陳浩俊 綜述 李從榮 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

鮑曼不動桿菌組鑒定方法的研究進(jìn)展

陳浩俊 綜述 李從榮 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

鮑曼不動桿菌、pittii不動桿菌和nosocomialis不動桿菌統(tǒng)稱為鮑曼不動桿菌組。由于表型相近，臨床商品化方法并不能有效地鑒定它們。而準(zhǔn)確地鑒定該菌種對臨床診斷、治療、預(yù)后相當(dāng)重要。本文就現(xiàn)有的核酸分子生物學(xué)、蛋白分子生物學(xué)和免疫學(xué)等鑒定方法進(jìn)行綜述，結(jié)果表明分子遺傳學(xué)方法對鮑曼不動桿菌組的準(zhǔn)確鑒定很有必要。

鮑曼不動桿菌；鑒定；分子生物學(xué)；免疫學(xué)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)近三十年作為嚴(yán)重的醫(yī)院感染病原體在全球流行。由于它擁有一系列復(fù)雜的耐藥機(jī)制和頑強(qiáng)的生存能力，使之具備潛在的播散能力[1]。據(jù)2005-2014年間中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)[2]，臨床分離出鮑曼不動桿菌呈上升趨勢。當(dāng)前，不動桿菌屬已擁有23種被命名和11種未被命名的菌種，但是將其鑒定到種的水平仍然難以把握，特別是某些基因相近的不動桿菌，如：鮑曼不動桿菌、nosocomialis不動桿菌和pittii不動桿菌[統(tǒng)稱為鮑曼不動桿菌組(Acb)]；另一方面，準(zhǔn)確地鑒定菌種對臨床診斷、治療、預(yù)后相當(dāng)重要[3]。本文從核酸分子生物學(xué)方法，免疫學(xué)方法，以及近年來開展的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI TOF MS)等方法進(jìn)行綜述。

1 PCR擴(kuò)增法

2006年Turton等[4]首次報(bào)道了blaOXA-51基因可作為鑒定鮑曼不動桿菌特有的標(biāo)志，同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)這類鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素敏感性存在差異。可能的原因是blaOXA-51基因的表達(dá)受控于上游的ISAba1插入序列，這種插入序列作為啟動子控制鄰旁的基因轉(zhuǎn)錄[5]。然而即便擁有ISAba1-blaOXA-51基因也并非是鮑曼不動桿菌產(chǎn)生大量碳青霉烯酶的充分條件[6]，可能是由于基因轉(zhuǎn)錄水平過低不能完全水解產(chǎn)物?；赽laOXA-51基因的特異性，利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物就成為快速鑒定鮑曼不動桿菌的首選方法，然而以此為標(biāo)準(zhǔn)會出現(xiàn)假陰性的錯(cuò)誤。

一方面，Zander等[7]利用PCR檢測OXA-51，結(jié)果顯示blaOXA-51擴(kuò)增產(chǎn)物均大于353 bp片段，按照以往經(jīng)驗(yàn)提示這些非鮑曼不動桿菌。然而基于gyrB的三重PCR和rpoB基因測序驗(yàn)證了均為鮑曼不動桿菌，且有一段序列插入到blaOXA-51基因中。另一方面，臺灣的一個(gè)研究小組在blaOXA-51-like方面做了一系列深入的研究。2009年Lee等[8]首次提出nosocomialis不動桿菌質(zhì)粒上也存在blaOXA-51基因。相較于染色體，質(zhì)粒攜帶的ISAba1-blaOXA-51-like基因?qū)μ记嗝瓜╊惪股馗叨饶退?，猜測可能與質(zhì)粒在菌株里大量自我復(fù)制有關(guān)[9]。近來Lee等[10]又在nosocomialis不動桿菌和極其相似菌株中檢測到blaOXA-511-like基因的存在?？梢奲laOXA-51-like基因能在鮑曼不動桿菌及其基因相近菌種間播散，從而發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移。因此，在使用PCR擴(kuò)增blaOXA-51基因鑒定鮑曼不動桿菌時(shí)，需要警惕插入序列的破壞以及nosocomialis不動桿菌和pittii不動桿菌的存在對試驗(yàn)的干擾。

2 限制酶切法

2.1 核糖分型 核糖分型是一種基于Southern印跡雜交的方法。所有細(xì)菌含有各自獨(dú)特的rRNA，相當(dāng)于人的“指紋”。利用這個(gè)技術(shù)，首先得用特定的限制性內(nèi)切酶切除細(xì)菌的特定位點(diǎn)，將切除的片段進(jìn)行凝膠電泳并轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞膜，通過16s或者23s rRNA探針對其片段雜交比對[11]。大多數(shù)細(xì)菌的核糖分型圖像存在特異性，因此這種方法能鑒定很多細(xì)菌。Gerner-Smidt等[12]最先利用EcoRⅠ、ClaⅠ和AscⅠ限制性酶切Acb rRNA，同時(shí)一段反轉(zhuǎn)錄核苷酸片段探針與之雜交，成功地鑒定了Acb。目前商品化核糖分型檢測系統(tǒng)已被投入使用來鑒定沙門氏菌和大腸埃希菌。然而核糖分型也存在一些缺點(diǎn)，如果rRNA片段較短，那么會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。同時(shí)相較于目前分子分型較為流行的脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)，核糖分型顯得缺乏足夠的分辨率。因此，目前核糖分型漸漸地被PFGE所替代。

2.2 PFGE 盡管基于PCR的方法很常用，但是PFGE仍是細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13]。PFGE的原理大致與核糖分型相似，卻優(yōu)于后者，常用的技術(shù)是對夾同源電場電泳技術(shù)。相較于核糖分型，PFGE通過特定的限制性內(nèi)切酶定位細(xì)菌基因組核苷酸位點(diǎn)，然后將切除的DNA片段脈沖電泳，利用計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)對結(jié)果解釋。在這個(gè)系統(tǒng)里，對PFGE結(jié)果影響最大的就是限制性內(nèi)切酶。在以往的研究中，常用ApaⅠ和SmaⅠ限制酶[14-15]，這兩種限制性內(nèi)切酶的選擇對試驗(yàn)結(jié)果的影響不大。但隨著PFGE技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者提出一些罕見高效的限制酶，如AscⅠ和AsiSⅠ。從實(shí)驗(yàn)耗材、分辨率、室間可比性的角度評比，Chang等[16]發(fā)現(xiàn)AscⅠ可作為鮑曼不動桿菌分子分型的首選限制性內(nèi)切酶。另外，脈沖電泳參數(shù)設(shè)置也同樣影響著PFGE結(jié)果[17]。PFGE作為細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，最大的優(yōu)勢就是該技術(shù)具有巨大的分辨率，能對絕大多數(shù)病原微生物分子分型，包括Acb菌株，從而有效的控制醫(yī)源性微生物感染的爆發(fā)。然而缺點(diǎn)也很明顯，由于沒有統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)和解釋標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用PFGE技術(shù)監(jiān)測微生物流行病學(xué)的實(shí)驗(yàn)室大多是建立自己的標(biāo)準(zhǔn)。因此，室間比對困難。而且PFGE耗時(shí)達(dá)2～4 d時(shí)間，不利于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室及時(shí)提供克隆菌株流行的證據(jù)。盡管Durmaz等[18]對PFGE出結(jié)果時(shí)間控制在28 h左右，然而技術(shù)人員的熟練程度和儀器設(shè)備的昂貴也是限制它發(fā)展的主要因素。而近年由于基因多樣性變化顯著，菌株間常發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，相較于多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，PFGE可能在一定程度上分辨率弱于MLST[19]。

3 基因測序法

16S rRNA廣泛存在于所有細(xì)菌基因組中，序列長度大約1 550 bp，由保守區(qū)和變異區(qū)組成。同時(shí)由于它具有高度的保守性和特異性以及足夠長的基因序列，16S rRNA基因擴(kuò)增測序是目前常用于細(xì)菌鑒定的方法[20]。然而堿基替換率緩慢，并非所有的不動桿菌的16S rRNA均存在多態(tài)性，特別是那些16 S rRNA保守序列相似的菌種。Nemec等[21]的研究結(jié)果顯示，Acb菌株間的16S rRNA基因相似度高達(dá)97%～98.1%，這意味著Acb菌株間可能呈現(xiàn)單態(tài)性現(xiàn)象。而在另一個(gè)研究中，Gundi等[22]發(fā)現(xiàn)通過ropB管家基因測序分辨率明顯高于16S rRNA測序結(jié)果。因此，在使用16S rRNA測序鑒定鮑曼不動桿菌時(shí)需謹(jǐn)慎，最好聯(lián)合其他分子生物學(xué)方法一起使用。表1總結(jié)了當(dāng)前鮑曼不動桿菌菌株分子鑒定的常用方法。

表1 鮑曼不動桿菌分子鑒定方法

4 蛋白分子生物學(xué)方法

近年來，MALDITOF廣泛應(yīng)用于臨床微生物快速鑒定[23]。各種類型微生物可被鑒定，包括細(xì)菌、真菌、病毒。相較于表型試驗(yàn)，MALDI TOF快速可靠。相較于分子生物學(xué)試驗(yàn)，MALDI TOF簡單經(jīng)濟(jì)[24]。該技術(shù)的鑒定原理是通過測試分析物的質(zhì)量/變化比率，分析微生物內(nèi)小蛋白分子質(zhì)量，從而與數(shù)據(jù)庫內(nèi)的質(zhì)量波譜對比，得出比較可靠的結(jié)論。盡管數(shù)據(jù)庫如此巨大，也并不能包括所有微生物。相較于其他菌種，鏈球菌、非發(fā)酵革蘭陰性菌、厭氧菌等難區(qū)分。

當(dāng)前可利用的MS有Bruker MS和Vitek MS兩種[25]，然而現(xiàn)有的技術(shù)想要區(qū)分Acb還存在一定的問題。在Vitek MS中，有體外診斷模式和科研模式，前者用于常規(guī)檢驗(yàn)，系統(tǒng)內(nèi)部本身是一個(gè)不可被修改的數(shù)據(jù)庫；而后者適用于科研，系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫可被修改。因此，有學(xué)者提出各種改進(jìn)方法，使它能更好的適用于臨床和科研。Espinal等[26]通過完善數(shù)據(jù)庫，得到更好的鑒定結(jié)果。Sedo等[27]通過改變基質(zhì)組份，大大的提高了鮑曼不動桿菌的信號。同樣的，Sousa等[28]將MALDI TOF和化學(xué)計(jì)量工具聯(lián)合，校正了鑒定Acb可能發(fā)生的錯(cuò)誤。通過方法的改進(jìn)，使得MALDI TOF在快速確證鮑曼不動桿菌的道路上更加完善。

5 免疫學(xué)

免疫學(xué)方法鑒定鮑曼不動桿菌鮮有被提及。目前集中討論的方向大多與細(xì)菌生物膜相關(guān)蛋白有關(guān)，而他們通常是細(xì)菌定植、耐藥、毒力的關(guān)鍵因素。通過鑒定這些生物膜蛋白，開啟鑒定鮑曼不動桿菌的新思路。Rahbar等[29]利用生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)了一段鮑曼不動桿菌的生物膜蛋白保守序列，基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法可以最大程度上降低鑒定的出錯(cuò)率，然而免疫學(xué)法能否準(zhǔn)確鑒定Acb，需要更多證據(jù)來評價(jià)其可靠性。

6 展 望

作為重要的醫(yī)院感染病原體，鮑曼不動桿菌的檢出率逐年上升。鑒于表型試驗(yàn)并不能準(zhǔn)確地鑒定鮑曼不動桿菌組，且它們的臨床意義、耐藥模式、治療方案均不相同。因此，本文系統(tǒng)地總結(jié)了鮑曼不動桿菌鑒定的各種類型的方法，并指出其優(yōu)缺點(diǎn)，將為今后的鮑曼不動桿菌研究工作提供一定幫助。

考慮到不同的國家和不同的流行區(qū)域，ISA-ba1-blaOXA-51-like基因在鮑曼不動桿菌中有一定差異，擴(kuò)增blaOXA-51基因作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)存在一定的局限性。相較于普通PCR，三重PCR能更好地鑒定鮑曼不動桿菌。由于核糖分型逐漸被PFGE所替代，目前也很少用于區(qū)分Acb。MALDI TOF作為新近方法，通過完善數(shù)據(jù)庫可以作為快速確證鮑曼不動桿菌的首選方法。免疫學(xué)的方法可能會是以后的一個(gè)發(fā)展方向，然而更多的研究需要去證實(shí)觀點(diǎn)。PFGE和MLST仍是值得信賴的分子分型方法。

總之，隨著一些新型鑒定思路的打開，更多快速高效的鑒定鮑曼不動桿菌的方法將被臨床微生物實(shí)驗(yàn)室使用，這必將推動人們對鮑曼不動桿菌的重新認(rèn)識。

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Research update on detection of Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex.

CHEN Hao-jun,LI Cong-rong. Department of Laboratory Medicine,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

Acinetobacter baumannii belongs to the Acinetobacter calcoaceticus-baumannii(Acb)complex,which includes two other species:Acinetobacter nosocomialis and Acinetobacter pittii.Unfortunately,phenotypic tests commonly used in diagnostic laboratories are unable to differentiate species of the Acb.However,precise identification of Acb plays a significant role in clinical diagnosis,chemotherapy and prognosis.Therefore,this review based on molecular biological method and immunological method is to be discussed.In conclusion,it was suggested that molecular genetic methods were so indispensable for precise identification ofAcb.

Acinetobacter baumannii;Identification;Molecular biology;Immunology;Matrix-assisted laser desorption-ionization

R378

A

1003—6350（2017）01—0116—04

2016-04-24)

國家重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(編號：財(cái)社[2010]305)

李從榮。E-mail：congrongLi33@hotmail.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.036