李 毅 余怡文 關(guān) 運(yùn) 姜姝君 徐玉音 趙仲華 張志剛△

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院2010級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032)

megsin干擾質(zhì)粒對(duì)大鼠Thy1腎炎病變的拮抗作用

李 毅1余怡文1關(guān) 運(yùn)1姜姝君1徐玉音2趙仲華2張志剛2△

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院2010級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系 上海 200032;2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032)

目的 應(yīng)用大鼠Thy1腎炎模型體外輸入megsin siRNA干擾質(zhì)粒,觀察下調(diào)megsin表達(dá)后對(duì)大鼠腎炎中腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生的抑制作用。方法 雄性SD大鼠共9只,隨機(jī)等分為對(duì)照組(A組),Thy1腎炎模型組(B組)和質(zhì)粒組(C組)。C組為腎炎模型加腎動(dòng)脈注射megsin siRNA 質(zhì)粒,并輔以電穿孔技術(shù)促進(jìn)質(zhì)粒浸入腎臟。腎臟標(biāo)本行real-time PCR、HE染色、PAS染色和megsin、PCNA的免疫組化染色。結(jié)果 與對(duì)照組比較,HE染色結(jié)果可見B組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生伴基質(zhì)增多,而C組腎小球細(xì)胞數(shù)量明顯少于B組,但多于A組;PAS染色可見B組腎小球系膜區(qū)基質(zhì)大量增多,呈節(jié)段性分布,C組則與之相比基質(zhì)增生減少;RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示B組腎小球中megsin mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高,與A組相比兩指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 而在C組megsin mRNA和蛋白質(zhì)水平又明顯下降, 與A、B組相比兩指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核平均數(shù)A組為3個(gè),B組14.79個(gè),而C組僅為6.94個(gè)。統(tǒng)計(jì)顯示B組和A組、B組和C組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001 )。結(jié)論 注射megsin干擾質(zhì)粒以后,系膜細(xì)胞、基質(zhì)的增生均受到抑制,腎炎病變減輕,提示megsin干擾質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染具有拮抗大鼠Thy1腎炎的作用,這為探索以系膜細(xì)胞增生為特征的腎臟疾病的防治提供了新的思路和依據(jù)。

megsin干擾質(zhì)粒; Thy1腎炎; 系膜細(xì)胞增生; 大鼠

腎小球腎炎是臨床的常見疾病,腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)的增生是多種腎炎的基本病理特點(diǎn),病變隨病程進(jìn)展可發(fā)生腎小球硬化,腎濾過功能下降,最終發(fā)展為腎功能衰竭。

megsin基因是近來發(fā)現(xiàn)的腎小球系膜細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因[1],在正常腎小球內(nèi)表達(dá)微弱。研究發(fā)現(xiàn)megsin表達(dá)的上調(diào)可以促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)的異常增生[2],在系膜增生性腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用,如IgA腎病及糖尿病腎病[3-5]。研究顯示megsin的作用可能與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、-9下降及纖溶酶活性降低有關(guān)[5]。因此,megsin表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)炎性因子刺激腎小球基質(zhì)增生,抑制基質(zhì)降解并沉積在系膜區(qū),加速腎炎發(fā)展。

本文通過輸入外源megsin siRNA質(zhì)粒,抑制大鼠腎小球內(nèi)megsin基因表達(dá),探討其對(duì)大鼠抗Thy1腎炎模型(系膜增生性腎炎)的病理影響。期望動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明下調(diào)megsin基因表達(dá),可減輕腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)的增生,為系膜增生性腎小球腎炎的治療提供新靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

megsin siRNA干擾質(zhì)粒 megsin siRNA(含GFP標(biāo)簽)質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Santa cruz生物技術(shù)公司[megsin siRNA (h):sc-75768],內(nèi)插入針對(duì)megsin序列的兩條寡核苷酸鏈:上游:5’-GATCCGCAAGG-AAACTCATCTAATATAGTGCTCCTGGTTGT-ATTAGATGAGTTTCCTTGCTTTTTTA-3’,下游:5’-AGCTTAAAAAAGCAAGGAAACTCAT-CTAATACAACCAGGAGCACTATATTAGATG-AGTTTCCTTGCG-3’;按常規(guī)步驟經(jīng)質(zhì)粒擴(kuò)增及抽提, 并用限制性內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定, 收集備用。

動(dòng)物腎炎模型 取健康成年雄性SD大鼠共9只,隨機(jī)等分為A組(對(duì)照組),B組(模型組)和C組(質(zhì)粒組)。其中B組尾靜脈注抗胸腺素抗體(cox-7)50μg,cox-7緩沖液1 mL(500μL cox-7+500 μL PBS),C組為注射質(zhì)粒干擾組,動(dòng)物同B組處理后,第2天在消毒無菌狀態(tài)下,水合氯醛麻醉,打開腹腔,鈍性分離左側(cè)腎臟、左腎動(dòng)靜脈,對(duì)腹主動(dòng)脈和左腎靜脈進(jìn)行鉗夾,同時(shí)經(jīng)左側(cè)腎動(dòng)脈注射siRNA 200μg megsin siRNA 質(zhì)粒(見上);待腎皮質(zhì)充盈變白時(shí),腎臟旁放電脈沖儀電極板(WJ-2005寧波新芝生物科技股份有限公司),用100 V電極刺激(每次時(shí)長(zhǎng)100 ms,共5次)。操作完成后迅速打開鉗夾,保證腎血流及時(shí)恢復(fù),防止單側(cè)腎缺血壞死,然后縫合腹壁傷口。3組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)到第5天末處死,取雙側(cè)腎臟皮質(zhì)制作冰凍切片和石蠟切片,用于HE染色、免疫組化及免疫熒光等檢測(cè)。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究和喂養(yǎng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和程序, 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

免疫組化 檢測(cè)megsin 、PCNA的變化,上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各組大鼠腎組織石蠟切片,厚4 μm,常規(guī)脫蠟水化,經(jīng)去除內(nèi)源性過氧化物酶和檸檬酸鈉緩沖液微波加熱10 min抗原修復(fù),用1∶20羊抗兔血清進(jìn)行正常血清封閉。隨后分別加抗Thy1抗體1∶100、抗PCNA抗體1∶100,37 ℃放置1 h,4 ℃過夜。次日加二抗(兔抗),DAB顯色,蘇木精復(fù)染。

腎組織冰凍切片免疫熒光染色 選擇各組動(dòng)物腎皮質(zhì)冰凍切片,羊血清37 ℃封閉20 min。加抗兔抗綠色熒光EGFP抗體1∶500,在37 ℃孵育1 h。4 ℃冰箱過夜。第2天加熒光二抗,37 ℃保溫30 min。甘油封片。熒光顯微鏡下觀測(cè)。

PAS染色 為檢測(cè)各組腎組織的腎小球中細(xì)胞外基質(zhì)的改變和分布, 應(yīng)用PAS染色顯示腎小球中的基質(zhì)。石蠟切片石蠟切片脫蠟水化,過碘酸酒清液10 min,自來水沖洗,Schiff氏液10 min, 流水沖洗,透明封片。

real-time PCR 檢測(cè) 運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)組織中的megsin mRNA表達(dá)。收集上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各組大鼠腎皮質(zhì)米粒大組織,放入去核酶試管中 ,加入預(yù)冷的Trizol,提取各組組織的總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成樣本cDNA 50 μL,以ACTIN為內(nèi)參;PCR反應(yīng)體系包括:real-time PCR MIX 32 μL ,上游、下游引物各2 μL, 探針1 μL, cDNA模版2 μL, ddH2O 13 μL。 PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 20 s, 循環(huán)40次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 RT-PCR各組結(jié)果分別做組間t檢驗(yàn)比較統(tǒng)計(jì)分析。在上述megsin免疫組化染色和PAS染色切片中, 每例切片在100倍視野隨機(jī)選取20個(gè)腎小球, 用motic多光譜圖像分析系統(tǒng)測(cè)定免疫組化陽(yáng)性面積或PAS陽(yáng)性面積灰度OD值,然后換算出各組每個(gè)腎小球的OD均值和標(biāo)準(zhǔn)差, 做組間t檢驗(yàn)分析。在腎組織PCNA組化染色切片中,高倍鏡下每組(3例)中隨機(jī)抽取100個(gè)腎小球,計(jì)數(shù)每個(gè)小球中PCNA染色陽(yáng)性的數(shù),再換算為每組平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

大鼠腎組織冰凍切片免疫熒光結(jié)果 為確定腎動(dòng)脈注射megsin干擾質(zhì)粒的輸入效果,冰凍切片檢測(cè)抗GFP免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖1),對(duì)照組和模型組均為陰性,腎組織中僅隱約可見腎小球輪廓。而質(zhì)粒組腎小球中GFP亮綠色熒光陽(yáng)性明顯,說明質(zhì)粒成功進(jìn)入腎小球內(nèi)。

A:Control group;B:Model group; C:Plasmid group.

圖1 megsin干擾質(zhì)粒注射后大鼠腎組織GFP免疫熒光染色結(jié)果(×100)

Fig 1 GFP immunofluorescence staining in renal tissue after injection of megsin siRNA plasmid in rats (×100)

大鼠腎炎腎組織的megsin mRNA水平 經(jīng)real-time PCR檢測(cè),3組大鼠的組織mRNA 水平顯示,模型組的megsin mRNA 水平升高, 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),質(zhì)粒組比模型組明顯下降, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 同時(shí),質(zhì)粒組megsin mRNA 水平也比對(duì)照組低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

大鼠腎炎腎組織的megsin蛋白質(zhì)水平 3組大鼠腎組織抗megsin免疫組化染色結(jié)果顯示(圖3),對(duì)照組megsin基本陰性,模型組腎小球系膜區(qū)細(xì)胞的胞質(zhì)染色最明顯,細(xì)胞數(shù)目也相對(duì)較多,部分腎小管上皮也有陽(yáng)性染色。而質(zhì)粒組腎小球和腎小管也均有輕微染色,但比模型組減輕。表明模型組中腎小球系膜細(xì)胞megsin表達(dá)增強(qiáng),質(zhì)粒組中因基因受到干擾,表達(dá)比模型組要減少。腎小球內(nèi)陽(yáng)性面積灰度比OD值統(tǒng)計(jì)顯示,模型組與對(duì)照組的megsin 表達(dá)差異有顯著性意義(P<0.01);質(zhì)粒組的megsin 表達(dá)與模型組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 同時(shí)與對(duì)照組的表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖2 各組腎組織皮質(zhì)megsin mRNA 水平

Fig 2 The RNA levels of megsin in the renal tissue of each group

大鼠腎炎腎組織的病理改變 HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,模型組的腎小球系膜區(qū)細(xì)胞數(shù)量明顯增多,且基質(zhì)增多,說明系膜細(xì)胞激活增生,基質(zhì)合成沉積。質(zhì)粒組腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)均明顯少于模型組,但相比于對(duì)

照組的正常腎小球細(xì)胞數(shù)量仍有所增多(圖4)。

A:Control group;B:Model group;C:Plasmid group.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖3 腎組織megsin免疫組化檢測(cè)(×100)

Fig 3 Immunohistochemical detection of megsin in renal tissue (×100)

A:Control group; B;Model group; C:Plasmid group.

圖4 各組大鼠腎組織病理形態(tài) (×100)

Fig 4 Pathological morphology of rat glomeruli in each group (×100)

以上的結(jié)果表明,模型組經(jīng)COX-7尾靜脈注射,Thy1腎炎模型造模成功。而質(zhì)粒組大鼠腎動(dòng)脈注射shRNA質(zhì)粒后,對(duì)病變的腎小球中系膜細(xì)胞增生等病理現(xiàn)象產(chǎn)生了抑制,這說明megsin干擾質(zhì)?？梢援a(chǎn)生一定的拮抗腎炎發(fā)展的效果。

大鼠腎組織PAS染色結(jié)果 通過PAS染色,再進(jìn)一步觀察各組腎小球中基質(zhì)沉積的分布,結(jié)果顯示(圖5),對(duì)照組腎小球PAS陽(yáng)性基質(zhì)最少,模型組腎小球系膜區(qū)基質(zhì)大量增多,PAS陽(yáng)性呈節(jié)段性分布。腎小球內(nèi)PAS陽(yáng)性面積灰度OD值統(tǒng)計(jì)顯示,模型組與對(duì)照組的megsin 表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。質(zhì)粒組居于對(duì)照組與模型組之間,腎小球系膜區(qū)PAS陽(yáng)性比正常腎小球增多,但比模型組腎小球明顯減少。質(zhì)粒組的腎小球內(nèi)PAS陽(yáng)性面積灰度OD值與對(duì)照組和模型組的OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均< 0.05)。結(jié)果也表明質(zhì)粒干擾組中系膜基質(zhì)合成受到抑制。

大鼠腎炎腎組織PCNA免疫組化染色結(jié)果 在對(duì)照組腎小球內(nèi)細(xì)胞均為陰性,偶見少量腎小管上皮陽(yáng)性。模型組的腎小球中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,部分腎小管上皮也陽(yáng)性增多。質(zhì)粒組中腎小球PCNA陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于模型組,但相比于對(duì)照組的腎小球細(xì)胞數(shù)量仍有所增多(圖6)。通過對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞核定量和統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示(圖6):對(duì)照組PCNA陽(yáng)性均數(shù)/每小球 為3.00±2.31,模型組為14.79±3.53,質(zhì)粒組為6.94±3.36。組間差異t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示模型組與對(duì)照組、質(zhì)粒組與對(duì)照組、模型組與質(zhì)粒組均數(shù)之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001 )。結(jié)果表明經(jīng)注射質(zhì)粒的腎小球細(xì)胞增生受到抑制。

A:Control group;B;Model group; C:Plasmid group.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖5 大鼠腎小球PAS染色結(jié)果(×100)

Fig 5 Results of glomerular PAS staining in rats (×100)

A:Control group; B;Model group; C:Plasmid group.(1)P<0.001.

圖6 大鼠各組腎小球PCNA染色(×100)

Fig 6 PCNA staining of glomerular in rats (×100)

討 論

megsin基因是1997年Miyata等[1]在IgA腎病患者的腎小球系膜細(xì)胞中尋找優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的5種新的基因之一,亦稱serpin B7,是一種卵清蛋白樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。研究表明,megsin在正常人體內(nèi)表達(dá)較為微弱,在系膜增生性腎臟疾病(如IgA腎病、急性毛細(xì)血管內(nèi)增生腎炎、狼瘡性腎炎等)中的表達(dá)上調(diào),而在膜性腎病、微小病變病等不以系膜增生為主要特點(diǎn)的腎臟疾病中表達(dá)水平則無改變[ 3,6-7]。在megsin轉(zhuǎn)基因小鼠及糖尿病腎病大鼠模型中,megsin過表達(dá)可以促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)的異常增生[2,8]。因此megsin表達(dá)的上調(diào)與系膜細(xì)胞和基質(zhì)的增生存在正相關(guān)。進(jìn)一步的研究顯示,megsin表達(dá)的上調(diào)與MMP-2、MMP-9以及纖溶酶活性的下降有一定的相關(guān)性[5,9]。纖溶酶是纖維蛋白降解系統(tǒng)中一種重要的絲氨酸蛋白酶,在系膜基質(zhì)重塑過程中,它可以直接降解某些系膜細(xì)胞成分或通過誘導(dǎo)活化MMP來間接導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解。而megsin可以與纖溶酶共價(jià)結(jié)合以抑制其活性,從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解。使腎炎中因炎性因子刺激而增生的基質(zhì)沉積在系膜區(qū),促進(jìn)腎炎的發(fā)展。

Liu等[10]在糖尿病腎病研究中,利用megsin的siRNA在體內(nèi)外試驗(yàn)中證明基因干擾質(zhì)?？梢种芐TZ小鼠的蛋白尿,腎小球內(nèi)p27表達(dá)下調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致系膜細(xì)胞增生受抑制及IV型膠原沉積減少。顯示動(dòng)物體外注射相關(guān)基因干擾質(zhì)粒也有一定的治療效果。李光明等[11]在CCL4誘導(dǎo)的大鼠纖維化模型的門靜脈內(nèi)注射結(jié)締組織生長(zhǎng)因子siRNA質(zhì)粒,結(jié)果使肝內(nèi)CTGF表達(dá)明顯下降,肝組織炎癥、壞死減少,可明顯抑制肝纖維化進(jìn)程。此外,Takabatake等[12]為了增強(qiáng)外源性質(zhì)粒浸入腎組織,在腎動(dòng)脈注射EGFP的siRNA質(zhì)粒到EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi)時(shí),并加電穿孔輔助,成功增強(qiáng)了質(zhì)粒的浸入腎組織,抑制了腎小球內(nèi)EGFP的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Takabatake等[12]的方法,在大鼠Thy1腎炎模型中,通過大鼠腎動(dòng)脈注射外源性megsin基因干擾質(zhì)粒,及輔以電穿孔增強(qiáng)模式,結(jié)果顯示干擾質(zhì)粒成功進(jìn)入大鼠腎小球內(nèi),并導(dǎo)致腎組織中megsin mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均下降,同時(shí)Thy1腎炎模型中腎小球系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)沉積均有明顯減輕,病理改變有改善。本研究提示下調(diào)megsin的表達(dá)可以減輕腎小球系膜細(xì)胞與基質(zhì)的增生,為探索以腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生為特征的腎臟疾病的防治提供了新的思路和依據(jù)。

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The antagonistic effect of megsin siRNA plasmid on Thy1 glomurelonephritis in rats

LI Yi1, YU Yi-wen1, GUAN Yun1, JIANG Shu-jun1, XU Yu-yin2, ZHAO Zhong-hua2, ZHANG Zhi-gang2△

(1Grade2010ofClinicalMedicine,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To investigate the effect of megsin siRNA plasmid on the proliferation of glomerular mesangial cells and matrix Thy1 glomerulonephritis in rats. Methods Nine male SD rats were equally and randomly divided into 3 groups:A group was control group;B group was Thy1 glomerulonephritis model group; C group was megsin siRNA plasmid group which was the Thy1 glomerulonephritis model with renal artery injection of megsin siRNA plasmid,supplemented by electroporation technology.Kidney specimens were examined by real-time PCR,HE staining,PAS staining,and immunohistochemistry staining for megsin and PCNA. Results Compared with the A group,the HE staining results showed that the glomerular mesangial cells significantly increased with the increase of matrix in B group,while the number of glomerular cells in the C group was significantly less than that in the B group,but little more than in the A group;PAS staining showed that the matrixof glomerular mesangial cells significantly increased and segmentally distribution in B group,while it was decreased in C group;the results of RT-PCR and immunohistochemistry analysis showed that the megsin mRNA and protein levels in glomeruli increased significantly in B group compared with A group (P<0.01),while both decreased significantly in C group compared with B group (P<0.01) and A group (P<0.05).The average number of PCNA positive nuclei was 3 in A group,14.79 in B group,while 6.94 in C group,respectively.Statistics showed that there were significantly different between the B group and A group (P<0.001),and B group and C group (P<0.001). Conclusions The proliferation of mesangial cells and matrix were inhibited after the injection of megsin siRNA plasmid and nephritis lesions reduced,which suggested thatinvitrotransfection of megsin siRNA plasmid in rat Thy1 nephritis model has antagonistic effect on glomerulonephritis.It provides a new idea to explore the treatment and prevention of renal diseases with mesangial cell proliferation.

megsin siRNA plasmid; Thy1 glomurelonephritis; proliferation of mesangial cell;rat

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金能力提高項(xiàng)目(J1210041)

R364.5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.01.012

2016-04-27;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:zzg@shmu.edu.cn

*This work was supported by the Project of Ability Improvement,National Basic Science Personnel Training Fund (J1210041).