武軍艷，孔德晶，方彥，孫萬(wàn)倉(cāng)，劉海卿，劉自剛，李學(xué)才

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070）

北方旱寒區(qū)冬油菜抗寒性相關(guān)指標(biāo)的QTL定位

武軍艷，孔德晶，方彥，孫萬(wàn)倉(cāng)，劉海卿，劉自剛，李學(xué)才

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070）

以抗寒性不同的白菜型冬油菜品種隴油7號(hào)與隴油9號(hào)為親本構(gòu)建的F2群體為材料，對(duì)白菜型冬油菜抗寒性相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行了QTL定位分析。在白菜型油菜的10條染色體上定位了SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量共6個(gè)性狀的24個(gè)QTL位點(diǎn)，可解釋表型變異為11.1783%～81.1753%；10個(gè)顯性效應(yīng)表現(xiàn)為顯性正效應(yīng)，LOD值在3.2787～163.7958之間。染色體2A的BrID90127－BrID10421區(qū)、BrID10421－BrID10709區(qū)及BrID10709－BrID101165區(qū)，5A的BRMS034（R5）－Ra3－H10區(qū)、6A的Ra1－F06－Ra2－D04區(qū)、8A的BrID10839－Ra2－E12區(qū)和10A的BrID90115－Ra2－E07區(qū)是多個(gè)性狀QTL共享的標(biāo)記區(qū)間。研究結(jié)果對(duì)冬油菜抗寒性基因精確定位具有一定價(jià)值。

白菜型冬油菜；抗寒性；QTL；北方旱寒區(qū)

低溫是影響北方旱寒區(qū)冬油菜安全越冬的主要因素之一［1－3］。由于白菜型冬油菜抗寒性顯著強(qiáng)于甘藍(lán)型冬油菜［4］，因此，對(duì)白菜型冬油菜抗寒性的研究是北方旱寒區(qū)冬油菜遺傳育種研究的主要方向。目前對(duì)白菜型冬油菜的研究主要集中在品種的適應(yīng)性、生長(zhǎng)發(fā)育特性、產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)特性［5－7］、相關(guān)抗寒基因克隆及表達(dá)分析等方面［8］。此外也有對(duì)構(gòu)建白菜型油菜連鎖圖譜和白菜型油菜幼苗絨霉病的基因定位研究，如Wei Li等［9］利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)白菜型油菜連鎖圖譜的構(gòu)建，為白菜型油菜基因序列和遺傳信息的研究提供依據(jù)；Yu SC等［10］利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)白菜型油菜幼苗絨霉病進(jìn)行QTL定位的研究。而對(duì)白菜型冬油菜抗寒性相關(guān)分析及抗寒性遺傳的研究鮮見報(bào)道。

本研究以超強(qiáng)抗寒性品種隴油7號(hào)和冬油菜品種隴油9號(hào)為親本組配的F2群體為試驗(yàn)材料，利用SSR和InDel標(biāo)記來(lái)繪制分子標(biāo)記的遺傳圖譜，并利用QTL IciMapping V3.3軟件對(duì)白菜型冬油菜抗寒性的相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，分析QTL的效應(yīng)，揭示白菜型冬油菜抗寒性相關(guān)性狀的分子機(jī)制，為白菜型冬油菜后期抗寒性基因的精確定位、基因克隆及分子標(biāo)記輔助選擇等研究工作奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，油菜在整個(gè)生育期內(nèi)，會(huì)受到冬前與冬后兩重低溫的影響，研究油菜的抗寒性，不僅對(duì)于我國(guó)北方旱寒區(qū)冬油菜抗寒性具有重要應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)對(duì)提高我國(guó)其他冬油菜品種類型的抗寒性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為白菜型冬油菜，隴油7號(hào)與隴油9號(hào)組配雜交組合，構(gòu)建F2群體，得到103個(gè)單株，母本隴油7號(hào)為超強(qiáng)抗寒性品種，父本隴油9號(hào)為中抗寒性品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取取油菜3葉期幼嫩葉片，用CTAB法對(duì)基因組DNA進(jìn)行提?。?1］。

1.2.2 F2群體抗寒性鑒定對(duì)F2群體的抗寒性鑒定主要依據(jù)越冬率（冬后存活情況）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、游離脯氨酸和可溶性蛋白等生理生化指標(biāo)。其具體鑒定方法及結(jié)果已于2014年報(bào)道，詳見文獻(xiàn)［12］。

1.2.3 分子標(biāo)記分析根據(jù)www.UK crop.net發(fā)表的油菜微衛(wèi)星引物序列以及Brassica Database網(wǎng)站上選出均勻分布于白菜型冬油菜10對(duì)染色體上的51對(duì)SSR引物和264對(duì)InDel引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。用315對(duì)引物在親本材料中進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選結(jié)果用6%變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色，讀取條帶。

1.2.4 遺傳圖譜繪制和QTL作圖用篩選出的在親本有多態(tài)性的引物對(duì)F2群體進(jìn)行掃描，與親本隴油7號(hào)相同帶型記為“A”，與親本隴油9號(hào)相同帶型記為“B”，雜合體記為“H”，缺失的帶型記為“－”。分子標(biāo)記的遺傳圖譜構(gòu)建和QTL分析，采用QTL IciMapping V3.3軟件進(jìn)行。

1.2.5 QTL命名方法按照“QTL＋性狀＋單位（機(jī)構(gòu)）＋染色體”命名。其中，QTL以“Q”表示，性狀和單位以英文縮寫表示，染色體以白菜型冬油菜染色體的名稱表示，性狀與單位間加“.”，性狀和染色體之間加“－”。如Qsod.gsau－1A表示位于1A染色體上SOD活性（SOD activity）的QTL，gsau為Gansu Agricultural University的縮寫。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記在親本及F2群體中的多態(tài)性篩選

用264對(duì)引物在親本隴油7號(hào)和隴油9號(hào)中篩選，選出39對(duì)在親本間表現(xiàn)出明顯多態(tài)性的引物（表1，圖2）。篩選到的引物對(duì)F2群體的單株分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2），均能擴(kuò)增出差異性條帶。

表1 39個(gè)標(biāo)記在染色體上的分布Table 1 Distribution of39markers on the chromosomes

2.2 白菜型冬油菜抗寒性相關(guān)性狀QTL分析

結(jié)合抗性鑒定結(jié)果和分子標(biāo)記結(jié)果，在白菜型冬油菜1A、2A、3A、5A、6A、7A、8A及10A等8條染色體上共檢測(cè)到SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量共6個(gè)性狀的24個(gè)QTL（表2）。10個(gè)顯性效應(yīng)表現(xiàn)為顯性正效應(yīng)，LOD值在3.2787～163.7958之間。24個(gè)QTL中，Qsod.gsau－6A－2可解釋的表型值為最高，達(dá)到81.1753%，Qmda.gsau－8A的表型效應(yīng)值最低，為11.1783%。2A、6A的染色體上所檢測(cè)到的QTL相對(duì)較多。在6個(gè)性狀中，所檢測(cè)到控制SOD的QTL數(shù)量最多，有12個(gè)QTL，可解釋表型變異率的12.0537%～81.1753%。其次是CAT、游離脯氨酸和可溶性蛋白，它們均檢測(cè)到3個(gè)QTL，表型效應(yīng)值的解釋率分別為37.3135%～39.2403%、52.2419%～61.4756%、12.4599%～21.9624%（圖3）。

圖1 部分引物在親本間篩選結(jié)果Fig.1 Screening for primers for cross parents

圖2 引物BrID101147在F2作圖群體中的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 InDel amplification of primer BrID101147

控制白菜型油菜抗寒性相關(guān)性狀QTL在染色體上分布不均勻，在有些染色體的某些區(qū)段上，形成了QTL的熱點(diǎn)區(qū)域。有些抗寒性相關(guān)的QTL在2A、5A、6A和10A上存在一些共享的標(biāo)記區(qū)間。如控制SOD活性、CAT活性和可溶性蛋白的QTL，它們共享2A染色體的BrID90127－BrID10421區(qū)域，2A染色體的BrID10421－BrID10709區(qū)域，同時(shí)控制著SOD活性和CAT活性的QTL，SOD活性、游離脯氨酸和可溶性蛋白的QTL，它們共享2A染色體的BrID10709－BrID101165區(qū)域；5A的BRMS034（R5）－Ra3－H10區(qū)域同時(shí)控制SOD活性的2個(gè)QTL；同時(shí)，在6A染色體上，亦有2個(gè)SOD活性的QTL被Ra1－F06－Ra2－D04區(qū)域同時(shí)控制；MDA和可溶性蛋白的QTL共享了染色體8A的BrID10839－Ra2－E12區(qū)間；10A的BrID90115－Ra2－E07區(qū)域同時(shí)在控制SOD活性和POD活性的QTL。

3 討論

Song等［13］用F2群體構(gòu)建了第一張白菜的RFLP遺傳圖譜，含有280個(gè)標(biāo)記，總遺傳圖距為1 850 cm，這項(xiàng)研究使白菜及白菜型油菜的各數(shù)量性狀的QTL成為可能。在抗逆性研究方面，主要集中在油菜抗病性的QTL研究上，并且報(bào)道的大多數(shù)是甘藍(lán)型油菜；如甘藍(lán)型油菜抗根腫病［14］、抗黑脛病［15］、抗菌核?。?6］的QTL定位。對(duì)白菜型油菜的QTL定位研究報(bào)道很少，對(duì)白菜型油菜抗寒性的QTL定位研究目前未見報(bào)道。

圖3 各指標(biāo)相關(guān)QTLs在染色體上的位置Fig.3 The location of QTLs on the chromosomes

表2 白菜型冬油菜抗寒性相關(guān)性狀的QTLTable 2 QTLs associated with cold resistance in winter rapeseed

本研究以超強(qiáng)抗寒品種隴油7號(hào)和中抗寒品種隴油9號(hào)為親本，構(gòu)建得到一個(gè)含有103個(gè)株系的F2群體。對(duì)F2群體的單株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共檢測(cè)到關(guān)于SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量共6個(gè)性狀的24個(gè)QTL，涉及1A、2A、3A、5A、6A、7A、8A和10A等8條染色體，這表明本研究中抗寒相關(guān)的位點(diǎn)可能位于這些染色體上，這與張學(xué)賢［17］的研究結(jié)果部分相似。在24個(gè)QTL中，表現(xiàn)為加性正效應(yīng)的有17個(gè)，說(shuō)明來(lái)自母本隴油7號(hào)等位基因的貢獻(xiàn)較大。同時(shí)，在白菜型油菜2A、5A、6A、8A和10A的染色體上存在一些共享標(biāo)記區(qū)間。染色體上檢測(cè)的7個(gè)區(qū)間是不同抗寒性相關(guān)性狀QTL的共享區(qū)域。

由于植物的抗寒性是一個(gè)由多基因控制表達(dá)的性狀［18－20］，目前對(duì)植物抗寒性QTL相關(guān)方面的研究較少。巨偉等［21］通過(guò)對(duì)冬小麥苗期抗寒性狀的QTL分析研究，將冬小麥的抗寒性基因定位到了5B染色體的某一段區(qū)間內(nèi)；丁成龍等［22］通過(guò)對(duì)結(jié)縷草抗寒性狀相關(guān)的QTL研究，檢測(cè)到了3個(gè)與抗寒性相關(guān)的QTL。但是這些研究結(jié)果都還未將抗寒性基因精確定位。本研究共檢測(cè)到24個(gè)QTL位點(diǎn)，且分別分布于白菜型冬油菜的8條染色體上，抗寒性基因具體位于哪條染色體的哪些區(qū)段，還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

另外，本試驗(yàn)結(jié)果為一年在一個(gè)點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果。為了保證QTL定位的準(zhǔn)確性，還需嚴(yán)格地對(duì)影響性狀的環(huán)境進(jìn)行控制，因此應(yīng)進(jìn)行多年、多點(diǎn)試驗(yàn)來(lái)相互驗(yàn)證。本試驗(yàn)進(jìn)一步的工作可以通過(guò)擴(kuò)大分析群體，增加相對(duì)電導(dǎo)率的分析，增加不同年份與不同生態(tài)壞境的抗寒性分析，提高遺傳圖譜密度，進(jìn)行精細(xì)定位研究。

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QTL analysis of cold tolerance for physiological traits of w inter rapeseed in northern arid-cold area

WU Jun-yan，KONG De-jing，F(xiàn)ANG Yan，SUNWan-cang，LIU Hai-qing，LIU Zi-gang，LIXue-cai
（College of Agronomy，Gɑnsu Agriculturɑl University，Gɑnsu Key Lɑb of Crop Improvementɑnd Germplɑsm Enhɑncement，Gɑnsu Provinciɑl Key Lɑborɑtory of Aridlɑnd Crop Science，Lɑnzhou，Gɑnsu 730070，Chinɑ）

The superior cold resistance B.rapa variety“Longyou 7”and general cold variety“Longyou 9”were used as parents and a F2mapping population was constructed.The results showed that39 primerswere selected for further analysis of F2population.Based onmolecularmarker geneticmap and QTL software，a totalof24QTLswere detected for SOD activity，POD activity，CAT activity，MDA content，free proline content and soluble protein content from 10 chromosomes.Those QTLswere able to explain 11.1783%～81.1753%of phenotypic variation.The dominanteffectsof 10 QTLs were positive effects，LOD values were between 3.2787～163.7958.The data showed that the regions BrID90127－BrID10421，BrID10421－BrID10709 and BrID10709－BrID101165 on 2A，BRMS034（R5）－Ra3－H10 on 5A，Ra1－F06－Ra2－D04 on 6A，BrID10839－Ra2－E12 on 8A，BrID90115－Ra2－E07 on 10A were common regions shared bymulti-traits.The result of present study is useful for the accurate position ofwinter rapa.

winter rapeseed（BrɑssicɑrɑpɑL.）；cold resistance；QTL；northern arid-cold area

S565.4

：A

1000-7601（2017）01-0205-06

10.7606／j.issn.1000-7601.2017.01.31

2016-01-06

甘肅省青年科技基金計(jì)劃（145RJYA253）；農(nóng)業(yè)部產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)資金項(xiàng)目（CARS－13）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（145RJZG050）

武軍艷（1981—），女，甘肅平川人，講師，在讀博士，主要從事油菜的育種工作。E-mail：wujuny＠gsau.edu.cn。

孫萬(wàn)倉(cāng)（1957—），男，教授，博士，主要從事油菜的育種工作。E-mail：18293121851＠163.com.cn。