汪 萍，劉麗婭，金映紅，沙依蘭·卡依扎，陸桂麗，夏 俊，成 進

(新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，新疆烏魯木齊 830011)

一株雞源H9N2亞型禽流感病毒的致病性及其HA基因遺傳進化分析

汪 萍，劉麗婭，金映紅，沙依蘭·卡依扎，陸桂麗*，夏 俊，成 進

(新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，新疆烏魯木齊 830011)

為了解H9N2亞型禽流感病毒在新疆蛋雞養(yǎng)殖場的致病性及遺傳進化特點，對一株分離自蛋雞的禽流感病毒A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2)進行了致病性及遺傳進化分析。結果顯示，分離株的MDT為92 h，ICPI指數(shù)為1.125，IVPI指數(shù)為0.14，HA裂解位點處氨基酸序列為335RSSRGLF342，這些特征均證實該分離株為低致病性AIV。HA基因遺傳進化分析表明，該分離株在系統(tǒng)進化樹上與A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2)及3株野生鳥類新疆分離株的親緣關系最為接近，該分離株HA基因屬于歐亞譜系的A/chicken/Beijing/94(H9N2)和A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)的一個分支。

禽流感病毒；H9N2亞型；蛋雞；致病性；遺傳進化

近年來，國內(nèi)外對人及哺乳動物H9N2亞型禽流感病毒抗體的檢測顯示，人、豬、犬及貓等哺乳動物體內(nèi)均可檢出H9N2亞型AIV抗體[1-3]。目前，已有文獻報道的H9N2亞型AIV感染人的病例約17例，均未引起死亡[4-7]，但足以說明H9N2亞型AIV已經(jīng)具備感染人的能力。雖然該亞型病毒尚不能在人與人之間傳播，但存在和其他亞型病毒重組產(chǎn)生新毒株的潛在危害。2013年，我國H7N9亞型流感病毒流行，最終證實該病毒是H7病毒的HA基因、N9病毒的NA基因及H9N2病毒的6個內(nèi)部基因片段組成的重配病毒[8]。本研究對從新疆蛋雞養(yǎng)殖場產(chǎn)蛋下降雞體內(nèi)分離的一株H9N2亞型禽流感病毒(命名為A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2))進行致病力及分子流行病學特點研究，以分析新疆分離株產(chǎn)生變異的位點及新疆分離毒株HA基因在H9N2亞型禽流感分類中所處的分支，為新疆禽流感的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞胚 SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.1.2 病毒、載體和宿主細胞 H9N2亞型禽流感病毒(A/Chicken/Xinjiang/01/2010)和E.coli感受態(tài)細胞DH5α由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所病毒室保存；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要試劑 One Step RT-PCR Kit Ver.2、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、DNA Fragment Purification Kit Ver.2、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Ampicillin trihydrate，上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒致病性試驗

1.2.1.1 雞胚最小致死量的平均致死時間(MDT)測定 將分離株3代毒液用PBS稀釋液做10倍系列稀釋，接種10日齡SPF雞胚，連續(xù)7 d在相應接種時間記錄每一雞胚的死亡時間，并測定每胚尿囊液的HA活性，計算MDT值。1.2.1.2 腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)測定 將分離株3代毒液用PBS稀釋液1∶10稀釋后，經(jīng)腦內(nèi)接種10只1日齡SPF雞，每只接種 0.05 mL。連續(xù)8 d在相應時間觀察雞群發(fā)病、死亡情況，計算ICPI值。1.2.1.3 靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)測定 將分離株3代毒液用PBS稀釋液1∶10稀釋后，經(jīng)翅靜脈接種10只6周齡SPF雞，每只 0.1 mL。連續(xù)觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況。

1.2.2 HA基因的克隆

1.2.2.1 PCR引物設計與合成 根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的H9亞型禽流感病毒HA基因序列，用Oligo6.0軟件設計特異性引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列HA-U(5′-AGCAAAAgCAGGGGAATTT-3′)和HA-D(5′-TTATATACAAATGTTGCATCTGC-3′)。

1.2.2.2 RNA提取 吸取250 μL的雞胚尿囊液，按照 TRIZOL LS Reagent試劑盒使用說明書進行操作。

1.2.2.3 HA基因的RT-PCR擴增 以提取的5 μL RNA溶液做模板，應用HA-U和HA-D為引物進行RT-PCR反應，反應程序為：50℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行RT-PCR產(chǎn)物分析。

1.2.2.4 HA基因的鑒定 使用DNA Fragment Purification Kit Ver.2試劑盒對RT-PCR產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有10 mg/mL Amp+的LB瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜；隨機挑取單菌落接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)14 h；按照MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2試劑盒說明提取質(zhì)粒，并進行PCR鑒定，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。1.2.3 HA基因遺傳進化分析 應用MEGA6.06軟件對分離株HA序列與國內(nèi)外各AIV分支代表毒株的HA序列進行遺傳進化分析，參考毒株名稱及登錄號見表1。

表1 H9N2亞型AIV參考毒株

1.2.4 HA蛋白質(zhì)氨基酸序列分析 應用Lasergene7.1 DNA Star軟件對分離株的HA裂解位點、糖基化位點進行分析。

2 結果

2.1 MDT測定

接種10日齡SPF雞胚，該分離株可致雞胚死亡，胚體出現(xiàn)明顯的出血斑點(圖1)。MDT指數(shù)為92 h。

1、2.陰性對照；3、4.分離株感染雞胚

1 ，2.Negative control; 3，4.Isolated virus infected chicken embryos

圖1 分離病毒感染雞胚的病變

Fig.1 Isolated virus infected chicken embryos

2.2 ICPI測定

病毒接種1日齡SPF雞,1 d有1只雞發(fā)病，8 d共有10只雞發(fā)病死亡， ICPI指數(shù)為1.125。

2.3 IVPI測定

10只試驗雞10 d內(nèi)死亡2只，IVPI指數(shù)為0.14。表明該禽流感分離株為低致病力毒株，對雞具有弱致病性。

2.4 HA基因的克隆

2.4.1 RT-PCR擴增 用特異性引物成功擴增出大小約1.7 kb的目的片段，與預期大小相符(圖2)。

1.HA基因擴增產(chǎn)物；2.陰性對照；M.DNA標準DL 2 000

1.HA gene products；2.Negative control；M.DNA Marker DL 2 000

圖2 分離株HA基因RT-PCR擴增結果

Fig.2 RT-PCR amplification result of HA gene of isolated virus

2.4.2 HA基因的克隆與鑒定 目的片段連接于pMD18-T載體上(圖3)；以重組質(zhì)粒為模板，用上述特異性引物進行PCR鑒定，結果擴增出與預期大小一致的約1.7 kb的目的片段，表明HA基因已成功克隆到pMD18-T載體上。

2.5 HA基因遺傳進化分析

該分離株在系統(tǒng)進化樹上與A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2)及3株野生鳥類新疆分離株的親緣關系最為接近，其次與西北地區(qū)分離毒株，如陜西、寧夏、甘肅的H9N2亞型HA親緣關系較為接近。該分離株HA基因屬于歐亞譜系的Y280-Like 亞群的A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)和A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)的一個分支(圖4)。A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)是中國最早分離的H9N2亞型的代表毒株，具有中國大陸AIV的地域特點，對雞可產(chǎn)生較高的病死率。A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)僅對鼠有致病性。

2.6 HA蛋白氨基酸序列分析

HA裂解位點處氨基酸序列為335RSSRGLF342，為非連續(xù)的堿性氨基酸。存在8個糖基化位點分別為335RSSRGLF342，為非連續(xù)的堿性氨基酸。存在8個糖基化位點，分別為29NST、141NVS、218NRT、298NTT、305NVS、313NCS、492NGT、551NGS。與我國早期的分離株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)比較，A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2)、A/Chicken/Ningxia/1/2011(H9N2)、A/Chicken/shaanxixy/1/2012(H9N2)在第315位氨基酸由P突變?yōu)镾，增加了1個糖基化位點。

1、5.陽性克隆；2～4.陰性克??；M.DNA標準DL 15 000

1，5. Positive clones; 2-4.Negative clones；M.DNA Marker DL 15 000

圖3 HA基因克隆至pMD18-T載體的擴增產(chǎn)物

Fig.3 Amplification products of HA gene cloned pMD18-T vector

圖4 分離株與參考株HA基因遺傳進化分析

3 討論

我國對H9N2亞型禽流感的防控主要采取疫苗免疫預防的措施，但因其致病力較弱，感染后多表現(xiàn)為亞臨床癥狀而容易被忽視。近年來，H9N2亞型禽流感病毒不斷跨越種間屏障，感染人及哺乳動物，且存在與其他亞型流感毒株重組產(chǎn)生新致病株的可能性，給公共衛(wèi)生安全帶來重大隱患。因此，針對病毒的分子生物學特征開展研究很必要。HA基因是流感病毒重要的糖蛋白，且該基因發(fā)生突變常會引起病毒抗原性改變。該基因的裂解位點、受體結合位點以及糖基化位點發(fā)生變化可能會影響病毒毒力、致病性、吸附能力和感染宿主范圍[9-12]。

本試驗對一株分離自蛋雞的H9N2亞型AIV進行了致病性試驗，MDT指數(shù)、IVPI指數(shù)和ICPI指數(shù)均證明該毒株為低致病力毒株。HA基因序列分析表明，新疆分離株HA裂解位點處氨基酸序列為335RSSRGLF342，具有典型的低致病性毒株特點，該結論與致病性試驗結果一致。HA蛋白糖基化位點在315位的氨基酸發(fā)生了突變，使糖基化位點由7位增加到8位。另外，第234位氨基酸受體結合位點為由Q突變?yōu)長，表明病毒已經(jīng)可識別人呼吸道上皮細胞的唾液酸α 2,6-半乳糖，該分離株具有潛在感染人的能力[9,12-13]，應該引起足夠重視。

禽流感病毒新疆分離株致病力試驗及HA基因分子生物學分析證明該毒株為低致病力毒株，第234位氨基酸發(fā)生變異，與新疆AIV野鳥分離株、豬源分離株同處于一個小分支內(nèi)，親緣關系很近，新疆臨近省份的AIV分離株親緣關系也較近，提示根據(jù)地域特征制定針對野生鳥類、哺乳動物、家禽流感的綜合防控措施具有非常重要的意義。

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Pathogenicity and Phylogenetic Analysis of a H9N2 Subtype Avian Influenza Virus Isolated from Chicken

WANG Ping, LIU Li-ya, JIN Ying-hong, SHAYILAN·Ka-zha-yi, LU Gui-li, XIA Jun, CHENG Jin

(VeterinaryResearchInstitute,AnimalScienceAcademyofXinjiang,AnimalClinicalMedicineResearchCenter，AnimalScienceAcademyofXinjiang,Urumqi，Xinjiang，830011，China)

For understanding the pathogenicity and phylogenetic characteristics of avian influenza virus which isolated from laying hen in a egg chicken plant of Xinjiang,the pathogenicity and phylogenetic analysis of A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2) were studied.The results indicated that the MDT,ICPI and IVPI of the isolated strain were 92h,1.125 and 0.14,respectively.The cleavage site of HA was 335RSSRGLF342.All of the above indicated that the isolated strain was LPAIV.Phylogenetic analysis of HA gene showed that the isolated strain has close relationship with A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2) and other three AIV which isolated from wild bird in Xinjiang.The isolated strain belongs to the branch of A/chicken/Beijing/94(H9N2) and A/chicken/Hongkong /G9/97(H9N2).

Avian influenza virus; H9N2 subtype; laying hen; pathogenicity; phylogenetic analysis

2016-05-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201103008)

汪 萍(1979-)，女，安徽碭山人，學士，主要從事家畜傳染病診斷及人畜共患病研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2017)01-0041-04