朱葛麗+臧淑妃+婁國(guó)強(qiáng)+施軍平

[摘要] 目的 探討5-脂氧化酶（5-LO）通路在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的作用。 方法 將4周齡ApoE-/-雄性小鼠16只隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（普通飼料）、NASH模型組（高脂高膽固醇飼料）。連續(xù)喂養(yǎng)12周后，肝組織油紅染色觀察脂肪變，采用HE染色進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度評(píng)分（NAFLD activity score，NAS）。熒光定量RT-PCR檢測(cè)5-LO、BLT1等mRNA表達(dá)，Western Bot法檢測(cè)5-LO蛋白，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)肝臟白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）。 結(jié)果 高脂高膽固醇飲食12周能誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠出現(xiàn)NASH表現(xiàn)，建模成功。NASH模型組較對(duì)照組肝組織5-LO mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01），肝勻漿LTB4水平[（71.09±18.23）pg/mL vs （46.71±11.71） pg/mL]升高（P<0.01），其受體BLT1 mRNA水平顯著升高（P<0.01），中性粒細(xì)胞趨化因子和相應(yīng)受體MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高（P<0.01）。 結(jié)論 5-LO炎癥通路通過上調(diào)中性粒細(xì)胞粘附浸潤(rùn)相關(guān)因子，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 5-脂氧化酶；脂肪性肝炎；非酒精性；中性粒細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R575 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）28-0035-04

隨著人們飲食和生活方式的改變，與肥胖和代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）相關(guān)的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）發(fā)病率逐年攀升，在普通人群中發(fā)病率達(dá)30%以上，而在肥胖個(gè)體中甚至達(dá)到80%以上，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。既往研究表明，肝小葉內(nèi)中性粒細(xì)胞[neutrophil，也稱多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）]浸潤(rùn)是NASH早期的特征性病理改變[2]，但經(jīng)典TLR4 致炎信號(hào)通路激活不能完全解釋其發(fā)病。新近研究顯示，5-LO炎癥通路異常激活在MetS相關(guān)疾病包括肥胖、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中參與系統(tǒng)性慢性低度炎癥的形成[3，4]，敲除5-LO 或BLT1 基因可使小鼠異常代謝表型明顯減輕[5，6]；但目前相關(guān)研究更多集中在外周脂肪組織，這條致炎通路在NASH早期肝小葉內(nèi)PMNs 浸潤(rùn)過程中作用如何有待進(jìn)一步研究。本研究利用ApoE基因敲除（ApoE-/-）的高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)NASH小鼠模型，觀察該通路異常在NASH早期肝小葉內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)過程中的可能作用。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立及取材

SPF級(jí)4周齡C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠16只（購(gòu)于南京大學(xué)國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫），飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)均分為兩組：對(duì)照組（n=8）予普通飼料喂養(yǎng)； NASH模型組（n=8）予高脂高膽固醇飼料（D12079B，Reasearch Diet，美國(guó)）喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)12周后處死動(dòng)物，常規(guī)采集血清標(biāo)本，由肝左葉固定部位取材，制備肝臟石蠟切片和冰凍切片，其余肝組織-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。本研究獲杭州師范大學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2肝臟病理學(xué)檢查

肝臟冰凍切片行油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂肪變，石蠟切片HE染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度、氣球樣變、小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥程度以計(jì)算NAFLD活動(dòng)度計(jì)分（NAFLD activity score，NAS）。

1.3 熒光定量RT-PCR

取適量肝組織，Trizol法提取總RNA，取總RNA 2 μg采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche）合成cDNA，再將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μL在熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以18S為內(nèi)參，以2-ΔΔCT比較相關(guān)基因的表達(dá)水平，各基因引物見表1。

1.4 Western Blot

取適量肝組織用RIPA裂解液裂解，上清液行蛋白濃度測(cè)定后，將等量樣品加入5X蛋白上樣緩沖液，95℃ 5 min變性。各組蛋白上樣50 μg，用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，按1∶1 000 加入兔抗小鼠5-LO（Abcam）一抗及兔抗小鼠β-actin（CST）一抗，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3次。按1∶5000加入山羊抗兔IgG（Abcam）二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析。

1.5肝組織LTB4檢測(cè)

取肝組織15 mg加入生理鹽水500 μL進(jìn)行勻漿，采用SPE（C-18）柱形筒（CAYMAN）萃取待檢液，根據(jù)ELISA試劑盒（CAYMAN）說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)變化

油紅O染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠肝組織無明顯脂肪變，NASH模型組則出現(xiàn)明顯脂肪變。HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組肝臟肝小葉及門管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯脂肪變、氣球樣變以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；NASH模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性脂肪變及不同程度氣球樣變，肝小葉內(nèi)有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)算NAS積分為3～7分，其中75%>4分達(dá)到NASH診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2肝組織中5-LO/BLT1及相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)水平

NASH模型組肝組織中5-LO以及BLT1 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高（P<0.01），同時(shí)NASH模型組中性粒細(xì)胞趨化因子和相應(yīng)受體MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高（P<0.01），見圖1。

2.3肝組織中5-LO、BLT1 mRNA表達(dá)水平與NAS積分的相關(guān)性分析

對(duì)NASH模型組肝組織中5-LO以及BLT1 mRNA的表達(dá)水平與NAS積分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明：5-LO mRNA的表達(dá)水平與NAS積分呈正相關(guān)（r=0.891，P<0.01）；BLT1 mRNA的表達(dá)水平與NAS積分呈正相關(guān)（r=0.889，P<0.01）。

2.4 肝組織5-LO蛋白表達(dá)水平

NASH模型組肝組織中5-LO的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高（圖2）。

2.5肝組織LTB4水平

NASH模型組肝組織中LTB4水平為（71.09±18.23）pg/mL，較對(duì)照組的（46.71±11.71）pg/mL明顯升高（t=-3.18，P<0.01）。

3 討論

本研究用ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠輔以高脂高膽固醇飲食，模擬現(xiàn)代流行的飲食習(xí)慣，建立非酒精性脂肪性肝炎的動(dòng)物模型。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該模型同時(shí)伴隨著血糖升高、胰島素抵抗，合并肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂等，符合人類NASH發(fā)病過程。與前期結(jié)果一致，ApoE-/-小鼠高脂高膽固醇飲食12周能成功建立NASH模型。

中性粒細(xì)胞是外周血中數(shù)量最多的白細(xì)胞，作為最早到達(dá)炎癥部位的免疫細(xì)胞，參與構(gòu)成機(jī)體的第一道防線。來自本課題組以及國(guó)外研究均發(fā)現(xiàn)NASH早期肝小葉內(nèi)存在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)這一特征性病理變化[7，8]。近年研究一致認(rèn)為，以模式識(shí)別受體Toll 樣受體（TLRs）和庫普弗細(xì)胞（KC）為主介導(dǎo)的天然免疫異常介導(dǎo)了肝臟炎癥的發(fā)生：脂肪變的肝細(xì)胞在脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物所誘導(dǎo)的脂毒性、氧應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多重刺激下釋放損傷相關(guān)危險(xiǎn)信號(hào)，激活KCs、肝星狀細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)的TLRs，招募炎癥細(xì)胞并放大肝臟炎癥[9，10]。但上述經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制并不能解釋肝小葉內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)這個(gè)NASH 早期的特征性病理改變。在不同飲食配方誘導(dǎo)的TLR4和TLR9基因敲除小鼠NASH 模型中，僅能一定程度減輕肝臟損傷但不足以完全抑制肝臟炎癥的發(fā)生[11，12]，提示盡管TLRs信號(hào)介導(dǎo)炎癥放大過程，但在早期的炎癥啟動(dòng)階段可能存在著更為重要的非TLRs 依賴的炎癥激活途徑。

白三稀是一種經(jīng)典的促炎性脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物，由必需脂肪酸n-6多不飽和脂肪酸（PUFA）轉(zhuǎn)化生成的花生四烯酸（AA）在5-LO催化下形成，然后經(jīng)高親和力受體BLT1和低親和力受體BLT2表達(dá)廣譜和高效的致炎效應(yīng)包括釋放趨化因子、招募PMNs、淋巴細(xì)胞等，其中5-LO、LTB4 和BLT1作為核心信號(hào)分子介導(dǎo)炎癥觸發(fā)和放大過程[13，14]。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)予小鼠高脂飲食后，在肝臟和肌肉中LTB4 表達(dá)增加[15]。本研究也觀察到NASH模型組肝臟LTB4分泌增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其催化酶5-LO在mRNA及蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組升高，其受體BLT1水平顯著升高，進(jìn)一步分析5-LO、BLT1 mRNA表達(dá)量與NAS積分的相關(guān)性，結(jié)果示隨著肝臟脂肪變以及炎癥的進(jìn)展，5-LO、BLT1mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)。最近的研究顯示高脂血癥可通過調(diào)節(jié)5-LO促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生LTB4，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[16]。因此，脂代謝異常導(dǎo)致的5-LO致炎信號(hào)通路可能在NASH早期炎癥啟動(dòng)尤其是特征性的肝小葉內(nèi)PMNs 浸潤(rùn)過程中起了重要作用，可能主要由失衡的PUFAs 中間代謝產(chǎn)物為此炎癥過程提供了某種觸發(fā)或放大信號(hào)。

外周血液中的少量哨兵PMNs 在感知特異性危險(xiǎn)信號(hào)后可被相應(yīng)部位內(nèi)皮細(xì)胞捕獲、阻滯、粘附并跨越內(nèi)皮細(xì)胞遷移至炎癥部位，同時(shí)迅速促進(jìn)其他PMNs向損傷組織大量浸潤(rùn)。既往研究表明，組織損傷后，中性粒細(xì)胞立即釋放脂質(zhì)介質(zhì)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞進(jìn)一步激活，激活的中性粒細(xì)胞進(jìn)一步釋放趨化因子和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大，一步激活和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大，通過正反饋性的調(diào)節(jié)引起炎癥瀑布[17]。在炎癥性疾病比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和過敏性哮喘疾病中，釋放的LTB4通過激活中性粒細(xì)胞LTB4受體BLT1招募更多的中性粒細(xì)胞，BLT1/中性粒細(xì)胞進(jìn)一步激活釋放IL-1，其次誘導(dǎo)細(xì)胞釋放CCR1、CXCR2配體，中性粒細(xì)胞的招募被趨化因子極大的放大[18，19]。本研究中觀察到NASH模型組中性粒細(xì)胞趨化因子和相應(yīng)受體MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高，提示5-LO炎癥通路通過脂質(zhì)-細(xì)胞因子-趨化因子軸調(diào)控炎癥反應(yīng)過程，并作為初始信號(hào)觸發(fā)后續(xù)細(xì)胞因子、趨化因子的釋放而參與中性粒細(xì)胞或混合性炎癥細(xì)胞招募和最終免疫效應(yīng)的實(shí)現(xiàn)[20]。

本研究顯示，肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常激活5-LO炎癥通路，LTB4合成增加，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化因子、粘附分子釋放，招募中性粒細(xì)胞向炎癥部位浸潤(rùn)和觸發(fā)后續(xù)炎癥反應(yīng)，造成組織損傷。肝臟5-LO、BLT1與NAS積分顯著正相關(guān)，提示5-LO炎癥通路在NASH的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。為明確5-LO炎癥通路在NASH中的作用，本課題組將進(jìn)一步利用藥物阻斷該炎癥通路，為研究治療NASH新的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2016-06-17）