劉靜 郭妍

PKA信號(hào)通路影響D-半乳糖誘導(dǎo)老化心肌細(xì)胞舒張功能障礙的機(jī)制

劉靜 郭妍

目的 探討D-半乳糖誘導(dǎo)老化的心肌細(xì)胞舒張功能障礙的機(jī)制。 方法 實(shí)驗(yàn)用藥物預(yù)處理后予以D-半乳糖建立鼠心肌細(xì)胞老化模型。分為4組:正常對(duì)照組(C組)、D-半乳糖組(D-G組)、cAMP依賴蛋白激酶A(PKA)預(yù)激動(dòng)組(D-G+cAMP組)和PKA預(yù)抑制組(D-G+H-89組);測(cè)定心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣攝取能力,肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA,心臟主要是SERCA2a)活性以及Western blot 檢測(cè)第16 位絲氨酸磷酸化受磷蛋白(Ser16phosphorylated phospholamban,Ser16-PLN)的含量。 結(jié)果 與C組相比,D-G組、D-G+H-89組舒張期鈣離子濃度[([Ca2+]i)D]升高,鈣離子回?cái)z時(shí)間(tβ)延長(zhǎng),給予咖啡因刺激后,鈣離子增幅(△[Ca2+]i)減少;細(xì)胞內(nèi)SERCA2a活性下降以及Ser16-PLN表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。 與D-G組相比，D-G-H-89組([Ca2+]i)D水平進(jìn)一步升高，tβ進(jìn)一步延長(zhǎng)，給予咖啡因刺激后，△[Ca2+]i明顯降低，SERCA2a活性下降，Ser16-PLN表達(dá)下調(diào)。而D-G+cAMP組([Ca2+]i)D水平明顯降低， tβ縮短，△[Ca2+]i增高，細(xì)胞內(nèi)SERCA2a明顯提高，Ser16-PLN表達(dá)增加。 結(jié)論 D-半乳糖可能是通過(guò)抑制PKA通路,下調(diào)Ser16-PLN的磷酸化水平,增加對(duì)SERCA2a活性的抑制,從而引起老化心肌細(xì)胞舒張功能障礙。

蛋白激酶A; Ser16-PLN； 肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶； 肌漿網(wǎng)鈣失調(diào); 心肌老化

舒張性心力衰竭(DHF)最常見(jiàn)于老年病人和糖尿病、高血壓、肥胖等人群。DHF的主要原因是心臟衰老,隨著年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致心臟泵功能的急劇下降,從而導(dǎo)致舒張功能障礙[1]。心肌細(xì)胞內(nèi)鈣失衡是心肌收縮舒張功能失調(diào)的共同原因。肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)是哺乳動(dòng)物心臟細(xì)胞內(nèi)最重要的儲(chǔ)存鈣庫(kù),參與心臟收縮舒張的鈣循環(huán)過(guò)程[2]。收縮期鈣釋放通道蘭諾丁受體(ryanodine receptor,RyR)將SR內(nèi)大量?jī)?chǔ)存Ca2+釋放進(jìn)入胞漿,舒張期心肌細(xì)胞在受磷蛋白(phospholamban,PLN)的調(diào)節(jié)下,肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+/-ATPase,SERCA)消耗ATP主動(dòng)將Ca2+攝入SR[3-5]。心肌細(xì)胞內(nèi)主要存在3條磷酸化通路調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能,分別是cAMP依賴蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase A,PKA) 、鈣-鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ (Ca2+-calmodulin dependent kinase Ⅱ, Ca2+-CaMKⅡ)及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 信號(hào)通路。其中前2種途徑被認(rèn)為占主要作用。PKA是一種cAMP依賴性蛋白激酶,當(dāng)cAMP含量增加時(shí),PKA 被激活并從第16 位絲氨酸(Ser16)磷酸化PLN,從而解除對(duì)SERCA2a 的抑制,增強(qiáng)SERCA2a 的活性,從而改善心肌舒張功能障礙[6]。

D-半乳糖衰老模型的原理是D-半乳糖與蛋白質(zhì)和肽中氨基酸的游離胺在體外和體內(nèi)反應(yīng),引發(fā)非酶糖基化反應(yīng),形成晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs),其反應(yīng)產(chǎn)物可進(jìn)一步誘導(dǎo)自由基損傷,放大非酶糖基化效應(yīng),從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒張功能減退[7]。我們前期的動(dòng)物模型已證實(shí)了這一過(guò)程,本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平,繼續(xù)以D-半乳糖誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞衰老模型,并給予PKA信號(hào)通路的激活劑和抑制劑干預(yù)該信號(hào)通路,通過(guò)觀察衰老心肌細(xì)胞SR鈣攝取功能以及Ser16磷酸化PLN蛋白的表達(dá),尋找D-半乳糖致心肌細(xì)胞衰老作用的胞內(nèi)上游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 SD乳大鼠(出生3 d內(nèi))由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCxK(蘇)20020031。D-半乳糖、咖啡因、牛血清白蛋白(Sigma);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青公司);Fura-2/AM(Invitrogen);細(xì)胞裂解液(碧云天公司,P0013B);H-89(LC Labs, Woburn, MA);cAMP(Santa Cruz,sc201564);兔抗鼠p-PLN(Ser16)抗體(abcam, ab15000 1:1000);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(abcam,ab6721 1:5000);蛋白Marker(Fermentas);PVDF膜(millipore);Supersignal West Pico-blot化學(xué)發(fā)光底物(ECL液)(Pierce)。

1.2 方法

1.2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng):乳大鼠心室肌細(xì)胞的培養(yǎng)參照Xu等[8]的方法,無(wú)菌條件下將出生1～3 d SD乳大鼠心臟取出,留取心室,充分剪碎,多次0.06%胰酶消化完全后,差速貼壁法去除大部分成纖維細(xì)胞,隨后用含20%新生牛血清及100 U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液將心肌細(xì)胞懸浮,以(3～4)×106/cm2接種于六孔板,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 48 h后可見(jiàn)心肌細(xì)胞成團(tuán)搏動(dòng)后待用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù):將培養(yǎng)48 h后的原代心肌細(xì)胞分為4組:正常對(duì)照組(C組),正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,未予任何干預(yù); D-半乳糖組(D-G組),正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,加入5 g/L D-半乳糖;PKA預(yù)激動(dòng)處理組(D-G+cAMP組),在D-半乳糖誘導(dǎo)老化前2 h加入終濃度為1 μmol/L的PKA激動(dòng)劑cAMP; PKA預(yù)抑制處理組(D-G+H-89組),在D-半乳糖誘導(dǎo)老化前2 h加入終濃度為10 μmol/L的PKA抑制劑H-89;各組處理完后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3 Fura-2/AM熒光測(cè)定心肌細(xì)胞SR游離鈣離子濃度:SR鈣負(fù)荷Fura-2/AM 熒光測(cè)定[Ca2+]i的方法和濃度計(jì)算參照文獻(xiàn)[9]。在激光共聚焦培養(yǎng)皿中,用Fura-2/AM熒光37 ℃孵育心肌細(xì)胞30 min后,選擇搏動(dòng)的心肌細(xì)胞,由圖像放大的CCD(TILL成像系統(tǒng),德國(guó))采集細(xì)胞的熒光圖像,并傳送到計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)(Imaging Software Till 4.0)。測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)340 nm與380 nm時(shí)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度值,該比率(F340/380)被用來(lái)表示細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i,同時(shí)扣除背景的影響。繼續(xù)用Fura-2/AM熒光37 ℃孵育另一批心肌細(xì)胞30 min后,選擇搏動(dòng)的心肌細(xì)胞,在共聚焦培養(yǎng)皿中,快速加入10 mmol/L咖啡因5 μl,測(cè)定[Ca2+]i。

([Ca2+]i)D為舒張期細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i(基線的平均值);SR鈣回?cái)z時(shí)間tβ為[Ca2+]i由峰值下降至基線所需的時(shí)間,([Ca2+]i)B為加入咖啡因10 mmol/L前[Ca2+]i的平均值;([Ca2+]i)max為加入咖啡因后[Ca2+]i的最高值,△[Ca2+]i(%)=[([Ca2+]i)max-([Ca2+]i)B]/([Ca2+]i)B×100%。至少有3批獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),每批實(shí)驗(yàn)至少測(cè)量20個(gè)單個(gè)細(xì)胞。

1.2.4 SERCA2a 活性檢測(cè):SERCA2a 活性檢測(cè)采用改良的4-硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)法[10]。收集4組培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,加入4 ℃的勻漿緩沖液(20 mmol/L Hepes,2 mmol/L EDTA,250 mmol/L 蔗糖),12 000 r/min離心20 min 后收集上清進(jìn)行蛋白定量及SERCA2a活性檢測(cè)。10 μl上清液加入80 μl反應(yīng)體系(1.25 mmol/L MgCl2,0.00125% TritonX-100,0.125 mol/L KCl,1.25 mmol/L EGTA,10 mmol/L Hepes,含或不含1 mmol/L CaCl2)中,37 ℃孵育10 min 后加入100 mmol/L p-NPP 10 μl,再孵育30 min 后加入100 μl反應(yīng)終止液(500 mmol/L Tris,55 mmol/L EDTA),用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)405 nm 處閱讀反應(yīng)產(chǎn)生的4-硝基酚(p-NP)光密度值,并通過(guò)p-NP 標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。SERCA2a 活性用每分鐘每克蛋白產(chǎn)生的p-NP 的微摩爾數(shù)[μmol/(g·min)]表示。

1.2.5 Western blotting 檢測(cè)Ser16-PLN蛋白表達(dá)量:用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(上樣量為30 μg,30 mA恒流電泳),轉(zhuǎn)膜(200 mA恒流電轉(zhuǎn)),5%脫脂牛奶37 ℃搖床封閉2 h,一抗(Ser16-PLN)抗體1:1000, 37 ℃振動(dòng)反應(yīng)2 h,TBST緩沖液洗膜10 min×3次,二抗37 ℃搖床孵育2 h,TBST緩沖液洗膜10 min×3次,ECL發(fā)光液5 min,曝光。UVI自動(dòng)成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)掃描采集圖像,Gel-Pro Analyzer 軟件分析Ser16-PLN蛋白和內(nèi)參GAPDH的顯色灰度比值,半定量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖誘導(dǎo)老化的心肌細(xì)胞SR鈣攝取能力 與正常對(duì)照組比較,D-G組、D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平明顯升高,tβ明顯延長(zhǎng),再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組無(wú)明顯差異;與D-G組比較,D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平進(jìn)一步升高,tβ進(jìn)一步延長(zhǎng),再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組([Ca2+]i)D水平明顯降低,tβ明顯縮短,咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯增高,說(shuō)明D-半乳糖可通過(guò)抑制PKA信號(hào)通路,使舒張期心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載,肌漿網(wǎng)攝取鈣能力及鈣離子儲(chǔ)備能力顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 心肌細(xì)胞舒張期鈣離子濃度、鈣離子回?cái)z時(shí)間及鈣瞬變?cè)龇?/p>

注:與C組比較,*P<0.05;與D-G組比較,△P<0.05

2.2 D-半乳糖誘導(dǎo)老化的心肌細(xì)胞SERCA2a活性 與C組比較,D-G組、D-G+H-89組SERCA2a 活性均明顯降低,D-G+cAMP組無(wú)明顯差異;與D-G組比較,D-G+H-89組SERCA2a 活性進(jìn)一步降低,D-G+cAMP組SERCA2a明顯提高(P<0.05),見(jiàn)圖1。

注:與C組比較,*P<0.05;與D-G組比較,△P<0.05圖1 心肌細(xì)胞SERCA2a 活性檢測(cè)(n=5)

2.3 D-半乳糖對(duì)心肌細(xì)胞Ser16-PLN蛋白表達(dá)的影響 與C組比較,D-G組、D-G+H-89組Ser16-PLN蛋白表達(dá)量分別下降約54%和65%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與D-G+cAMP組比較,D-G、D-G+H-89組Ser16-PLN蛋白表達(dá)量分別下調(diào)51%和63%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖2。

A:Ser16-PLN 及GAPDH 蛋白Western blot 檢測(cè)條帶;B:Ser16-PLN 蛋白半定量結(jié)果注:與C組比較,*P<0.05;與D-G+cAMP組比較,△P<0.05圖2 心肌細(xì)胞Ser16-PLN 蛋白表達(dá)變化(n=5)

3 討論

目前心肌細(xì)胞老化機(jī)制尚未完全闡明, 但可能與非酶糖基化反應(yīng)有關(guān)。非酶糖基化反應(yīng)是還原糖和生物大分子在沒(méi)有酶參與的條件下自發(fā)地與葡萄糖及其它還原糖反應(yīng),形成早期糖基化產(chǎn)物,再進(jìn)一步反應(yīng)生成AGEs[11]。有研究報(bào)道,AGEs增多可通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)鈣平衡、活化信號(hào)轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)錄激活子及信號(hào)通路等作用促使心肌細(xì)胞老化[12]。D-半乳糖是一種還原糖,我國(guó)學(xué)者王琳早在2005年就用D-半乳糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老并成功建立離體心肌細(xì)胞的衰老模型[13]。本課題組在前期細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中已證實(shí),D-半乳糖組的AGEs含量比正常對(duì)照組增加了7倍,提示D-半乳糖誘導(dǎo)可促進(jìn)心肌細(xì)胞的非酶糖基化反應(yīng),從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞衰老。課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),老化組的鈣攝取能力明顯下降,說(shuō)明老化的心肌細(xì)胞SR受到一定程度的損壞,且機(jī)制可能與下調(diào)SERCA2a 的活性及表達(dá)有關(guān)[14],但尚無(wú)關(guān)于SERCA2a 上游調(diào)控機(jī)制的研究。因PKA信號(hào)通路可以通過(guò)Ser16磷酸化PLN,進(jìn)而增強(qiáng)SERCA2a 的功能,故本研究欲證實(shí)D-半乳糖是否是通過(guò)PKA信號(hào)途徑調(diào)控SERCA2a,導(dǎo)致SR鈣攝取能力降低,進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞舒張功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)D-半乳糖建立心肌細(xì)胞老化模型,探討在D-半乳糖致衰老心肌細(xì)胞舒張功能障礙中PKA信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與C組相比,D-G組、D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平明顯升高,tβ明顯延長(zhǎng),再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組無(wú)明顯差異;與D-G組相比,D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平進(jìn)一步升高,tβ進(jìn)一步延長(zhǎng),再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組([Ca2+]i)D水平明顯降低,tβ明顯縮短,咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯增高。這與Petrova等[15]在過(guò)度表達(dá)RAGE的轉(zhuǎn)基因小鼠模型上的發(fā)現(xiàn)有一致性,而我們的實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實(shí)了老化心肌細(xì)胞可通過(guò)抑制PKA信號(hào)通路,使SR鈣攝取能力及鈣離子儲(chǔ)備能力顯著降低,SR受到一定程度的損壞。

接著,我們進(jìn)一步檢測(cè)SERCA2a的活性及PLN的磷酸化信號(hào)通路,選擇PLN最主要的磷酸化位點(diǎn)Ser16,利用特異性磷酸化位點(diǎn)的抗體,計(jì)算磷酸化PLN的蛋白含量。我們發(fā)現(xiàn),與C組相比, D-G組、D-G+H-89組SERCA2a 活性和Ser16-PLN蛋白表達(dá)量均明顯降低,而D-G+cAMP組明顯提高D-半乳糖降低的心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a的活性和Ser16-PLN蛋白表達(dá)量。由此,我們可以初步得出結(jié)論:PKA信號(hào)通路是參與心肌老化的一個(gè)重要過(guò)程,主要是通過(guò)抑制ser16-PLN的磷酸化水平,調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白SERCA2a的活性來(lái)影響心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的分布,從而影響心肌細(xì)胞靜息張力,導(dǎo)致心肌舒張功能障礙。

當(dāng)然,我們的研究尚存在一些不足之處,例如D-半乳糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞老化模型中可能除調(diào)節(jié)SERCA活性、抑制ser16-PLN的磷酸化水平之外還有其他作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確;此外,PLN存在3個(gè)磷酸化位點(diǎn):Ser10(受PKC信號(hào)通路調(diào)節(jié)),Ser16(受PKA信號(hào)通路調(diào)節(jié))和Thr17(受CaMKII信號(hào)通路調(diào)節(jié)),是否還可能通過(guò)CaMKⅡ或者PKC通路導(dǎo)老化致心肌舒張功能障礙有待進(jìn)一步研究[16]。

[1] SilbermanGA, Fan TH, Liu H, et al. Uncoupled cardiac nitric oxide synthase mediates diastolic dysfunction[J]. Circulation, 2010,121(4): 519-528.

[2] Xin W, Li X, Lu X, et al. Improved cardiac function after sarcoplasmic reticulum Ca (2+)-ATPase gene transfer in a heart failure model induced by chronic myocardial ischaemia[J]. Acta cardiol, 2011, 66(1): 57-64.

[3] Bers DM. Altered cardiac myocyte Ca regulation in heart failure[J]. Physiology (Bethesda), 2006, 21: 380-387.

[4] Kranias EG, Hajjar RJ. Modulation of cardiac contractility by the phospholamban/SERCA2a regulatome[J].Circ Res. 2012, 110(12):1646-1660.

[5] Periasamy M, Bhupathy P, Babu GJ. Regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase pump expression and its relevance to cardiac muscle physiology and pathology[J]. Cardiovasc Res, 2008, 77(2): 265-273.

[7] Song X,Bao M,Li D, et al.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model[J]. Mech Ageing Dev,1999, 108(3): 239-251.

[8] Xu XL, Chen XJ, Ji H, et al. Astragaloside Ⅳ improved intracellular calcium handling in hypoxia-reoxygenated cardiomyocytes via the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase[J]. Pharmacology, 2008, 81(4): 325-332.

[9] Nielsen JM, Kristiansen SB, N?rregaard R, et al. Blockage of receptor for advanced glycation end products prevents development of cardiac dysfunction in db/db type 2 diabetic mice[J]. Eur J Heart Fail, 2009, 11(7): 638-647.

[10]Krüger M, Linke WA.Titin-based mechanical signalling in normal and failing myocardium[J]. J Mol Cell Cardiol, 2009, 46(4): 490-498.

[11]Chen Y, Zhao CT, Zhen Z, et al. Association of myocardial dysfunction with vitamin D deficiency in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. J Diabetes Complications, 2014, 28(3):286-290.

[12]Czuriga D, Paulus WJ, Czuriga I, et al. Cellular mechanisms for diastolic dysfunction in the human heart[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2012, 13(13): 2532-2538.

[13]王琳,丁秀云, 劉漠熔,等. D-半乳糖對(duì)幼鼠心肌細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)[J]. 中國(guó)臨床康復(fù), 2005, 9(39):25-27.

[14]劉靜, 郭妍,陳相健. 銀杏葉提取物對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞老化的肌漿網(wǎng)鈣攝取及 SERCA 活性的影響[J]. 江蘇醫(yī)藥, 2011, 37(8): 869-872.

[15]Petrova R, Yamamoto Y, Muraki K, et al. Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2002, 34(10): 1425-1431.

[16]Mazzocchi G, Sommese L, Palomeque J, et al. Phospholamban ablation rescues the enhanced propensity to arrhythmias of mice with CaMKII-constitutive phosphorylation of RyR2 at site S2814[J]. J Physiol, 2016, 594(11):3005-3030.

Mechanism of aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes induced by D-galactose via PKA pathway

LIUJing.

DepartmentofCardiology;

GUOYan.

DepartmentofGeriatrics;theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the mechanism of aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes induced by D-galactose. Methods Aging cardiomyocytes model was established by D-galactose after medication pretreatment. The cardiomyocytes were divided into four groups: normal group (group C), D-galactose group (D-G group), cAMP-dependent protein kniase A(PKA) pre-agonist group (D-G+cAMP group) and PKA pre-inhibit group (D-G+H-89 group). Cardiac sarcoplasmic reticulum calcium uptake ability of sarcoplasmic reticulum(SR), myocardial SERCA2a activity and Ser16phosphorylated phospholamban(Ser16-PLN)protein expression level were detected respectively. Results Compared with group C, increased diastolic [Ca2+]i, curtailment of the time from the maximum concentration of Ca2+to the baseline level and decreased reuptake of Ca2+stores in the SR were observed in D-G group and D-G+H-89 group. In addition, the levels of Ser16-PLN protein as well as SERCA2a activity were significantly decreased (P<0.05).Compared with D-G group, the levels of diastolic [Ca2+]iincreased, the time from the maximum concentration of Ca2+to the baseline level prolonged in D-G-89 group; The levels of diastolic[Ca2+]idecreased, the time from the maximum concentration of Ca2+to the baseline level shortened in D-G+cAMP group. After stimulated by caffeine, reuptake of Ca2+, the level of SERCA2a and Ser16-PLN deeereased in D-G-H-89 group and increased in D-G-cAMP group. Conclusions D-galactose can induce aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes through inhibiting PKA pathway, decreasing the amount of Ser16-PLN phosphorylation, and further inhibiting SERCA2a activity.

protein kinase A; Ser16-phosphorylated phospholamban; sarcoplasmic reticulum calcium ATPase; calcium homeostasis; cardiomyocyte aging

江蘇省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(Z201301)

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(劉靜)，老年醫(yī)學(xué)科(郭妍)

郭妍，Email：guoyan51@hotmail.com

R 737

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.02.007

2016-07-19)