(jīng)過PCR擴增循環(huán)，一個DNA分子模板復制成成千上萬的子代雙螺旋，然后用凝膠電泳進行檢測。但是，凝膠電泳檢測只能對擴增產(chǎn)物的分子大小進行判斷，而無法推斷出起始樣品中DNA的含量，因此無法進行定量分析；實時熒光定量PCR可以進行絕對定量和相對定量，其中絕對定量是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量，標準品可選擇純化的質(zhì)粒DNA或體外合成的ssDNA等，相對定量通過內(nèi)參等進行換算起始樣品中DNA的相對含量。數(shù)字PCR是基于傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR基礎上發(fā)展起來的第3代PCR技術，它不需要標準品，也不要制作標準曲線，即能實現(xiàn)更靈敏、更準確的絕對定量。

數(shù)字PCR高精確度的另一個重要因素是將泊松統(tǒng)計引入數(shù)字PCR的檢測應用中。由于數(shù)字PCR是一種終端檢測的分析方法，如果目標分子沒有得到很好的離散，在一個反應室中不止存在一個靶DNA，那么得到的濃度便不可信。泊松統(tǒng)計是對隨機分布的一種描述方法，當反應室/液滴量和其中陰性比例已知，即可通過泊松模型獲得初始濃度。所以，如果反應室沒有達到飽和，研究者也可以計算樣品的起始分子數(shù)。Beer等的研究表明，基于液滴方法的優(yōu)勢在于其可擴大性，增加反應容器的數(shù)量，數(shù)據(jù)的質(zhì)量也就隨之增大[3]。即當擴大或增加了反應容器的數(shù)量時，泊松精度也隨之提升。

同時，數(shù)字PCR能夠有效避免反應抑制劑的影響。隨著反應室的增加，反應受到抑制劑的影響就越小。

3 數(shù)字PCR的應用

在Web of Knowledge平臺 Science Citation Index Expanded數(shù)據(jù)庫中搜索1999年至2016年6月間“digital PCR，dPCR”關鍵詞 (截止至2016年6月25日)，搜索結(jié)果顯示，共有1 787篇相關文獻，針對其中1 405篇article類文章進行文獻統(tǒng)計分析。如圖2表明，與數(shù)字PCR相關的研究文章數(shù)量逐年增加，而且自2010年起每年論文數(shù)的增加量迅猛；在眾多國家中，美國和中國是數(shù)字PCR研究大軍中的主要國家(圖3)。據(jù)Kalorama Information發(fā)布的研究報告顯示，2019年全球數(shù)字PCR和qPCR市場預計將達到39.7億美元，中國是最主要的新興市場[4]。

3.1 在突變檢測方面的應用

常規(guī)組織和血液等樣品中，由于單個突變的體細胞含量低，使得檢出其的存在變得困難。而dPCR可對復雜的大背景進行有限的稀釋或分區(qū)，通過有限稀釋，降低野生基因型的背景信號，使得低豐度的目的序列能夠被靈敏的檢出，特別適用于稀有突變的檢測應用。研究表明，低至1/100 000的變異頻率能被檢測出來[5–6]。并且隨著反應室數(shù)量的增加，對稀有變異的分析更靈敏。

圖2 SCIE數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計1999?2016年間全球數(shù)字PCR論文發(fā)表量Fig. 2 Number of published papers on digital PCR from 1999 to June 2016 according to SCIE.

圖3 數(shù)字PCR論文發(fā)文量排在前十位的國家Fig. 3 Top 10 countries which ranked in the number of published papers on digital PCR.

dPCR在稀有突變檢測方面有廣泛的應用和研究，尤其是與癌癥相關的檢測和定量研究，如EGFR[7]、BRAF[8]、KRAS[9]、PIK3CA[10–11]、JAK2[12]和miRNAs[13]等。PIK3CA可由IGF-1、HGF、EGF等生長因子激活，與生長因子一同作用于受體酪氨酸激酶，促進增殖、血管生成和細胞的新陳代謝。Kim等用ddPCR對血清中游離的DNA進行PIK3CA突變的檢測分析[10]，血清中低豐度的PIK3CA突變成功被檢測出來。對38份轉(zhuǎn)移性膽道癌樣品進行試驗，匹配的一份血清樣品PIK3CA p.E542K對28突變拷貝呈陽性，相當于48 copies/mL血清和0.3%的等位基因的患病率；另一血清樣品PIK3CA p.H1047R對10突變拷貝呈陽性，相當于18 copies/mL血清和0.2%的等位基因的患病率。Miotto等研究表明EvaGreen染料法和TaqMan探針法均可用于人體血漿和血清中循環(huán)miRNA的ddPCR檢測定量[14]。

3.2 在拷貝數(shù)變異檢測方面的應用

通常基因表達分析依賴于瓊脂糖凝膠電泳、realtime PCR等方法，拷貝數(shù)的確定總是受到限制。而使用dPCR進行直接計數(shù)目標基因和參照基因的雙重反應，通過計算比值，便直接得到目標基因的拷貝數(shù)[15–17]。

影響HIV感染和疾病進展的CCL3編碼基因拷貝數(shù)變異 (Copy number variations，CNV)的發(fā)現(xiàn)引起廣泛的爭議，已經(jīng)在一定程度上歸因于拷貝數(shù)評估方法獲得的不同結(jié)果。CCL3基因編碼CC趨化因子CCL4，也是CCR5受體的自然配體，對HIV-1起到了保護作用。Bharuthram等用標準方法qPCR和ddPCR對CCL4L基因拷貝數(shù)進行評估測定[18]。研究表明，與qPCR (r=0.87，P＜0.000 1)相比，由ddPCR測得CCL4L拷貝與CCL4L1和CCL4L2拷貝之和具有良好的相關性 (r=0.99，P＜0.000 1)。而qPCR在高拷貝數(shù)時出現(xiàn)準確性明顯下降。Whale等模擬不同CNVs的HER2基因擴增，相同試驗條件下，dPCR能夠檢測比qPCR更低的CNVs[19]。由于dPCR準確度與擴增大小和模板濃度是直接相關性的，他們也建立了用于測量CNV的dPCR方法。利用泊松和二項分布，得出dPCR的方差表達式。

3.3 在微生物檢測方面的應用

核酸擴增技術是病原微生物檢測的一個重要方法，但可能存在的問題是，有時候低水平目標分子和小分子抑制劑的存在使得檢測定量的結(jié)果發(fā)生偏移。dPCR則是一種不需要標準曲線并且對部分抑制劑不靈敏的檢出方法。因此，研究人員紛紛將其應用于一些病毒或致病菌的檢測研究中，如HBV[20–21]、腸病毒[22]、腺相關病毒[23]、巨細胞病毒[24]、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[25]、結(jié)核分支桿菌[26]、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌[27]等。Strain等采用ddPCR和qPCR對HIV 經(jīng)過聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療的病人體內(nèi)殘留的DNA進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，ddPCR具有更高的精確度和更低的拷貝變異系數(shù)[28]。Dong等對E. coliO157:H7的rfbE基因建立ddPCR，優(yōu)化探針濃度，在20 μL體系中，對E. coliO157:H7基因組DNA的檢測范圍為4?1.25×105copies，線性相關系數(shù)為0.999[29]。同時用ddPCR和qPCR對16份實際樣品進行檢測得到相同結(jié)果。

在環(huán)境檢測方面，dPCR也得到相應的應用[30–31]。Josefa等在對土壤、植物根莖樣品中煙草疫霉菌的低拷貝DNA定性定量的研究發(fā)現(xiàn)，與qPCR相比，dPCR對反應抑制劑更不敏感[32]。由于基于標準曲線的realtime PCR方法在檢測方面帶來的偏差，Cao等利用雙重ddPCR同時檢測糞源和水質(zhì)中的腸球菌和人源糞便相關標記HF183[33]。qPCR中雙重的腸球菌和HF183相互競爭使得其無檢出或超出其單重最低檢測濃度范圍，而ddPCR的單重和雙重檢測結(jié)果一致。其對抑制劑的較高耐受性、重復性、檢測靈敏度以及準確度均比qPCR高，但是其定量上限較realtime PCR低。Anja等將ddPCR與qPCR聯(lián)合起來使用，用ddPCR制備標準曲線，用realtime PCR進行定量，成功實現(xiàn)對不同生物膜形成時期的單增李斯特菌定量檢測[34]。

3.4 在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面的應用

歐盟國家對轉(zhuǎn)基因食品有著嚴格的限定，而目前，一般采用實時定量PCR用于商品中轉(zhuǎn)基因的分子定量分析。但是在一些復雜的食物原料和飼料原材料中，目標DNA非常少，使得對其的檢測和定量受到限制。dPCR為國內(nèi)外研究人員提供了新的方法。Morisset等用ddPCR對MON810轉(zhuǎn)基因和hmg玉米參考基因進行絕對定量[35]。研究表明，ddPCR對低濃度的檢測具有更高的重復性，并且對抑制劑具有更高耐受性。Dobnik等用多重ddPCR檢測定量12個歐盟授權轉(zhuǎn)基因玉米，對于含轉(zhuǎn)基因組織樣品中，該方法比實時定量PCR更高通量、更高效[36]。Damira等建立雙重ddPCR用于檢測定量轉(zhuǎn)基因玉米中T-nos/hmg基因的拷貝數(shù)比例，通過中心復合設計優(yōu)化，并在體系中加入DNA 消化酶減小檢測偏差，所建立的方法T-nos檢測限為11拷貝，T-nos/hmg 比例的動態(tài)范圍為 0.08%–100% [37]。

3.5 在下一代測序方面的應用

下一代測序 (NGS) 又叫高通量測序，是測序技術革命性的進步，能一次上百萬條DNA分子進行序列測定，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和全基因組進行細致全貌的分析成為現(xiàn)實。dPCR平臺可以與NGS對接，實現(xiàn)對測序文庫的質(zhì)量控制、提供對測序文庫的定量分析和質(zhì)量評估信息。一方面，dPCR對NGS的測序結(jié)果進行驗證，對諸如單核苷酸多態(tài)性，突變及拷貝數(shù)變異在內(nèi)的基因組變異進行驗證，確保測序結(jié)果的可信度；另一方面，所得到的結(jié)果還包含反映測序文庫質(zhì)量的信息，如接頭與接頭二聚體、錯誤連接片段、過長連接片段等，這是當前其他方法所不具備的優(yōu)勢。Alikian等研究表明，在慢性粒細胞白血病患者的檢測中，dPCR比qPCR更準確，定量分析結(jié)果可靠性高、重復性好[38]。

4 展望

dPCR與普通PCR、qPCR相比具有獨特的技術優(yōu)勢，實現(xiàn)了單分子DNA絕對定量，使其成為了分子生物學研究中的重要工具，研究者對其應用分析也日益關注。近期，相應的分析軟件有所突破，美國已推出一款ddpcr軟件可用于使用者分析dPCR數(shù)據(jù)，免費在線網(wǎng)址為https://daattali.com/shiny/ddpcr/[39]。軟件及網(wǎng)站的建立為dPCR技術的推廣和應用提供重要支持。

未來如果能有效解決dPCR耗材成本高、實驗通量少等問題和實現(xiàn)操作智能化，dPCR將在臨床診斷與治療、微生物檢測和食品安全檢測等方面擁有更廣闊的應用前景。

REFERENCES

[1] Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(16): 9236–9241.

[2] 數(shù)字PCR可以實現(xiàn)更高準確性、靈敏度和絕對定量[EB/OL]. [2016-06-12]. http://www.thermofisher. com/cn/zh/home/life-science/pcr/digital-pcr.html.

[3] Beer NR, Hindson BJ, Wheeler EK, et al. On-chip, real-time, single-copy polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal Chem, 2007, 79(22): 8471–8475.

[4]qPCR and dPCR markets (instruments, reagents, software/services)[EB/OL]. [2016-06-12]. http://www.marketresearch.com/Kalorama-Informa tion-v767/qPCR-dPCR-Instruments-Reagents-Soft ware-10061387/.

[5] Heyries KA, Tropini C, VanInsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods, 2011, 8(8): 649–651.

[6] Pekin D, Skhiri Y, Baret JC, et al. Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. Lab Chip, 2011, 11(13): 2156–2166.

[7] Koh Y, Kawaguchi T, Watanabe M, et al. Ultrasensitive detection of the pretreatment EGFR T790M mutation in non-small cell lung cancer patients with an EGFR-activating mutation using picodroplet digital PCR. Cancer Res, 2015, 75(15S): 617.

[8] Bidshahri R, Attali D, Fakhfakh K, et al. Quantitative detection and resolution ofBRAFV600 status in colorectal cancer using droplet digital PCR and a novel wild-type negative assay. J Mol Diagn, 2016, 18(2): 190–204.

[9] Taly V, Pekin D, Benhaim L, et al. Multiplex picodroplet digital PCR to detectKRASmutations in circulating DNA from the plasma of colorectal cancer patients. Clin Chem, 2013, 59(12): 1722–1731.

[10] Kim ST, Lira M, Deng S, et al. PIK3CA mutation detection in metastatic biliary cancer using cell-free DNA. Oncotarget, 2015, 6(37): 40026–40035.

[11] Takeshita T, Yamamoto Y, Yamamoto-Ibusuki M, et al. Prognostic role ofPIK3CAmutations of cell-free DNA in early-stage triple negative breast cancer. Cancer Sci, 2015, 106(11): 1582–1589.

[12] Kinz E, Leiherer A, Lang AH, et al. Accurate quantitation of JAK2 V617F allele burden by array-based digital PCR. Int J Lab Hematol, 2015, 37(2): 217–224.

[13] Li N, Ma J, Guarnera MA, et al. Digital PCR quantification of miRNAs in sputum for diagnosis of lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(1): 145–150.

[14] Miotto E, Saccenti E, Lupini L, et al. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2014, 23(12): 2638–2642.

[15] Ling L, Swain M, Conyers R, et al. A powerful new approach to measuring engraftment using copy number variations and droplet digital PCR, exemplified in a complex allogeneic bone marrow transplantation case. Pathology, 2015, 47(S1): S87.

[16] Zhang YN, Tang ET, Du ZQ. Detection of MET gene copy number in cancer samples using the droplet digital PCR method. PLoS ONE, 2016, 11(1): e0146784.

[17] GLMMs for nucleic acid concentration estimation in digital droplet PCR [EB/OL]. [2016-06-12]. https://biblio.ugent.be/publication/5992468.

[18] Bharuthram A, Paximadis M, Picton ACP, et al. Comparison of a quantitative real-time PCR assay and droplet digital PCR for copy number analysis of theCCL4Lgenes. Infect Genet Evol, 2014, 25: 28–35.

[19] Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res, 2012, 40(11): e82.

[20] Huang JT, Liu YJ, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue. Clin Chem, 2015, 61(1): 290–296.

[21] Wongjitrat C, Horthongkham N, Sutthent R, et al. Comparison of droplet digital PCR and real time PCR method for HBV DNA quantification. J Med Assoc Thai, 2015, 98(S9): S140–S145.

[22] Lui YLE, Tan EL. Droplet digital PCR as a useful tool for the quantitative detection ofEnterovirus71. J Virol Methods, 2014, 207: 200–203.

[23] Lock M, Alvira MR, Chen SJ, et al. Absolute determination of single-stranded and selfcomplementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods, 2013, 25(2): 115–125.

[24] Hayden RT, Gu Z, Ingersoll J, et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. J Clin Microbiol, 2013, 51(2): 540–546.

[25] Kelley K, Cosman A, Belgrader P, et al. Detection of methicillin-resistantStaphylococcus aureusby a duplex droplet digital PCR assay. J Clin Microbiol, 2013, 51(7): 2033–2039.

[26] Devonshire AS, Honeyborne I, Gutteridge A, et al. Highly reproducible absolute quantification ofMycobacterium tuberculosiscomplex by digital PCR. Anal Chem, 2015, 87(7): 3706–3713.

[27] Droplet digital PCR method for multiple gene marker determination in single cells enabling accurate detection of priority STEC in food enrichment cultures [EB/OL]. [2016-06-12]. https://iafp.confex.com/iafp/2016/ webprogram/Paper11730.html.

[28] Strain MC, Lada SM, Luong T, et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PLoS ONE, 2013, 8(4): e55943.

[29] Dong LH, Zhang L, Jing J, et al. Development of droplet digital polymerase chain reaction for quantifyingEscherichia coliO157:H7. Chin J Anal Chem, 2015, 43(3): 319–324 (in Chinese).董蓮華, 張玲, 姜君, 等. 大腸桿菌O157:H7微滴數(shù)字PCR定量方法的建立. 分析化學, 2015, 43(3): 319–324.

[30] Te SH, Chen EY, Gin KYH. Comparison ofquantitative PCR and droplet digital PCR multiplex assays for two genera of bloom-forming cyanobacteria,CylindrospermopsisandMicrocystis. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(15): 5203–5211.

[31] Ra?ki N, Dreo T, Gutierrez-Aguirre I, et al. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods, 2014, 10: 42.

[32] Blaya J, Lloret E, Santísima-Trinidad AB, et al. Molecular methods (digital PCR and real-time PCR) for the quantification of low copy DNA ofPhytophthora nicotianaein environmental samples. Pest Manag Sci, 2016, 72(4): 747–753.

[33] Cao YP, Raith MR, Griffith JF. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res, 2015, 70: 337–349.

[34] Klan?nik A, Toplak N, Kova? M, et al. Quantification ofListeria monocytogenescells with digital PCR and their biofilm cells with real-time PCR. J Microbiol Methods, 2015, 118: 37–41.

[35] Morisset D, ?tebih D, Milavec M, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS ONE, 2013, 8(5): e62583.

[36] Dobnik D, Spilsberg B, Ko?ir AB, et al. Multiplex quantification of 12 European union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction. Anal Chem, 2015, 87(16): 8218–8226.

[37] Dalmira FU, Melina PU, José-Benigno VT, et al. Development, optimization, and evaluation of a duplex droplet digital PCR assay to quantify theT-nos/hmgcopy number ratio in genetically modified maize. Anal Chem, 2016, 88(1): 812–819.

[38] Alikian M, Ellery P, Forbes M, et al. Next-generation sequencing-assisted DNA-based digital PCR for a personalized approach to the detection and quantification of residual disease in chronic myeloid leukemia patients. J Mol Diagn, 2016, 18(2): 176–189.

[39] Attali D, Bidshahri R, Haynes C, et al. ddPCR: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000 Res, 2016, 5: 1411.

(本文責編 陳宏宇)

Progress in digital PCR technology and application

Jiaqi Lin1, Guocheng Su1,2, Wenjin Su1,2, and Changyi Zhou1,2
1College of Food and Bioengineering,Jimei University,Xiamen361021,Fujian,China
2Xiamen Food Research and Inspection Centre,Xiamen361021,Fujian,China

Digital PCR is an emerging analysis technology for absolute quantification after realtime-PCR. Through digital PCR, single DNA molecules are distributed into isolated reactions, and the product with fluorescence signal can be detected and analyzed after amplification. With the advantages of higher sensitivity and accuracy, digital PCR, independent of a standard curve, is developing rapidly and applied widely to the next generation sequencing and detection fields, such as gene mutation, copy number variation, microorganism, and genetically modified food. In this article, we reviewed the quantitative method and research progress of digital PCR technology in the main application fields.

digital PCR, absolute quantification, poisson distribution, mutation detection, copy number variationdetection, microbial detection, genetically modified food detection

Changyi Zhou. Tel: +86-592-6181487; E-mail: chyizhou@163.com

Received:July 15, 2016;Accepted:November 7, 2016

Supported by:Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2015J01614), Science and Technology Project of Xiamen (No. 3502Z20133012).

福建省自然科學基金 (No. 2015J01614)，廈門市科技計劃項目 (No. 3502Z20133012) 資助。

時間：2017-02-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170213.1638.006.html