李?；?，朱 琪，白鵬勛，喬家運(yùn)*，王文杰

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津 300381)

獸醫(yī)臨床

日糧添加枯草芽胞桿菌對(duì)大腸埃希菌感染仔豬免疫功能的影響

李海花1,2，朱 琪1,2，白鵬勛1,2，喬家運(yùn)1,2*，王文杰1,2

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津 300381)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加枯草芽胞桿菌對(duì)大腸埃希菌K88感染仔豬血清免疫功能的影響。選用平均體重6.8 kg±0.5 kg的去勢(shì)“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交公豬8頭，隨機(jī)分為2組，每頭豬單欄飼養(yǎng)，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.1%枯草芽胞桿菌，每頭豬灌服致病性大腸埃希菌K88菌液(1×1011CFU)。采用ELISA方法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子和豬瘟抗體水平。結(jié)果表明，采食添加枯草芽胞桿菌的處理組仔豬比對(duì)照組仔豬血清IL-10水平提高(P<0.01)，血清IL-8和TNF-α水平降低(P<0.01)，豬瘟抗體阻斷率提高(P<0.05)。結(jié)果提示，仔豬采食含枯草芽胞桿菌的飼糧時(shí)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，緩解致病性大腸埃希菌K88感染造成的炎癥反應(yīng)。研究工作為枯草芽胞桿菌的推廣應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

枯草芽胞桿菌；大腸埃希菌；細(xì)胞因子；豬瘟；抗體阻斷率；豬

仔豬斷奶后，由于自身產(chǎn)生免疫抗體水平和細(xì)胞免疫能力較低，母源抗體逐漸消失，使仔豬尚不完善的免疫機(jī)能受多種應(yīng)激的影響而進(jìn)一步減弱，容易誘發(fā)疾病[1]?？莶菅堪麠U菌是一種綠色、安全、有效的飼料微生物，能刺激仔豬腸道和免疫系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和消化功能，增強(qiáng)仔豬抗病能力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[2]。有研究表明，芽胞桿菌能促進(jìn)動(dòng)物腸道相關(guān)淋巴組織處于高度的“免疫準(zhǔn)備狀態(tài)”，同時(shí)使免疫器官發(fā)育加快，免疫系統(tǒng)成熟快而早，T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，動(dòng)物體液和細(xì)胞免疫水平提高[3]。致病性大腸埃希菌的感染是造成斷奶仔豬應(yīng)激綜合征的主要原因之一。因此，本研究通過構(gòu)建大腸埃希菌感染仔豬模型，研究枯草芽胞桿菌對(duì)仔豬免疫功能的影響，為其推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒 細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，上海鑫樂生物公司產(chǎn)品；豬瘟抗體阻斷ELISA試劑盒，美國IDEXX公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 選擇體重6.8 kg±0.5 kg杜×長(zhǎng)×大商品雜交仔豬8頭，按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，單欄飼養(yǎng)于專用代謝籠中。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.1%芽胞桿菌制劑，芽胞桿菌為新篩選出的菌株，凍干粉中活菌含量為1×1012CFU/g。

1.1.3 試驗(yàn)用日糧 根據(jù)NRC(2012)配制玉米-豆粕-膨化大豆-魚粉型飼糧，基礎(chǔ)飼糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)豬在21日齡免疫接種豬瘟細(xì)胞疫苗1頭份/頭。所有豬只自由采食和飲水，豬舍溫度控制在25℃～28℃。試驗(yàn)期7 d，攻毒前12 h所有仔豬斷水、斷料。試驗(yàn)組仔豬每頭灌服5 mL大腸埃希菌K88(菌液濃度為2×1010CFU/mL)，對(duì)照組仔豬每頭灌服5 mL生理鹽水，攻毒后2 h開始供水，但仍然停止供料直至試驗(yàn)結(jié)束。攻毒后6 h對(duì)仔豬前腔靜脈采血，分離血清置于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 血清IL-10、IL-8和TNF-α的濃度按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光值(OD)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。然后根據(jù)OD值計(jì)算出樣品中細(xì)胞因子的濃度。用豬瘟抗體阻斷ELISA試劑盒測(cè)定豬瘟抗體，操作方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說明書，CSF抗體阻斷率≥40%為陽性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 以每頭豬為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 2007 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理；采用 SAS 統(tǒng)計(jì)軟件下的Compare Means模塊中的 One-Way ANOVA 進(jìn)行方差分析，并采用T test組間差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05 為差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表1 基礎(chǔ)飼糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ)，% w/w)

注：預(yù)混料為每千克飼糧提供：VA 4 350 IU; VD 3 2 150 IU; 維生素E 16 mg; 維生素K 3 mg ; 維生素B1 1.8 mg; 核黃素6 mg; VB12 0.024 mg; 葉酸0.3 mg; 生物素4.5 mg; 煙酸 24 mg; 泛酸鈣15 mg; 膽堿60 mg; Zn 125 mg; Fe 120 mg; Cu 10 mg; I 0.3 mg; Se 0.3 mg。

Note:Premix1 supplying per kilogram diet:4 350 IU vitamin A; 2 150 IU vitamin D3; 16 mg vitamin E; 3 mg vitamin K; 1.8 mg vitamin B1; 6 mg riboflavin; 0.024 mg vitamin B 12; 0.3 mg folic acid; 4.5 mg biotin; 24 mg nicotinic acid; 15 mg calcium pantothenate; 60 mg choline; 125 mg Zn; 120 mg Fe; 10 mg Cu; 0.3 mg I; 0.3 mg Se.

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血清細(xì)胞因子的影響

試驗(yàn)豬細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，在致病性大腸埃希菌感染下，日糧添加枯草芽胞桿菌能顯著提高豬血清IL-10水平，為40.71%(P<0.01)，顯著降低血清IL-8和TNF-α水平，分別為27.54%(P<0.01)和22.85%(P<0.01)。

表2 日糧添加芽胞桿菌對(duì)斷奶仔豬血清細(xì)胞因子水平的影響

注：同行肩注字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Values with different letters in the same row mean very significant difference(P<0.01).

2.2 對(duì)血清豬瘟抗體阻斷率的影響

由表3可知，在致病性大腸埃希菌感染下，日糧添加枯草芽胞桿菌能提高豬瘟抗體阻斷率為34.18%，差異顯著(P<0.05)。

表3 日糧添加芽胞桿菌對(duì)斷奶仔豬豬瘟抗體阻斷率的影響

注：同行肩注字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Values with different letters in the same row mean very significant difference(P<0.05).

3 討論

芽胞桿菌屬于好氧菌或是兼性厭氧菌，以芽胞形式存在，可以耐受飼料加工儲(chǔ)藏和胃的酸性環(huán)境，在腸道內(nèi)具有高度穩(wěn)定性[4]。當(dāng)孢子進(jìn)入腸道后能夠快速復(fù)活，在生長(zhǎng)繁殖過程中消耗腸道內(nèi)大量的氧氣，造成腸道低氧和低pH，形成厭氧環(huán)境，利于厭氧菌的生長(zhǎng)，抑制病原菌的增殖，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，保持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，達(dá)到增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，改善健康狀況，促進(jìn)生長(zhǎng)的目的[4]。已有研究證明，芽胞桿菌制劑在仔豬上的應(yīng)用是安全的。仔豬日糧中添加芽胞桿菌后，血液紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)和血紅蛋白濃度正常，血清血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐和葡萄糖含量正常，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶含量正常[5]。

枯草芽胞桿菌是一種非特異性免疫刺激劑，其菌體或細(xì)胞壁成分能夠刺激動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，增加T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量，激活巨噬細(xì)胞，提高動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力[6]。枯草芽胞桿菌已經(jīng)作為新型天然綠色飼料添加劑，在畜禽飼糧中添加使用?？莶菅堪麠U菌在仔豬日糧中使用能夠顯著血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、補(bǔ)體3、補(bǔ)體4水平及仔豬小腸IgA分泌細(xì)胞的數(shù)量[7-8]。有報(bào)道，枯草芽胞桿菌能刺激豬腸道相關(guān)淋巴組織，處于一種高度的免疫準(zhǔn)備狀態(tài)，使免疫器官發(fā)育加快，枯草芽胞桿菌可使sIgA等免疫球蛋白分泌增強(qiáng)，提高免疫識(shí)別力[9-10]。疫苗免疫抗體滴度的高度同免疫器官指數(shù)的高低一樣，是評(píng)價(jià)動(dòng)物體抵抗力的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽胞桿菌能夠提高豬瘟抗體阻斷率，提高仔豬細(xì)胞免疫功能。這與前人的研究成果是相似的，吳偉等報(bào)道，斷奶仔豬日糧中添加芽胞桿菌制劑可顯著提高血清豬瘟抗體水平，對(duì)斷奶仔豬保護(hù)率達(dá)到100%[4]。用枯草芽胞桿菌發(fā)酵液灌服肉雞，可以提高雞新城疫和禽流感疫苗免疫效果，使抗體滴度維持在比較高的水平，增強(qiáng)肉雞對(duì)新城疫病毒和禽流感病毒的抵抗力[11]。

細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的低分子質(zhì)量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長(zhǎng)及組織修復(fù)等多種生物學(xué)功能。李云峰等[8]采用qPCR方法研究了芽胞桿菌對(duì)仔豬小腸細(xì)胞因子表達(dá)的影響，在仔豬0、7、14、26日齡灌服枯草芽胞桿菌，對(duì)照組灌服等量的生理鹽水，試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌能夠顯著地促進(jìn)十二指腸中細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)及回腸中細(xì)胞因子IL-1的表達(dá)。這說明飼喂枯草芽胞桿菌的仔豬其免疫狀態(tài)比較活躍。枯草芽胞桿菌能夠分泌的枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素、短桿菌肽和抗菌肽等活性物質(zhì)，對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用，并且多途徑刺激動(dòng)物免疫力的功效[7]。致病性大腸埃希菌是仔豬斷奶后遭受感染的主要病原體之一?？莶菅堪麠U菌對(duì)仔豬感染大腸埃希菌的保護(hù)作用目前還不清楚。本試驗(yàn)以致病性大腸埃希菌為模式病原，通過在仔豬飼糧中添加枯草芽胞桿菌來研究其對(duì)仔豬免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌能夠明顯降低仔豬血清中促炎性細(xì)胞因子IL-8和TNF-α水平，顯著提高仔豬血清中抗炎性細(xì)胞因子IL-10水平。說明仔豬飼料中添加枯草芽胞桿菌能夠提高仔豬的免疫功能，降低大腸埃希菌感染仔豬引起的炎癥反應(yīng)。

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Effects of AddingBacillussubtilisin Diet on Immune Function of Piglets Infected withEscherichiacoli

LI Hai-hua1,2,ZHU Qi1,2,BAI Peng-xun1,2,QIAO Jia-yun1,2，WANG Wen-jie1,2

(1.TianjinInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,Tianjin，300381，China; 2.TianjinEngineeringResearchCenterforLivestockandPoultryHealthBreeding,Tianjin,300381，China)

The paper was conducted to study the effects ofB.subtilison serum immune function of piglets infected withE.coliK88.All eight castrated “Duroc × Landrace × Yorkshire” piglets in this experiment had similar initial body weight (6.8 kg± 0.5 kg),and were divided into two groups (control group and test group).The piglets in control group were fed with the basal diet,and in the test group were fed with basal diet plusB.subtilis.All piglets were administered orally withE.coliK88.The levels of cytokines and antibody against CSFV in sera were measured by ELISA.The result showed that piglets fed withB.subtilishad greater serum IL-10 level (P<0.05),lower IL-8 and TNF-α concentrations (P<0.05) compared to piglets fed wirh the unsupplemented diet.Feeding aB.subtilisdiet increased the blocking rate of antibody against swine fever virus(P<0.05).The results indicated that feeding aB.subtilisdiet could regulate the serum immune function of piglets,and alleviate the inflammatory response caused byE.coliK88.This study provided a theoretical basis for the popularization and application ofB.subtilis.

B.subtilis;E.coli; cytokine; Classic swine fever;antibody blocking rate; swine

2016-06-14

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD39B01-3)

李海花(1981-)，女，河南周口人，助理研究員，博士，主要從事豬的免疫與營(yíng)養(yǎng)研究。*通訊作者

S852.43；S858.28

B

1007-5038(2017)01-0112-04