溫小輝,蒲中樞,王 洋,付 婷,成慧娟,蘇海霞,邵中軍

武威市某鎮(zhèn)乙型肝炎感染者家庭內(nèi)部隱匿性感染現(xiàn)狀及其分子進(jìn)化特征

溫小輝,蒲中樞,王 洋,付 婷,成慧娟,蘇海霞,邵中軍

目的 研究武威市某鎮(zhèn)乙型肝炎病毒(HBV)家庭內(nèi)部感染者中隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection, OBI)的流行現(xiàn)狀及其分子進(jìn)化特征。方法 以2009年武威市某鎮(zhèn)體檢發(fā)現(xiàn)的HBsAg陽(yáng)性者為先證者，詢問(wèn)其家族史，簽署知情同意書(shū)后，對(duì)此家庭內(nèi)部人員進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，收集血樣。采用ELISA檢測(cè)HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc；對(duì)所有血清樣本用病毒DNA磁珠法試劑盒提取，而后巢式PCR擴(kuò)增S區(qū)獲得HBVDNA片段，測(cè)序后應(yīng)用mega6.0進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果 共收集血清學(xué)標(biāo)本80份；HBsAg、抗-HBc、HBVDNA的陽(yáng)性率分別為43.8%、78.8%、37.5%；OBI共有12例，感染率是26.7%(12/45)。結(jié)論 在HBV感染家庭中，家庭內(nèi)部OBI陽(yáng)性率明顯高于一般人群，基因型主要是C型、D型，其中基因型D型居多。

乙型肝炎病毒；隱匿性感染；分子進(jìn)化

慢性乙型肝炎是我國(guó)常見(jiàn)的慢性傳染病之一，全球約20億人曾感染過(guò)乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.5億人為慢性HBV感染者[1]。乙型肝炎感染者的篩查主要靠HBsAg這一指標(biāo)，而隱匿性感染(occult hepatitis B virus infection, OBI)由于其HBsAg陰性很難發(fā)現(xiàn)，給患者造成很大的危害；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的患者被檢出，其意義也受到重視。OBI是指HBsAg陰性而血清或肝組織中DNA陽(yáng)性[2]。OBI主要與抗原突變逃逸、宿主狀態(tài)相關(guān)[3]，其與肝硬化、肝癌密切相關(guān)[4-7]，因此其研究值得關(guān)注。而對(duì)于家庭內(nèi)部OBI的研究目前還比較少。筆者主要針對(duì)HBV感染者家庭OBI的研究從而為乙型肝炎家庭內(nèi)部人群的預(yù)防和治療等提供一定的指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 以2009年武威市某鎮(zhèn)體檢發(fā)現(xiàn)的HBsAg陽(yáng)性者為先證者，調(diào)查其家庭成員。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)先證者的所有直系家庭成員；(2)家庭成員近5年生活在同一個(gè)住所。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)采血時(shí)不在本地不能進(jìn)行采血的人員；(2)患有甲型肝炎、丙型肝炎等其他傳染病的人員；(3)患有肝硬化、肝癌的人員。OBI 的判定標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)商業(yè)試劑盒檢測(cè)HBsAg陰性，巢式PCR擴(kuò)增樣本血清HBV DNA結(jié)果陽(yáng)性。

1.2 調(diào)查內(nèi)容 詢問(wèn)其家族史，簽署知情同意書(shū)后，調(diào)查人員統(tǒng)一進(jìn)行培訓(xùn)，調(diào)查內(nèi)容包括一般狀況、HBV感染史、臨床病史、飲酒史、家族史及與先證者的親屬關(guān)系，每位成員抽取靜脈血5 ml，2000 r/min離心20 min后，取血清置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血液檢測(cè)方法 用ELISA法檢測(cè)HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc，商業(yè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物工程公司。對(duì)所有的血清樣本用病毒DNA磁珠法提取試劑盒(長(zhǎng)春市志昂生物科技有限公司)提取DNA，而后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)引物外引物為S1：5′CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC3′，S2：5′ATACCCAAAGACAAAAGAAA-A3′； 內(nèi)引物為S3：5′GCGGGGTTTTTCTTGTTGAC3′，S4：5′GGGACTCAAGATGTTGTACAG3′，引物由上海尼桑生物科技有限公司合成。外引物以第一輪反應(yīng)體系進(jìn)行，第一輪PCR擴(kuò)增，PCR參數(shù)：94 ℃變性30 min，55 ℃退火50 min和72 ℃延伸1 min，循環(huán)周期結(jié)束后在72 ℃孵化5 min以確保充分延伸。以第一輪產(chǎn)物為模版，以內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR參數(shù)與第一輪參數(shù)相同。每輪PCR均設(shè)陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物為S區(qū)，長(zhǎng)度584 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，紫外線條件下觀察陽(yáng)性結(jié)果，送上海尼桑生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。對(duì)測(cè)得的HBV片段序列與參比序列應(yīng)用MEGA6.0進(jìn)行基因序列分析。依據(jù)genbank已發(fā)表的人類HBV基因序列，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)服務(wù)器中的BLAST菜單進(jìn)行同源性檢索以確定標(biāo)準(zhǔn)的HBV基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)特征分析 發(fā)現(xiàn)先證者27例，涉及27個(gè)家庭，樣本共計(jì)80例(男39名，女41例)，進(jìn)而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBsAg陽(yáng)性者共35例，陽(yáng)性率是43.8%，占陽(yáng)性人群的71.4%。Anti-HBs陽(yáng)性者63例，陽(yáng)性率是78.8%。HBeAg陽(yáng)性者3例，陽(yáng)性率3.8%，Anti-HBe陽(yáng)性者24例，陽(yáng)性率是30%，anti-HBc陽(yáng)性者63例，陽(yáng)性率是78.8%。HBsAg陰性者45例，其中OBI有12例，發(fā)生率26.7%。OBI人群與慢性乙型肝炎攜帶者人群特征比較，Anti-HBs陽(yáng)性率和Anti-HBe 在兩個(gè)人群中有差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 家庭內(nèi)部成員OBI感染人群和乙型肝炎攜帶者人群特征 [±s;(n;%)]

2.2 基因型、血清型和進(jìn)化特征分析 OBI病例中，C基因型4例，D基因型8例，最大似然法HBV隱匿性感染系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1。血清型adrq+4例，ayw38例。慢性乙型肝炎攜帶者中B基因型4例，C基因型5例，D基因型9例。血清型adw24例，ayw29例，adrq+5例。

圖1 最大似然法HBV隱匿性感染系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

標(biāo)本前面的阿拉伯?dāng)?shù)字代表著B(niǎo)ootstrap值，值越大代表病毒株之間的親緣性越近，J68、J67、J62、J34、J45、J42、J55、J58與HBVD基因型標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)化距離近，可以認(rèn)為屬于HBV基因型D；J21、J31、J35、J76與HBVC基因型標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)化距離近，認(rèn)為屬于HBV基因型C

2.3 OBI基因突變分析 分析OBI樣本S區(qū)顯示：與T細(xì)胞表位相關(guān)的突變包括J34發(fā)生T123I突變，J42發(fā)生A166G突變，J55、J58發(fā)生Q101R、I110L、T189I突變，J62、J67、J68發(fā)生P120T突變，J67、J68發(fā)生G185W突變。與a共同決定簇相關(guān)的變異包括J34發(fā)生Y134N突變，J45發(fā)生Y134K突變,J42、J62、J67、J68發(fā)生T140I突變。6個(gè)樣本發(fā)生a共同決定簇相關(guān)基因位點(diǎn)突變，占50%。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中C基因型沒(méi)有a共同決定簇相關(guān)基因位點(diǎn)突變(圖2)，8個(gè)D基因型樣本中發(fā)生突變6個(gè)a共同決定簇相關(guān)基因位點(diǎn)突變，占75%(圖3)。

圖2 隱匿性乙型肝炎感染基因型C氨基酸位點(diǎn)突變

圖3 隱匿性乙型肝炎感染基因型D氨基酸位點(diǎn)突變

3 討 論

我國(guó)屬于HBV的高流行地區(qū)。何英利等[8]發(fā)現(xiàn)，HBsAg陽(yáng)性率是45.6%，而張振華等[9]研究的關(guān)于家族史人群的OBI陽(yáng)性率為8.0%。顏丙玉等[10]對(duì)山東省社區(qū)人群OBI的研究發(fā)現(xiàn)感染率是0.82%。一項(xiàng)對(duì)廣西壯族自治區(qū)隆安縣家庭內(nèi)部感染者的研究發(fā)現(xiàn)，OBI陽(yáng)性率是11.5%[11]。武威市最近的一次流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)， HBsAg陽(yáng)性率是7.19%，明顯高于全國(guó)平均水平[12]。筆者調(diào)查的武威市某鎮(zhèn)家庭內(nèi)部人群HBsAg的陽(yáng)性率是43.8%，OBI陽(yáng)性率是26.7%，明顯高于一般人群。OBI人群Anti-HBs陽(yáng)性率91.7%，慢性乙型肝炎攜帶者Anti-HBs陽(yáng)性率27.8%，兩組人群具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明Anti-HBs的存在或許可以抑制病毒DNA在體內(nèi)的復(fù)制，影響機(jī)體對(duì)病毒的清除，從而造成HBV病毒DNA在體內(nèi)的低水平持續(xù)存在。

基因型有明顯的地域和種族特征，A、D主要分布在美國(guó)和歐洲，基因型B、C主要分布在東亞及東南亞，E型多分布在非洲，F(xiàn)型多分布在南美洲、法國(guó)，G型僅在法國(guó)和美國(guó)，H型主要是拉丁美洲南部、中美洲等地，這種地域分布在一定程度上反映了HBV的起源和傳播[13]。中國(guó)的乙型肝炎基因型主要有B型、C型[14]。本研究中家系人群HBV DNA發(fā)現(xiàn)的主要基因型是C型、D型，而D型最多。主要原因可能是武威地處河西走廊屬多民族聚集區(qū)，歷史上又是絲綢之路必經(jīng)之路，移民較多。

本次實(shí)驗(yàn)中，OBI人群中與a共同決定簇相關(guān)的突變有T126A、Y134N、T140、ST140I、S143L，其中有兩個(gè)樣本分別發(fā)生T140I、S143L突變。6個(gè)樣本發(fā)生基因位點(diǎn)突變，占總樣本的50%(6/12)，且發(fā)生突變株都屬于基因型D，占基因型D的75%(6/8)，說(shuō)明OBI中基因型D比基因型C更易發(fā)生突變。有研究表明S區(qū)aa145變異是表面抗原逃逸突變的主要原因[15]，同時(shí)144、143、142、141、137、133、127、120、124、126、129位點(diǎn)突變也影響表面抗原的形成[16]。本次研究中新發(fā)現(xiàn)134、140位點(diǎn)發(fā)生突變，這些位點(diǎn)或許參與了表面抗原的逃逸突變。

總之，在乙型肝炎家庭內(nèi)部感染中，OBI的流行病學(xué)資料有其自身特點(diǎn)，而武威市屬于多民族聚集區(qū)和古絲綢之路的重要城市，由于其獨(dú)特的地域、民族特色，OBI更增添了其特殊性。家庭內(nèi)部OBI陽(yáng)性率明顯高于一般人群，需要乙型肝炎患者家庭成員有針對(duì)性地做好相關(guān)預(yù)防措施。

[1] Van Damme P, Cramm M, Van der Auwera J C,etal. Horizontal transmission of hepatitis B virus [J]. Lancet, 1995, 345(8941): 27-29.

[2] Raimondo G, Allain J, Brunetto M R,etal. Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection [J]. J Hepatol, 2008, 49(4): 652-657.

[3] Kwak M. Occult hepatitis B virus infection [J]. World J Hepatol, 2014, 6(12): 860.

[4] Chan H L, Tsang S W, Leung N W,etal. Occult HBV infection in cryptogenic liver cirrhosis in an area with high prevalence of HBV infection [J]. Am J Gastroenterol, 2002, 97(5): 1211-1215.

[5] Simonetti J, Bulkow L, McMahon B J,etal. Clearance of hepatitis B surface antigen and risk of hepatocellular carcinoma in a cohort chronically infected with hepatitis B virus [J]. Hepatology, 2010, 51(5): 1531-1537.

[6] Huang X, Hollinger F B. Occult hepatitis B virus infection and hepatocellular carcinoma: a systematic review [J]. J Viral Hepat, 2014, 21(3):153-162.

[7] Kitab B, Ezzikouri S, Alaoui R,etal. Occult HBV infection in Morocco: from chronic hepatitis to hepatocellular carcinoma [J]. Liver Int, 2014,34(6):e144-e150.

[8] 何英利，趙英仁，高 珩，等. 聚集性感染家族內(nèi)乙型肝炎病毒標(biāo)志物[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 27(24): 2288-2290.

[9] Zhang Z, Zhang L, Dai Y,etal. Occult hepatitis B virus infection among people with a family history of chronic hepatitis B virus infection [J]. J Med Virol, 2015, 87(11): 1890-1898.

[10] 顏丙玉，張 麗，紀(jì) 峰，等. 山東省社區(qū)人群隱匿性乙型肝炎病毒感染現(xiàn)狀分析[J]. 中國(guó)疫苗和免疫, 2011, 17(4): 303-306.

[11] Fang Y, Shang Q, Liu J,etal. Prevalence of occult hepatitis B virus infection among hepatopathy patients and healthy people in China [J]. J Infect, 2009, 58(5): 383-388.

[12] 吉兆華，張 琪，閆永平，等. 甘肅省武威市人群乙肝流行現(xiàn)狀及其影響因素研究[C]//中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2013: 37-38.

[13] Tong S, Revill P. Overview of hepatitis B viral replication and genetic variability [J]. J Hepatol, 2016, 64(1): S4-S16.

[14] Zhu C T, Dong C L. Characteristics of general distribution of hepatitis B virus genotypes in China [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009, 8(4): 397-401.

[15] Rastegarvand N, Makvandi M, Samarbafzadeh A,etal. Molecular characterization of pre-core/core and sregion of hepatitis Bvirus in hemodialysis patients withoccult hepatitis Binfection [J]. Jundishapur J Microbiol, 2015, 8(10)：987-995.

[16] Nainan O V, Khristova M L, Byun K,etal. Genetic variation of hepatitis B surface antigen coding region among infants with chronic hepatitis B virus infection [J]. J Med Virol, 2002, 68(3): 319-327.

(2016-07-20收稿 2016-11-15修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

The status quo and molecular evolution of occult infection in intrafamilial patients with hepatitis B virus infection in Wuwei

WEN Xiaohui, PU Zhongshu, WANGY Yang, FU Ting, CHENG Huijuan, SU Haixia, and SHAO Zhongjun.

Department of Epidemiology, Department of Preventive Medicine, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To study the status quo and molecular evolution of occult infection in intrafamilial patients with hepatitis B virus infection in the city of Wuwei.Methods All the people who were found to be infected with HBsAg during a physical examination in 2009 in a town in Wuwei were questioned for their HBV family history. After they signed informed consent, their blood was drawn and tested for hepatitis B surface antigen (HBsAg), antibody to HBsAg (anti-HBs), hepatitis B e-antigen (HBeAg), antibody to HBe (anti-HBe) and antibody to hepatitis B core antigen (anti-HBc) using commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). DNA was extracted using magnetic Beads extraction kit from all the samples, and amplification was performed by nested PCR. Sequences obtained were analyzed by mega 6.0.Results Of the 80 serum samples, the positive rate of HBsAg, Anti-HBc, and HBV DNA was 43.8%, 78.8% and 37.5%, respectively. The rate of infection with intrafamilial occult hepatitis B was 26.7%(12/45).Conclusions The prevalence of intrafamilial occult hepatitis B infection is significantly higher than in the general population. The main genotype is genotype C and genotype D in particular.

hepatitis b virus; occult virus infection；molecular evolution

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373058，81370082)

溫小輝，碩士研究生，醫(yī)師。

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系流行病學(xué)教研室

邵中軍，E-mail：zhjshao@vip.163.com

R512.62