許毅 黃新恩 陳森清 馬國建 張曉梅 朱明 俞軍

藤黃酸對人胃腺癌細胞BGC-823細胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和AKt蛋白磷酸化表達的影響

許毅 黃新恩 陳森清 馬國建 張曉梅 朱明 俞軍

目的 探討藤黃酸(GA)對人胃癌細胞BGC-823端粒酶活性和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA、AKt蛋白磷酸化表達的影響。 方法 將處于對數(shù)生長期的BGC-823細胞制成細胞懸液,加入96孔酶標(biāo)板內(nèi),加入不同濃度的GA孵育24、48、72 h后,收集細胞,采用MTT比色法測定半抑制濃度(IC50)值;分別采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)法檢測端粒酶的活性和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測hTERT mRNA的表達;通過免疫共沉淀(IP)法獲得hTERT與磷酸化AKt(p-AKt)蛋白的結(jié)合體,然后用Western blot法檢測p-AKt蛋白表達的變化。 結(jié)果 GA可以明顯抑制胃癌細胞BGC-823的端粒酶活性和hTERT mRNA的表達,呈一定的時效、量效關(guān)系;進一步研究發(fā)現(xiàn),GA能夠抑制hTERT 和p-AKt蛋白的結(jié)合,且作用呈時間依賴性,進而影響p-AKt參與的hTERT的活化,從而完成對hTERT轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,抑制端粒酶的活性。 結(jié)論 GA可明顯抑制胃癌細胞BGC-823端粒酶活性和hTERT的表達,GA對BGC-823細胞生長抑制的作用機制可能與GA影響p-AKt參與的hTERT的活化,從而完成對hTERT轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控有關(guān)。

人胃癌細胞BGC-823; 藤黃酸; 端粒酶; 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶; 磷酸化AKt

研究表明,大多數(shù)胃癌細胞中有端粒酶活性和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)表達,但是其作用機制和調(diào)控機制尚不清楚。最新研究結(jié)果表明,磷酸化的AKt(p-AKt)能夠與hTERT結(jié)合并活化hTERT,從而激活端粒酶的活性[1]。我們已有研究表明,在BGC-823細胞中,藤黃酸(GA)能夠抑制hTERT和p-AKt的結(jié)合,從而抑制hTERT的活化,進而影響端粒酶全酶的活性。本研究旨在揭示GA參與胃癌細胞端粒酶活性調(diào)節(jié)的核心機制研究,為進一步探討GA的抗腫瘤作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物 GA原料藥,含量98%,為橙黃色結(jié)晶,中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供,使用前用1640培養(yǎng)液稀釋成0.52、0.74、1.06、1.51、2.16、3.08、4.40、6.29 μmol/L。

1.2 瘤株 人胃癌BGC-823細胞株、人宮頸癌Hela細胞株(端粒酶活性檢測陽性對照)由中科院上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫提供。用含10 %的小牛血清1640 (GIBCO)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.3 試劑和儀器 端粒酶引物:Ts引物: 5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’；Cx引物: 5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’;hTERT引物(5’-3’):上游CGGAAGAGTCTGGAGCAA 、下游GGATGAAGCGGAGTCTGGA;AKt,p-AKt蛋白一抗購自santa cruz公司,二抗及Actin一抗、二抗均購自Sigma公司;小牛血清:杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品,經(jīng)56 ℃水浴30 min滅活,-20 ℃保存;青霉素、鏈霉素:山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品,批號20000628;培養(yǎng)基:RPMI-1640培養(yǎng)粉(美國GIBCO公司),用三蒸水配制,添加10%小牛血清及青霉素、鏈霉素各100 μl/ml,無菌過濾,4 ℃?zhèn)溆谩?-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國sigma公司; TriPure試劑盒、DNase-free RNase購自美國羅氏公司;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) kit 購自日本 TaKaRa公司。PCR擴增儀為美國PE公司;酶標(biāo)檢測儀為美國Gene公司BioTech產(chǎn)品;低溫冷凍高速離心機為日本HITACH公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 BGC-823細胞生長抑制率測定:將處于對數(shù)生長期的BGC-823細胞用0.02%EDTA消化,制成細胞懸液,以2×105/ml細胞濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi),每孔100 μl,設(shè)五復(fù)孔,置37 ℃ 5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h左右,分別給予0.52、0.74、1.06、1.51、2.16、3.08、4.40、6.29 μmol/L GA,終體積為100 μl/孔,對照組Hela細胞株加入相同體積的培養(yǎng)基。給藥后孵育24、48、72 h,加入20 μl MTT,37 ℃孵育4 h后加入100 μl DMSO。BioTech酶標(biāo)儀570 nm處檢測OD值。抑制率計算公式如下[3]：

1.4.2 BGC-823細胞的端粒酶活性測定:提取端粒酶:收集加藥半抑制濃度(IC50)、作用24、48、72 h后,細胞用洗滌緩沖液(10 nmol/L Heps-KOH,pH 7.5,1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl,1 mmol/L DTT)洗1次,離心后棄去洗液。加入200 μl裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,5 mmol/L β-巰基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油)冰浴30 min,16 000 r/min,4 ℃,30 min,取上清,測定其蛋白濃度,-80 ℃保存待用。

PCR-TRAP擴增:取待測樣品50 μg總蛋白,反應(yīng)體積為20 μl。其中含TS,CX端粒酶引物和反應(yīng)混合物,25 ℃,30 min,然后在PCR擴增儀上擴增,條件為:94 ℃,30 s,50 ℃,30 s,72 ℃,90 s,循環(huán)30次,再72 ℃延伸10 min。

產(chǎn)物雜交檢測:取5 μl擴增產(chǎn)物,加入20 μl變性試劑,25 ℃孵育10 min,再加入225 μl雜交緩沖液,振蕩混勻后取100 μl混合物加入已包被的微孔板的各孔中,37 ℃,300 r/min振蕩2 h,棄去雜交液,用清洗緩沖液洗3次,加入抗-DIG-POD工作液100 μl, 25 ℃,30 min,再用清洗緩沖液洗5次,加入TMB底物溶液100 μl,20 min后再加入100 μl終止液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測定標(biāo)本450 nm吸收值(參照波長為690 nm)判斷吸光度結(jié)果,讀數(shù)結(jié)果>0.02為陽性,陰性對照選擇同時培養(yǎng)的細胞株加蒸餾水。

1.4.3 GA對BGC-823細胞hTERT mRNA表達水平的影響:按照Tripure Kit 說明書提取細胞中的總RNA。采用RT-PCR檢測hTERT mRNA的表達: RT-PCR所用引物參照文獻,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)為內(nèi)對照。(1)hTERT引物:上游:5’CGGAGAGTGTCTCTGGAGCAA3’，下游:5’GATGAA-GCGGAGTCTGG3’(擴增產(chǎn)物145 p)；(2)GAPDH引物:上游5’CCATGGAGAAGGCTGGGG3’,下游:5’CAAAGTTTGACACGGATGACC3’(擴增產(chǎn)物408 bp)。 使用One-step RT-PCR System (TARKARA)在PE GeneAmp9600 Thermocycler上操作。反應(yīng)總體積為50 μl(模板RNA 1 μg,RT/Taq mix 1 μl,上下游引物各0.24 μmol/L,dNTP 200 μmol/L)。RT-PCR程序:50 ℃,30 min(合成cDNA)及94 ℃,2 min;35個循環(huán):94 ℃,30 s,56 ℃,45 s,72 ℃,90 s;最后72 ℃延伸5 min。取8 μl PCR產(chǎn)物,在2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離(以100 bp DNA ladder為分子量標(biāo)準(zhǔn)),EB染色后紫外成像。

1.4.4 GA對BGC-823細胞hTERT和AKt蛋白表達的影響:配制12%分離膠,5%濃縮膠,樣品與2× loading buffer等體積混勻,98 ℃變性5 min,上樣,每孔總蛋白量約為25 μg。80 V濃縮膠30 min,120 V分離膠,2 h;取下膠,按尺寸剪取合適大小的Whatmann濾紙及硝酸纖維素膜,上下各3層濾紙,中間為膠和膜,膠在負極,膜在陽極,用玻棒仔細趕除氣泡,采用半干式轉(zhuǎn)膜,恒流75 mA,轉(zhuǎn)膜60 min;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,對比預(yù)染Marker藍色條帶剪切,hTERT蛋白122 kD,actin蛋白43 kD;將剪切好的硝酸纖維素膜浸入立春紅工作液中,染色2～5 min后,蒸餾水沖洗,觀察轉(zhuǎn)膜效率,用PBST洗去立春紅條帶;封閉:用封口機將各條膜置于自封袋中,封好三邊,加入現(xiàn)配的10%脫脂奶粉(或0.1% Casein酪蛋白),500 μl/條,盡可能排除氣泡。封閉袋口,平放于搖床上,37 ℃溫育45 min至1 h;封閉結(jié)束后,棄封閉液,用少量PBST將殘余奶粉漂洗干凈,清洗3次,每次10 min;加一抗。一抗用PBST稀釋至工作液濃度(1∶500),取熱封袋,將硝酸纖維素膜裝入,加入抗體工作液,1 ml/袋,封口機將各條膜封閉于自封袋中,盡可能排除氣泡。37 ℃恒溫搖床反應(yīng)1 h后,置于4 ℃冰箱過夜;第2天剪開自封袋,廢棄抗體,將條膜置于皿中用PBST清洗3次,10 min/次;用PBST稀釋辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗至工作液濃度(1∶2000),1 ml/條,按前法封袋。37 ℃恒溫搖床反應(yīng)1 h;反應(yīng)結(jié)束后剪開袋口,棄二抗,用PBST清洗3次,10 min/次, PBS清洗10 min。于Odyssey近紅外熒光掃描儀掃描。

1.4.5 GA對BGC-823細胞AKt蛋白磷酸化和hTERT相互作用的研究:通過免疫沉淀(IP)法獲得hTERT與p-AKt蛋白的結(jié)合體,總蛋白提取后按體積比(1∶5)加入含有瓊脂糖小球篦子,混勻充分。每100 μg蛋白樣品加入5 μl hTERT抗體,輕柔振搖,混懸均勻。4 ℃,80 r/min振搖過夜。4 ℃,4000 r/min離心2 min,廢棄上清。沉淀用適量PBS清洗,輕柔混懸,4 ℃,80 r/min振搖10 min。4 ℃,4000 r/min離心2 min,廢棄上清。重復(fù)以上步驟2～3次,最后一次盡可能吸盡上清,廢棄。沉淀中加入30 μl 4× loading buffer,輕柔振搖,混懸均勻。4 ℃,12000 r/min離心10～20 min,將上清轉(zhuǎn)移至新EP管。98 ℃變性5 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?。然后用Western blot法檢測p-AKt蛋白表達的變化。

2 結(jié)果

2.1 GA對胃腺癌BGC-823細胞生長的抑制作用 采用MTT法,研究GA對體外培養(yǎng)人胃腺癌BGC-823細胞的生長抑制作用,繪制其生長抑制曲線,結(jié)果顯示不同濃度的GA作用于BGC-823細胞0～72 h后,細胞呈不同程度的抑制作用,此抑制作用與藥物濃度和作用時間呈一定的依賴關(guān)系。根據(jù)孫氏綜合法(改進寇氏法)計算得到,藥物作用48 h,GA對BGC-823細胞的IC50為(1.41±0.20)μmol/L,表明GA對人胃腺癌BGC-823細胞有明顯的生長抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 見圖1。

圖1 GA對BGC-823細胞的抑制作用

2.2 端粒酶活性檢測結(jié)果 釆用1～50 μg不同濃度的HELA細胞株進行端粒酶活性測定。其吸收值為0.2～3.5,而正常人血清均低于0.2,其結(jié)果滿足試劑盒的技術(shù)要求。因此將待測標(biāo)本的吸收值>0.2定為端粒酶活性表達陽性的域值。實驗結(jié)果表明:加藥處理24、48、72 h后,端粒酶活性逐漸降低。

2.3 hTERT mRNA檢測結(jié)果 在2%的瓊脂糖電泳后可以看到,相對于未加藥蒸餾水對照組,GA給藥組相對灰度值降低,且隨著作用時間的延長降低幅度明顯,72 h后在電泳圖上無條帶。見圖2。

圖2 GA抑制BGC-823細胞hTERT mRNA表達

2.4 GA對BGC-823細胞AKt蛋白及其磷酸化表達的影響 體外培養(yǎng)的BGC-823 細胞經(jīng)IC50劑量[(1.41±0.20)μmol/L]的GA分別處理24、48、72 h后,隨著藥物作用時間的延長,p-AKt蛋白的表達未有明顯變化,而p-AKt蛋白水平均有不同程度的下降,24 h僅有少量降低,而48 h和72 h 時表達受抑明顯。見圖3。

圖3 GA對BGC-823細胞AKt蛋白和p-AKt蛋白表達的影響

2.5 GA對BGC-823細胞p-AKt蛋白和hTERT相互作用的研究 體外培養(yǎng)的BGC-823 細胞經(jīng)IC50劑量的GA分別處理24、48、72 h后,細胞在非變性條件下被裂解,用蛋白質(zhì)hTERT的抗體免疫沉淀hTERT,與hTERT在體內(nèi)結(jié)合的p-AKt蛋白也被沉淀了下來,用抗p-AKt的抗體免疫印跡法檢測p-AKt蛋白的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn):GA能夠抑制hTERT 和p-AKt蛋白的結(jié)合,且作用呈時間依賴性,進而影響p-AKt參與的hTERT的活化,從而完成對hTERT轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,抑制端粒酶的活性。見圖4。

圖4 GA抑制BGC-823細胞hTERT 和p-AKt蛋白的結(jié)合

3 討論

藤黃具有消腫、化毒、止血、殺蟲的功用,用于治療癰疽腫毒,頑癬惡瘡,損傷,出血,牙瘡蛀齒等,在祖國醫(yī)學(xué)上早有記載。近二三十年來發(fā)現(xiàn),該藥具有顯著的抗腫瘤活性,引起了廣泛的重視。植物來源的天然活性物質(zhì)相較于化學(xué)合成藥物有著明顯的優(yōu)勢,GA在有效劑量范圍內(nèi)無明顯不良反應(yīng)，對機體造血及免疫系統(tǒng)亦無顯著影響,這提示GA可能作用于腫瘤細胞內(nèi)獨特的靶點。

端粒酶是真核生物染色體末端的核蛋白結(jié)構(gòu),端粒的一個主要功能是標(biāo)記截然不同于破裂DNA末端和利于染色體復(fù)制的線性染色體末端。端粒酶的激活與癌癥高度相關(guān),提示端粒酶、端粒和端粒維持間的互相影響是癌癥衍變過程中至關(guān)重要的一步。人端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR),端粒酶相關(guān)蛋白(TP1),hTERT三部分組成[2-3]。幾乎所有存在端粒酶的機體均含有一單獨的TERT基因,hTERT具有聚合酶的活性。在無細胞體系中混合人端粒酶RNA和hTERT即可表現(xiàn)出端粒酶活性。雖然前2種成分對端粒酶的活性都是必需的,但是它們表達方式是不同的,它們在端粒酶陽性的腫瘤組織和端粒酶陰性的正常組織中廣泛表達,而hTERT僅在端粒酶陽性的腫瘤細胞和永生化細胞中表達,且由于TERTs內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)的殘基突變導(dǎo)致端粒酶活性消失,說明hTERT是端粒酶活性的決定因素[4-5]。在本研究中,我們檢測了GA對人胃腺癌BGC-823細胞端粒酶活性及其亞基表達的作用。實驗結(jié)果表明,GA(IC50劑量)對體外培養(yǎng)的胃癌細胞端粒酶活性有明顯抑制作用,加藥24 h后端粒酶活性還能通過銀染檢測呈陽性,加藥48 h時端粒酶活性即大幅下降,銀染已無法檢測出陽性條帶,加藥72 h后則端粒酶已基本無活性。對hTERT的研究表明,hTERT mRNA的表達與端粒酶全酶的活性一致,加藥24 h(IC50劑量)亞基mRNA的表達尚且很高,而GA作用時間延長至48 h和72 h后,半定量RT-PCR的電泳圖上已基本看不到條帶,其灰度掃描相對值已降至15%以下(相對于未加藥組)。

對于端粒酶全酶的活性而言,與hTERT的轉(zhuǎn)錄活性相比,翻譯后的修飾也同樣重要,hTERT的活性受蛋白激酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)[6]。有文獻報道,蛋白激酶B/AKt復(fù)合物與上調(diào)hTERT蛋白磷酸化密切相關(guān)[7]。Smith等[8]證明了在hTERT磷酸化824位點的絲氨酸殘基能夠被AKt磷酸化。我們也在BGC-823細胞中發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。而GA能夠顯著抑制AKt的磷酸化,而不影響總AKt的變化,這就說明GA通過AKt通路下調(diào)hTERT的磷酸化，具有hTERT轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)功能。包括AKt,蛋白激酶C(PKC)和一些絲氨酸/蘇氨酸激酶也與hTERT的磷酸化有關(guān)[9]。接下來我們將展開對這些酶的研究,諸如PKC等,探索這些酶是否也參與了GA誘導(dǎo)的hTERT去磷酸化過程。

綜上所述,GA誘導(dǎo)的端粒酶活性的抑制是一個多因素的過程。下調(diào)hTERT的轉(zhuǎn)錄活性和hTERT翻譯后的修飾都參與到了端粒酶的抑制過程之中。我們認為GA對人胃腺癌BGC-823細胞hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性具有直接特異性的抑制作用,該作用為GA抑制端粒酶全酶活性以及hTERT mRNA水平的基礎(chǔ),還通過AKt通路影響hTERT翻譯后的修飾。盡管GA鈍化AKt的具體過程仍然不清楚,但是我們的研究清楚地表明GA可以作為一個潛在的治療藥物,通過抑制端粒酶活性從而治療包括胃腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤。

[1] Guo QL, You QD, Wu ZQ, et al. General gambogic acids inhibited growth of human hepatoma SMMC-7721 cells in vitro and in nude mice[J]. Acta Pharmacol Sin,2004,25(6):769-774.

[2] Sargent JM, Taylor CG. Appraisal of the MTT assays as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia[J]. Br J Cancer, 1989,60(2):206-210.

[3] Cao Y, Huschtscha LI, Nouwens AS, et al. Amplification of telomerase reverse transcriptase gene in human mammary epithelial cells with limiting telomerase RNA expression levels[J]. Cancer Res,2008,68(9):3115-3123.

[4] Horikawa I, Cable PL, Afshari C, et al. Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene[J]. Cancer Res,1999,59(4):826-830.

[5] Wu KJ, Grandori C, Amacker M, et al. Direct activation of TERT transcription by c-MYC[J]. Nat Genet,1999,21(2):220-224.

[6] Greenberg RA, O’Hagan RC, Deng H, et al. Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation[J]. Oncogene, 1999,18(5):1219-1226.

[7] Lamonerie T, Lavialle C, de Galle B, et al. Constitutive or inducible overexpression of the IGF-2 gene in cells of a human colon carcinoma cell line[J]. Exp Cell Res, 1995,216(2):342-351.

[8] Smith LL, Coller HA, Roberts JM. Telomerase modulates expression of growth-controlling genes and enhances cell proliferation[J]. Nat Cell Biol, 2003,5(5):474-479.

[9] Kang SS, Kwon T, Kwon DY, et al. Akt protein kinase enhances human telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit[J]. J Biol Chem,1999,274(19):13085-13090.

Effect of gambogic acid on AKt and human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human gastric carcinoma BGC-823 cells

XUYi.

DepartmentofPharmacy,JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

HUANGXin-en,CHENSen-qing,MAGuo-jian,ZHANGXiao-mei,ZHUMing,YUJun.

TumorResearchCenter,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China

Objective To explore the effect of Gambogic acid(GA) on p-AKt and human telomerase reverse transcriptace(hTERT) in human gambogic acidstric carcinoma cells. Methods To investigate the inhibitiny effects of GA on human grastric carcinoma cells BGC-823, we observed the cells treated with GA by invert-microscope. MTT assay was applied to study the growth inhibition of human grastric carcinoma cells BGC-823 in vitro. The activity of telomerase and the expression of hTERT were detected by PCR-ELISA and RT-PCR. Furthermore, the immunoprecipitation assay was used to detect the affinity of hTERT and p-AKt in BGC-823 induced by GA treatment. And then protein level of p-AKt was determined by western blot analysis. Results GA decreased the expression of telomerase activity and hTERT at time-dependent and concentration-dependent manner. Then, further investigation showed that the affinity of hTERT and p-AKt was inhibited by GA treatment via the down-regulation of p-AKt expression in significant time- and concentration- dependent manner. Then the activity of telomerase was inhibited. Conclusions These results show that GA can inhibit the proliferation of human grastric carcinona cells BGC-823. The mechanism may be that GA inhibits the posttranscriptional activation of hTERT in an p-AKt dependent manner in BGC-823 cells and finally, and affect the activity of telomerase.

gambogic acid; BGC-823; telomerase; human telomerase reverse transcriptase; p-AKt

江蘇省科技廳資助項目(BK20161598)；南京市科技局資助項目(201605006)；江蘇省腫瘤醫(yī)院重點課題(ZK201603)

210029江蘇省南京市，江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部(許毅)；210009江蘇省南京市，江蘇省腫瘤醫(yī)院科研科(黃新恩，陳森清，馬國建，張曉梅，朱明，俞軍)

俞軍，Email：13901591757@163.com

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.02.006

2016-04-14)