王雯君+林曦+童夏生+王恩智+葉輝+葉樂(lè)平

[摘要] 目的 探討核苷酸結(jié)合寡聚域（NOD）樣受體在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 采用哮喘大鼠模型分離提純血中性粒細(xì)胞（PMN），實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PMN NOD2和NALP1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 哮喘組NOD2 mRNA的表達(dá)量（3.11±0.82）顯著高于對(duì)照組（P<0.01），地塞米松組NOD2 mRNA的表達(dá)量（1.30±0.28）顯著低于哮喘組（P<0.01）。哮喘組NALP1 mRNA的表達(dá)量（0.51±0.21）顯著低于對(duì)照組（P<0.01），地塞米松組NALP1 mRNA的表達(dá)量（0.91±0.26）顯著高于哮喘組（P<0.05）。血PMN NOD2和NALP1 mRNA 的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)性（n=24，r=-0.74，P<0.01）。 結(jié)論 哮喘大鼠血PMN NOD2 mRNA的表達(dá)升高，NALP1 mRNA的表達(dá)則相反，地塞米松具有調(diào)節(jié)模式識(shí)別受體的作用。

[關(guān)鍵詞] 哮喘；模式識(shí)別受體；NOD樣受體；地塞米松；發(fā)病機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R562.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）28-0039-03

哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子[1]，嗜酸性粒細(xì)胞被認(rèn)為是最主要的炎癥細(xì)胞之一[2]。中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）也是眾多炎癥細(xì)胞中的一種，尤其在非嗜酸性粒細(xì)胞表型的哮喘、糖皮質(zhì)激素治療不敏感和重度哮喘中PMN所起的作用越來(lái)越被人們所重視[3，4]。在哮喘急性期，PMN被激活，它能分泌多種炎癥因子和蛋白酶類(lèi)參與哮喘的炎癥機(jī)制[3，4]，但其參與哮喘炎癥的機(jī)制至今尚未完全清楚。模式識(shí)別受體是一類(lèi)介導(dǎo)天然免疫和繼發(fā)性免疫的識(shí)別受體，目前認(rèn)為模式識(shí)別受體與哮喘的炎癥機(jī)制密切相關(guān)[5]。核苷酸結(jié)合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）2和NALP（NACHT、LRR和PYD domains-containing protein，NALP）均屬于NOD樣受體家族成員，為細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，與機(jī)體的抗感染、腫瘤、關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[6，7]。但NOD樣受體家族在哮喘炎癥機(jī)制中的作用如何目前知之甚少。本研究通過(guò)觀察哮喘大鼠PMN NOD2和NALP1的表達(dá)，探討哮喘的發(fā)病機(jī)制，為哮喘的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠24只，4～5周齡，平均128 g，由杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）20140001。

1.2 主要試劑

Ⅴ級(jí)雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）和Histopaque 1119及1083分離液均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 分組及模型制備

大鼠飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食和飲水，溫度20℃，濕度50%。共24只，隨機(jī)平均分為三組，命名為哮喘組、對(duì)照組、地塞米松組。采用OVA致敏的方法復(fù)制哮喘模型[8]。具體方法為：第1天和第8天腹腔注射OVA/氫氧化鋁混合液2 mL（含OVA 1 mg和氫氧化鋁100 mg）致敏，各1次。第15天開(kāi)始每天向大鼠噴霧（空氣壓縮霧化器：德國(guó)百瑞公司生產(chǎn)）1% OVA 30 min，連續(xù)激發(fā)14 d。地塞米松組在OVA霧化激發(fā)開(kāi)始前一天至霧化結(jié)束止，每日1次給予腹腔注射地塞米松1 mg/只，共15 d。哮喘大鼠主要癥狀為搔癢、抓鼻、躁動(dòng)、喘鳴、呼吸加快、腹肌抽搐、毛發(fā)逐漸變黃及無(wú)光澤等。

1.4 血PMN分離提純和肺組織標(biāo)本的制備

末次激發(fā)24 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟抽血4 mL，采用Histopaque分離液行密度梯度離心，分離提純血PMN[9]，0.1M PBS洗滌，臺(tái)盼藍(lán)查細(xì)胞活力，瑞氏染色查PMN純度為90%。取左肺門(mén)組織，多聚甲醛固定、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.5 Rt-PCR法檢測(cè)血PMN NOD2和NALP1 mRNA的表達(dá)

采用Trizol-離心柱法提取總RNA，然后轉(zhuǎn)錄成cDNA。測(cè)定RNA的反應(yīng)體系（購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司）共20 μL，25℃干浴5 min、42℃干浴60 min、70℃干浴5 min終止反應(yīng)，-80℃保存cDNA。20 μL反應(yīng)液為：特異性PCR引物各0.3 μL、cDNA模板2 μL、滅菌超純水7.4 μL、SYBR 10 μL。95℃15 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72°C 20 s（39循環(huán)），增量0.5°C 10 s?；蛐蛄幸?jiàn)表1，結(jié)果分析采用比較CT值法：△△CT=（CTNOD2/NALP1-CTβ-actin）實(shí)驗(yàn)組-（CTNOD2/NALP1-CTβ-actin）對(duì)照組，基因相對(duì)表達(dá)量（RQ）采用2-△△CT方法計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，Homogeneity of Variances行方差齊性分析，多組間比較采用秩和檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

HE染色顯示：哮喘組見(jiàn)黏液腺增生，支氣管腔見(jiàn)較多黏液分泌物，部分管腔有黏液栓，支氣管上皮細(xì)胞增生，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔旁見(jiàn)聚集的淋巴細(xì)胞。對(duì)照組肺組織細(xì)胞清晰，結(jié)構(gòu)完整，炎癥細(xì)胞和支氣管腔內(nèi)分泌物少。地塞米松組肺組織炎癥細(xì)胞和炎癥分泌物較哮喘組減少（封三圖1）。

2.2 血PMN NOD2和NALP1 mRNA的表達(dá)

抽提物總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，目的基因NOD2、NALP1及內(nèi)參基因β-actin的溶解曲線均為單一峰，基因擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S型，溶解溫度依次為90.5℃、79℃、87℃。NOD2和NALP1 mRNA的表達(dá)量均方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)。

哮喘組NOD2 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.01），地塞米松組NOD2 mRNA的表達(dá)量顯著低于哮喘組（P<0.01）。哮喘組NALP1 mRNA的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.01），地塞米松組NALP1 mRNA的表達(dá)量顯著高于哮喘組（P<0.05）（表2）。

2.3 相關(guān)性分析

血PMN NOD2和NALP1 mRNA 的表達(dá)水平呈顯著直線負(fù)相關(guān)（n=24，r=-0.74，P<0.01）。

3 討論

先天免疫系統(tǒng)是機(jī)體的第一道防線，通過(guò)模式識(shí)別受體對(duì)病原體作出快速應(yīng)答。人類(lèi)的模式識(shí)別受體主要有兩類(lèi)：一類(lèi)是膜結(jié)合受體，如Toll樣受體；另一類(lèi)是細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體，包括NOD樣受體和具有螺旋酶結(jié)構(gòu)域的抗病毒蛋白受體[10]。目前的研究表明，Toll樣受體與哮喘的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，重度哮喘患者支氣管平滑肌TLR5和TLR7的表達(dá)下降[11]，哮喘患者血調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)也下降[12]。NOD樣受體家族是細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體，包含NOD2和NALP1，NOD1和NOD2是NOD樣受體家族最具有代表性的亞型，NOD樣受體與多種肺部急、慢性炎癥性疾病有關(guān)，如肺炎、慢性阻塞性肺疾病、肺損傷、肺塵病、哮喘等[13，14]。

本研究提示，大鼠哮喘各組血PMN均有NOD2和NALP1 mRNA的表達(dá)，證實(shí)了模式識(shí)別受體可在血PMN細(xì)胞中表達(dá)，PMN可能通過(guò)表達(dá)模式識(shí)別受體在機(jī)體中起到一定的病理或生理作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，不同的模式識(shí)別受體所表達(dá)的水平不同，NOD2 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而NALP1 mRNA的表達(dá)則相反，表明它們所起的作用可能也不同。通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，NOD2和NALP1 mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示不同類(lèi)型的模式識(shí)別受體之間的表達(dá)具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，共同參與機(jī)體的免疫過(guò)程。本文推測(cè)，在OVA誘發(fā)的哮喘模型中，由于PMN的NOD2 mRNA的表達(dá)過(guò)多及NALP1 mRNA的表達(dá)不足共同涉及了哮喘的炎癥機(jī)制。國(guó)內(nèi)相似的研究也發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠肺組織和哮喘患者的趨化因子CCR3陽(yáng)性的粒細(xì)胞中NOD2蛋白的表達(dá)均下降[15，16]。這與本研究結(jié)果有區(qū)別，可能NOD2在不同的組織中表達(dá)不同，也可能是NOD2的蛋白與基因之間表達(dá)不一致。

目前認(rèn)為，以NOD樣受體為治療靶點(diǎn)，選擇性地抑制其表達(dá)可能有利于治療多種急慢性疾病[17]。糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的最有效的藥物，具有抑制炎癥因子釋放的作用，在臨床上廣泛使用[18-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地塞米松組血PMN NOD2 mRNA的表達(dá)水平低于哮喘組，且NALP1 mRNA的表達(dá)量高于哮喘組，提示地塞米松具有下調(diào)NOD2 mRNA的表達(dá)和上調(diào)NALP1 mRNA的表達(dá)，從而起到減輕哮喘炎癥的作用。

綜上，哮喘大鼠血PMN NOD2 mRNA的表達(dá)升高，NALP1 mRNA的表達(dá)則相反，地塞米松具有調(diào)節(jié)模式識(shí)別受體的作用。

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（收稿日期：2016-07-05）