韓肖敏曹玉鳳李秋鳳高艷霞李 妍李建國(guó)?

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001）

用體外產(chǎn)氣法評(píng)價(jià)玉米秸稈、稻草、玉米秸稈青貯與精料的組合效應(yīng)

韓肖敏1曹玉鳳1李秋鳳1高艷霞1李 妍2李建國(guó)1?

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001）

本試驗(yàn)旨在應(yīng)用體外產(chǎn)氣法研究玉米秸稈、稻草、玉米秸稈青貯與精料間的組合效應(yīng)。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行3次組合篩選試驗(yàn)：首先進(jìn)行玉米秸稈與稻草組合試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)玉米秸稈和稻草組合（玉米秸稈-稻草）比例；再進(jìn)行玉米秸稈-稻草與玉米秸稈青貯組合試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)玉米秸稈-稻草和玉米秸稈青貯組合（玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯）比例；最后進(jìn)行玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯與精料組合試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯與精料組合比例。各組合均分別以 100.0∶0、80.0∶20.0、60.0∶40.0、50.0∶50.0、40.0∶60.0、20.0∶80.0、0∶100.0進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)，每個(gè)組合設(shè)3個(gè)重復(fù)。利用體外產(chǎn)氣法分析不同飼料組合對(duì)48 h產(chǎn)氣量、干物質(zhì)消失率（DMD）、pH及微生物蛋白（MCP）、氨態(tài)氮（NH3-N）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度的影響。計(jì)算各組合的單項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（SFAEI）和多項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（MFAEI）。結(jié)果表明：1）各飼料以不同比例組合對(duì)產(chǎn)氣量均有顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01），玉米秸稈 ∶稻草、玉米秸稈-稻草∶玉米秸稈青貯、玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯∶精料產(chǎn)氣量的SFAEI分別在60.0∶40.0、40.0∶60.0、20.0∶80.0時(shí)達(dá)最大值；2）各飼料以不同比例組合對(duì)DMD也存在顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01），玉米秸稈 ∶稻草、玉米秸稈-稻草∶玉米秸稈青貯、玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯∶精料DMD的SFAEI分別在50.0∶50.0、40.0∶60.0、20.0∶80.0時(shí)達(dá)最大值；3）不同玉米秸稈-稻草-稻草∶精料對(duì)pH有極顯著影響（P＜0.01）；4）各飼料以不同比例組合對(duì)MCP濃度也存在顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01），玉米秸稈∶稻草、玉米秸稈-玉米秸稈青貯∶玉米秸稈青貯、玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯 ∶精料產(chǎn)氣量的SFAEI分別在80.0∶20.0、40.0∶60.0、20.0∶80.0時(shí)達(dá)最大值；5）各飼料以不同比例組合對(duì)NH3-N濃度也存在顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01），范圍在20.20～31.59 mg/dL；6）玉米秸稈與稻草組合的乙酸/丙酸和玉米秸稈-稻草-玉米秸稈青貯與精料組合丁酸濃度在各比例間差異不顯著（P＞0.05），各飼料以不同比例組合對(duì)其余VFA和TVFA濃度也存在顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01）。以MFAEI進(jìn)行評(píng)定各飼料組合的最優(yōu)比例如下：玉米秸稈與稻草為60.0∶40.0；玉米秸稈、稻草與玉米秸稈青貯為24.0∶16.0∶60.0；玉米秸稈、稻草、玉米秸稈青貯與精料為9.6∶6.4∶24.0∶60.0。

玉米秸稈；稻草；玉米秸稈青貯；精料；組合效應(yīng)

我國(guó)農(nóng)作物秸稈資源豐富，年產(chǎn)量可達(dá) 8.20億t［1］，但資源利用程度較低，造成資源浪費(fèi)［2］。作物秸稈因自身消化率低、可發(fā)酵氮源和過(guò)瘤胃蛋白質(zhì)低、生葡萄糖物質(zhì)低以及礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)障礙，致使不能被反芻動(dòng)物較好地利用［3］。因此，如何提高其飼用價(jià)值備受科技工作者和飼養(yǎng)者高度關(guān)注。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)秸稈的物理、化學(xué)及生物處理等研究，發(fā)現(xiàn)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與飼料間的組合有關(guān)，當(dāng)飼料間的互作使飼料中某種養(yǎng)分的利用率或采食量高于各飼料的加權(quán)值時(shí)說(shuō)明組合產(chǎn)生了正組合效應(yīng)［4-7］。利用飼料間的組合效應(yīng)促進(jìn)瘤胃發(fā)酵是提高稻草（RS）等秸稈類飼料利用率的重要措施之一［8-9］。

國(guó)內(nèi)外已對(duì)RS與玉米淀粉、玉米青貯和苜蓿，豆秸、花生秧和青貯玉米秸，復(fù)合處理麥秸、青貯玉米秸和精料（CC）等飼料間兩兩組合效應(yīng)進(jìn)行了研究［10-14］，篩選出了正組合效應(yīng)飼料組合。但對(duì)于玉米秸稈（CS）、RS、玉米秸稈青貯（CSS）及CC間的4種飼料間組合效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在結(jié)合飼料資源情況，研究CS、RS、CSS及CC以不同比例組合對(duì)體外產(chǎn)氣及人工瘤胃發(fā)酵特性的影響，探究飼料間的適宜搭配比例，為反芻動(dòng)物飼糧的配制和提高秸稈利用率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CS、CSS和CC均采自河北省保定市宏達(dá)奶牛場(chǎng)，RS采自河北省承德市隆化縣楓林牛場(chǎng)。樣品，經(jīng)65℃干燥制成風(fēng)干樣，粉碎過(guò)20目篩，密封保存以備用，3種秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，CC組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表1 玉米秸稈、稻草和玉米秸稈青貯的營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Nutrient levels of corn stalk，rice straw and corn stalk silage（DM basis） %

表2 精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 Composition and nutrient levels of CC（DM basis） %

1.2 試驗(yàn)用瘤胃液供體動(dòng)物

試驗(yàn)選擇健康狀況良好，體重約550 kg的裝有永久性瘤胃瘺管的閹牛3頭，每天飼喂全混合日糧（TMR）2次，自由飲水。瘤胃液供體牛飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表3。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素7水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。首先CS與RS進(jìn)行組合，篩選出CS與RS的最優(yōu)組合后再與CSS進(jìn)行組合，進(jìn)一步篩選出粗飼料最優(yōu)組合再與CC進(jìn)行組合。每個(gè)組合3個(gè)重復(fù)。飼料間不同的組合及比例見(jiàn)表4。

表3 瘤胃液供體牛飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 3 Composition and nutrient levels of the diet of fistulated steers（DM basis） %

表4 飼料間不同的組合及比例Table 4 Different combinations and proportions of feeds %

1.4 人工瘤胃裝置的準(zhǔn)備及測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 人工瘤胃裝置的準(zhǔn)備

采用ANKOM RFS氣體測(cè)量系統(tǒng)（美國(guó)ANKOM technology corporation），該系統(tǒng)由壓力傳感器模塊、250 mL產(chǎn)氣瓶、恒溫培養(yǎng)箱和帶特定軟件的計(jì)算機(jī)等組成。該軟件分為設(shè)置區(qū)、實(shí)時(shí)監(jiān)控區(qū)和記錄區(qū)3部分。監(jiān)控區(qū)可以顯示當(dāng)前模塊的狀況，并且根據(jù)響應(yīng)時(shí)間的變化而變化，記錄區(qū)可以顯示壓力、絕對(duì)壓力及電池容量的系統(tǒng)數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)通過(guò)無(wú)線傳輸連接多個(gè)容器，反映出的氣壓信息可以在計(jì)算機(jī)的電子表格中記錄，通過(guò)計(jì)算機(jī)交互界面記錄發(fā)酵指標(biāo)。

人工瘤胃緩沖液參照Goering等［16］的方法進(jìn)行配制。取520.2 mL蒸餾水、0.1 mL微量元素溶液（A）、208.1 mL緩沖溶液（B）、208.1 mL常量元素溶液（C）和1.0 mL刃天青溶液（D），于具塞玻璃瓶中，持續(xù)充入CO2氣體，置于恒溫水浴中預(yù)熱至39℃待用。臨用前加入62.4 mL還原劑溶液（E）并繼續(xù)充入CO2氣體，直至緩沖液從淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榻鼰o(wú)色即可。

A、B、C、D、E各溶液配制方法如下。

A：微量元素溶液，稱取CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g、FeCl3·6H2O 8.0 g于燒杯中，加入蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

B：緩沖溶液，稱取NH4HCO34.0 g、NaHCO335.0 g于燒杯中，加入蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

C：常量元素溶液，稱取 Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g、MgSO4·7H2O 6 g于燒杯中，加入蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

D：刃天青溶液，0.1%（m/V），100.0 mg刃天青蒸餾水溶解后定容至100 mL。

E：還原劑溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），稱取半胱氨酸鹽酸鹽625.0 mg溶解于95 mL蒸餾水中，然后再加入1 mol/L NaOH溶液 4 mL和 NaS2·9H2O 625.0 mg，用蒸餾水定容至100 mL。

在試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前采集供體閹牛瘤胃液1 000 mL，置于預(yù)先通有CO2的保溫瓶中，立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。把供體閹牛的瘤胃液混合均勻后經(jīng)4層紗布擠壓過(guò)濾于接收瓶中，置于39℃水浴中保存，并持續(xù)充入CO2以確保瘤胃液處于厭氧環(huán)境。

首先準(zhǔn)確稱量發(fā)酵底物1 g放入250 mL產(chǎn)氣瓶中，并將其置入39℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱30～60 min。然后再把接收瓶?jī)?nèi)的瘤胃液與提前配制的人工瘤胃緩沖溶液以體積比1∶4混合均勻后，準(zhǔn)確量取150 mL混合液置于提前預(yù)熱的每個(gè)產(chǎn)氣瓶中（邊操作邊通入CO2），之后應(yīng)繼續(xù)向各個(gè)產(chǎn)氣瓶通入CO22 min以保證厭氧環(huán)境，之后立即擰緊各個(gè)產(chǎn)氣瓶所對(duì)應(yīng)的傳感器模塊。將各個(gè)培養(yǎng)瓶在（39.0±0.5）℃的水浴搖床中進(jìn)行體外發(fā)酵48 h，同時(shí)做空白試驗(yàn)，即產(chǎn)氣瓶?jī)?nèi)不加入發(fā)酵底物，其他操作同上。

1.4.2 飼料營(yíng)養(yǎng)水平的測(cè)定

參照張麗英［17］飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。粗蛋白質(zhì)含量：采用凱氏定氮法，用丹麥FOSS凱氏定氮儀測(cè)定。粗脂肪含量：采用索氏浸提法，用索氏脂肪提取器測(cè)定。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量：采用范氏（Van Soest）分析法，用美國(guó)ANKOM A2000i全自動(dòng)纖維儀測(cè)定。鈣含量：采用高錳酸鉀滴定法，使用的儀器設(shè)備包括電爐、馬福爐、坩堝。磷含量：采用鉬黃比色法，用UVb-2102 PCS型紫外光可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4.3 產(chǎn)氣量的測(cè)定

用美國(guó)ANKOM RFS氣體測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定，該系統(tǒng)可以自動(dòng)記錄產(chǎn)氣發(fā)酵瓶發(fā)酵產(chǎn)生的壓力，由氣壓能轉(zhuǎn)換成氣體體積，根據(jù)理想氣體方程，計(jì)算產(chǎn)氣量：

式中：Vx為39℃產(chǎn)氣體積（mL）；Vj為產(chǎn)氣瓶頂部空間體積（mL）；Ppsi為氣體測(cè)量系統(tǒng)自動(dòng)記錄的壓力（kPa）。

記錄培養(yǎng)2、4、8、12、24、36、48 h的產(chǎn)氣體積，由各自產(chǎn)氣量以及氣壓進(jìn)行校正，減去空白發(fā)酵瓶產(chǎn)氣量即為產(chǎn)氣量。

1.4.4 干物質(zhì)消失率（DMD）的測(cè)定

在體外48 h發(fā)酵結(jié)束后，迅速將其放置碎冰中終止發(fā)酵，用已編號(hào)并稱重的尼龍布（50 μm）過(guò)濾后，再經(jīng)蒸餾水沖洗產(chǎn)氣瓶數(shù)次直至干凈，以確保產(chǎn)氣瓶?jī)?nèi)無(wú)殘留物，待瘤胃液過(guò)濾置于接受瓶中，然后將尼龍布小心無(wú)損地轉(zhuǎn)移到烘箱中以65℃烘48 h至恒重。

1.4.5 pH測(cè)定

采用UB-7型酸度計(jì)測(cè)定瘤胃液pH。

1.4.6 氨態(tài)氮（NH3-N）濃度測(cè)定

NH3-N濃度參照馮宗慈等［18］的比色法進(jìn)行測(cè)定。取發(fā)酵后瘤胃液 10 mL在 3 500～4 000 r/min離心10 min后，量取2 mL上清液置于15 mL試管內(nèi)，再加入8 mL 0.2 mol/L HCl搖勻，待測(cè)。用UV-2102 PCS型紫外光可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4.7 微生物蛋白（MCP）濃度測(cè)定

MCP的分離采用差速離心法［19］。方法為：將發(fā)酵培養(yǎng)后瘤胃液經(jīng)40～60 μm尼龍布過(guò)濾后，取25 mL于39℃、150×g離心15 min去除原蟲(chóng)和飼料大顆粒。之后準(zhǔn)確量取 20 mL上清液于4℃、16 000×g離心20 min以分離出細(xì)菌，棄去上清液后，用15 mL 0.85%生理鹽水重復(fù)洗滌2次，沉淀即為細(xì)菌組分。最后將高速離心收集的沉淀小心無(wú)損地轉(zhuǎn)移到消化管中，按凱氏定氮法，用丹麥FOSS凱氏定氮儀測(cè)定MCP濃度。

1.4.8 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度測(cè)定

VFA濃度參照王加啟［20］的氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。取發(fā)酵后瘤胃液5 mL，在10 000×g離心10 min，移取 1.5 mL上清液至離心管中，加0.15 mL 25%的偏磷酸，用渦流混合器搖勻，靜止30 min，在10 000×g下離心15 min，取上清液供氣相色譜儀（美國(guó)Agilent 7890A氣相色譜儀）測(cè)定。

1.4.9 組合效應(yīng)指數(shù)的計(jì)算

單項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（single factor associative effects index，SFAEI）與多項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（multiple factors associative effects index，MFAEI）參照王旭［21］所使用的方法計(jì)算，具體公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 2007初步處理后，再使用SPSS 19.0軟件的一般線性模型進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan氏SSR法多重比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CS與RS的組合效應(yīng)

2.1.1 不同比例組合對(duì)產(chǎn)氣量的影響

由表5可知，CS和RS以不同比例組合發(fā)酵結(jié)束后，其產(chǎn)氣量是隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且在同一時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量是隨CS比例的減少而減少。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，CS∶RS為100.0∶0的產(chǎn)氣量顯著或極顯著高于其他各比例（P＜0.05或P＜0.01）。發(fā)酵48 h時(shí)，產(chǎn)氣量隨著RS比例的增加而顯著降低（P＜0.01）。

2.1.2 不同比例組合對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

由表6可知，DMD及MCP、NH3-N濃度均隨組合中CS比例的增加而增加，DMD各組合間差異達(dá)顯著或極顯著水平（P＜0.05或P＜0.01），MCP、NH3-N濃度100.0∶0與80.0∶20.0組合間差異不顯著（P＞0.05），其余各組合間差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。各組合的pH差異不顯著（P＞0.05），其值變化范圍在6.72～6.85。

表5 CS與RS不同組合比例對(duì)不同體外發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)氣量的影響Table 5 Effects of different proportions of CS and RS on gas production at differentin vitrofermentation time mL/g

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），相同或無(wú)字母表示差異不顯著（P＞0.05）。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference（P＜0.05），and with different capital letter superscripts mean significant difference（P＜0.01），while the same or no letter superscripts mean no significant difference（P＞0.05）.The same as below.

表6 不同CS與RS組合比例對(duì)體外培養(yǎng)48 h DMD、pH及MCP、NH3-N濃度的影響Table 6 Effects of different proportions of CS and RS on DMD，pH and concentrations of MCP and NH3-N after fermented for 48 hin vitro

由表 7可知，乙酸、丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度隨RS比例的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在60.0∶40.0時(shí)達(dá)到最高值，分別為55.30、38.97、104.90 mmol/L，TVFA濃度顯著或極顯著高于其他組合（P＜0.05或P＜0.01）；丁酸濃度隨RS比例的增加總體呈增加趨勢(shì)，50.0∶50.0時(shí)達(dá)最高值11.94 mmol/L；乙酸/丙酸，各組合間差異不顯著（P＞0.05）。

表7 CS與RS不同比例組合對(duì)體外培養(yǎng)48 h培養(yǎng)液VFA濃度的影響Table 7 Effects of different proportions of CS and RS on VFA concentrations after fermented for 48 hin vitro

2.1.3 CS與RS的組合效應(yīng)

由表8可知，以SFAEI評(píng)估各指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣量、DMD、MCP、NH3-N均 在 CS∶RS為40.0∶60.0、20.0∶80.0出現(xiàn)負(fù)組合效應(yīng)，其余組合出現(xiàn)正組合效應(yīng)；而 pH則相反，在 CS∶RS為40.0∶60.0、20.0∶80.0出現(xiàn)正組合效應(yīng)，最大值為0.003 7；除丁酸在80.0∶20.0時(shí)為負(fù)組合效應(yīng)外，乙酸、丙酸和丁酸在各組合間均出現(xiàn)正組合效應(yīng)。以MFAEI評(píng)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，其效應(yīng)值隨CS比例的減少呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在60.0∶40.0出現(xiàn)最值，因此最優(yōu)CS∶RS為60.0∶40.0。

表8 CS與RS的組合效應(yīng)Table 8 Associative effects of CS and RS

2.2 CS-RS與CSS的組合效應(yīng)

2.2.1 不同比例組合對(duì)產(chǎn)氣量的影響

由表9可知，產(chǎn)氣量隨底物發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增加的趨勢(shì)。不同CS-RS∶CSS對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)氣量有極顯著影響（P＜0.01）。隨著CSS比例的增加，各時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)氣量先降低后略有升高。

2.2.2 不同比例組合對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

由表10可知，不同CS-RS∶CSS對(duì)DMD及MCP、NH3-N濃度有極顯著影響（P＜0.01）。隨CSS比例的增加，DMD降低，MCP濃度則增加，NH3-N濃度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，其變化范圍在19.88～24.95 mg/dL。各組合間pH差異不顯著（P＞0.05）。

表9 CS-RS與CSS的不同組合比例對(duì)不同體外發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)氣量的影響Table 9 Effects of different proportions of CS-RS and CSS on gas production at differentin vitrofermentation time mL/g

表10 CS-RS與CSS的不同組合比例對(duì)體外培養(yǎng)48 h DMD、pH及MCP、NH3-N濃度的影響Table 10 Effects of different proportions of CS∶RS and CSS on DMD，pH and concentrations of MCP and NH3-N after fermented for 48 hin vitro

由表11可知，不同CS-RS∶CSS對(duì)TVFA、各VFA濃度及乙酸/丙酸存在顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01）。乙酸濃度在CS-RS∶CSS為0∶100.0時(shí)達(dá)到最大值（39.30 mmol/L），極顯著高于為50.0：50.0時(shí)（P＜0.01）；丙酸和TVFA濃度均在 60.0∶40.0出現(xiàn)最高值，分別為 34.05、82.96 mmol/L；丁酸濃度及乙酸/丙酸變化范圍分別在9.67～12.09 mmol/L和1.14～1.98。

2.2.3 CS-RS與CSS的組合效應(yīng)

由表12可知，以SFAEI評(píng)定各指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣量、NH3-N均在40.0∶60.0、20.0∶80.0出現(xiàn)正組合效應(yīng)，其余比例為負(fù)組合效應(yīng)；DMD、pH、MCP以及丙酸在組合間均出現(xiàn)正組合效應(yīng)，而丁酸均為負(fù)組合效應(yīng)，乙酸在80.0∶20.0、60.0∶40.0出現(xiàn)正組合效應(yīng)，其余比例為負(fù)組合效應(yīng)。以MFAEI評(píng)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在40.0∶60.0出現(xiàn)最大值。因此，最優(yōu)CS-RS∶CSS為40.0∶60.0。

2.3 CS-RS-CSS與CC的組合效應(yīng)

2.3.1 不同比例組合對(duì)產(chǎn)氣量的影響

由表13可知，產(chǎn)氣量隨底物培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。就不同組合而言，同一發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量均隨CC比例的增加而增加，各組合間的差異極顯著（P＜0.01）。

表11 CS-RS與CSS的不同組合比例對(duì)體外培養(yǎng)48 h培養(yǎng)液VFA濃度的影響Table 11 Effects of different proportions of CS-RS and CSS on VFA concentrations after fermented for 48 hin vitro

表12 CS-RS與CSS的組合效應(yīng)Table 12 Associative effects of CS-RS and CSS

2.3.2 不同比例組合對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

由表14可知，不同CS-RS-CSS∶CC對(duì)DMD、pH及 MCP、NH3-N濃度存在極顯著影響（P＜0.01）。DMD及MCP、NH3-N濃度均隨CC比例的增加而增加，其值變化范圍分別為62.78%～82.08%、30.42 ～ 43.55 mg/dL、21.78 ～27.48 mg/dL。而pH則隨 CC比例的增加而降低，變化范圍在6.57～6.80。

由表15可知，不同CS-RS-CSS∶CC對(duì)TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸存在顯著或極顯著影響（P＜0.05或P＜0.01）。乙酸濃度、乙酸/丙酸均隨CC比例的增加而降低；而丙酸濃度隨CC比例的增加而增加，最高值為29.82 mmol/L；各組合間的丁酸濃度差異不顯著（P＞0.05）；TVFA濃度隨CC比例的增加而降低，CS-RS-CSS∶CC為100.0∶0時(shí)的 TVFA濃度比 0∶100.0的提高了9.08%（P＞0.05）。

2.3.3 CS-RS-CSS與CC的組合效應(yīng)

由表16可知，以SFAEI評(píng)定各指標(biāo)，產(chǎn)氣量、MCP在40.0∶60.0、20.0∶80.0出現(xiàn)正組合效應(yīng)；pH、丙酸及丁酸在各組合間均為正組合效應(yīng)；DMD在80.0∶20.0、60.0∶40.0，NH3-N在80.0∶20.0出現(xiàn)負(fù)組合效應(yīng)，其余比例均為正組合效應(yīng)；乙酸SFAEI變化范圍在-0.081 5～0.023 7。以MFAEI評(píng)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，40.0∶60.0時(shí)出現(xiàn)最大值，為0.111 6。因此，最優(yōu)CS-RS-CSS∶CC為40.0∶60.0。

表13 CS-RS-CSS與CC的不同組合比例對(duì)不同體外發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)氣量的影響Table 13 Effects of different proportions of CS-RS-CSS and CC on gas production at differentin vitrofermentation time mL/g

表14 CS-RS-CSS與CC的不同組合比例對(duì)體外培養(yǎng)48 h DMD、pH及MCP、NH3-N濃度的影響Table 14 Effects of different proportions of CS-RS-CSS and CC on DMD，pH and concentrations of MCP and NH3-N after fermented for 48 hin vitro

3 討 論

3.1 不同粗飼料與CC組合對(duì)產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量大說(shuō)明瘤胃微生物的活性高，對(duì)底物發(fā)酵越充分；若產(chǎn)氣量低，則是因底物中可供微生物發(fā)酵產(chǎn)物不足所致［22］。本試驗(yàn)中，3個(gè)不同飼料組合的產(chǎn)氣量均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而成增加趨勢(shì)，這與 Zerbini等［23］研究結(jié)果基本一致。再者，CS與RS組合、CS-RS-CSS與CC組合中的產(chǎn)氣量分別是隨CS、CC比例的增加而增加；除2、4 h外，CS-RS與CSS組合產(chǎn)氣量均隨CSS比例的增加而增加，原因可能是CS、CSS與CC含有易于發(fā)酵的底物，粗蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，而RS自身粗蛋白質(zhì)含量較低不足以供應(yīng)微生物生長(zhǎng)所需的氮源，進(jìn)而導(dǎo)致其產(chǎn)氣量隨RS比例的增加而降低。這與Zhang等［24］研究RS與苜蓿干草組合效應(yīng)結(jié)果類似，其產(chǎn)氣量的增加均是因發(fā)酵底物含有相對(duì)較高的粗蛋白質(zhì)含量，可提供充足的發(fā)酵底物所引起。

表15 CS-RS-CSS與CC的不同組合比例對(duì)體外培養(yǎng)48 h培養(yǎng)液VFA濃度的影響Table 15 Effects of different proportions of CS-RS-CSS and CC on VFA concentrations after fermented for 48 hin vitro

表16 CS-RS-CSS與CC的組合效應(yīng)Table 16 Associative effects of CS-RS-CSS and CC

3.2 不同粗飼料與CC組合對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響

DMD是表示反芻動(dòng)物機(jī)體消化利用飼糧中有機(jī)物能力的指標(biāo)。飼糧中的纖維含量是影響飼料降解性的關(guān)鍵因素［25］。本試驗(yàn)中不同飼料組合的DMD因底物組成成分的不同呈現(xiàn)出不同的規(guī)律，分別隨CS比例的降低而降低，隨CSS比例的增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，隨CC比例的增加而增加。原因可能是因?yàn)镃S比RS含有的纖維含量更適合瘤胃微生物的生長(zhǎng)，CS與RS組合又比單一CSS更有利于微生物發(fā)酵。從粗飼料與CC組合中，可以看出增加組合中CC比例提高了瘤胃微生物對(duì)飼料干物質(zhì)的消化率，說(shuō)明有利于微生物的生長(zhǎng)。

pH的高低是瘤胃能否正常發(fā)酵的關(guān)鍵性因素之一，保證瘤胃正常發(fā)酵所需的pH范圍為6～7［26］。試驗(yàn)中不同飼料組合的 pH均在適宜的范圍內(nèi)，這與Chen等［27］研究飼料間組合效應(yīng)的結(jié)果類似。

NH3-N濃度是合成MCP的主要限制性因素。在底物碳源充足情況下，適宜的NH3-N濃度可以確保瘤胃微生物正常生長(zhǎng)及繁殖。NH3-N濃度過(guò)高或過(guò)低均不適宜瘤胃微生物生長(zhǎng)，其濃度過(guò)高會(huì)造成氮源浪費(fèi)，濃度過(guò)低會(huì)降低瘤胃微生物活性，進(jìn)而降低MCP的合成［28］。本試驗(yàn)中不同飼料組合的NH3-N濃度為19.88～31.59 mg/dL，在有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的范圍內(nèi)［29-30］，這說(shuō)明其濃度可以確保瘤胃微生物的正常生長(zhǎng)，這與Deli等［31］研究結(jié)果一致。

MCP合成的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為能量和蛋白質(zhì)，其濃度在一定程度上可表明瘤胃微生物種群數(shù)量的多少［22］，以此來(lái)反映瘤胃微生物生長(zhǎng)繁殖的快慢及活性強(qiáng)弱。本試驗(yàn)中不同飼料組合的MCP濃度分別隨CS、CSS及CC比例的增加而增加，分析其原因可能是這三者養(yǎng)分含量相比較其他飼料高，可為瘤胃微生物供應(yīng)相對(duì)充足的營(yíng)養(yǎng)源。

VFA是反芻動(dòng)物瘤胃代謝的重要組成部分，約占機(jī)體總能量需要量的70%～80%，同時(shí)可反映瘤胃內(nèi)微生物活性的強(qiáng)弱，它是瘤胃發(fā)酵的關(guān)鍵指標(biāo)之一［32-33］。 乙酸是機(jī)體乳脂合成的主要原料，丙酸是機(jī)體合成葡萄糖的前體，這就說(shuō)明增加丙酸濃度可為機(jī)體供應(yīng)所需的大部分能量，對(duì)于提高反芻動(dòng)物的增重效率有重大意義。再者，VFA組成成分的高低主要因飼糧內(nèi)碳水化合物比例的差異所致，其數(shù)量和類型通過(guò)影響瘤胃內(nèi)微生物的發(fā)酵環(huán)境進(jìn)而影響VFA的濃度。本試驗(yàn)中不同飼料組合的乙酸濃度高于丙酸，究其原因可能是因反芻動(dòng)物吸收VFA遵循丁酸、丙酸、乙酸的速度，瘤胃內(nèi)VFA濃度的高低不因飼糧類型的差異而影響，這與Copani等［34］研究結(jié)果相一致。此外最優(yōu)粗飼料與CC組合效應(yīng)表明，乙酸濃度隨CC比例的增加而降低，而丙酸濃度則相反，乙酸/丙酸降低。這與孫國(guó)強(qiáng)等［14］研究結(jié)果一致。原因也許是高CC飼糧改變了瘤胃液中微生物區(qū)系及培養(yǎng)底物的發(fā)酵模式。

3.3 不同粗飼料與CC組合對(duì)組合效應(yīng)指數(shù)的影響

SFAEI僅僅是從某一指標(biāo)對(duì)飼料組合效應(yīng)進(jìn)行評(píng)定，難于對(duì)其做出較全面的評(píng)定；而MFAEI則是結(jié)合多個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)飼料組合效應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)定，其結(jié)果更具代表性。本試驗(yàn)中CS與RS的MFAEI，各組合均呈正組合效應(yīng)，比例為60.0∶40.0時(shí)出現(xiàn)最大正組合效應(yīng)；在最優(yōu)CS、RS與CSS的MFAEI，比例為40.0∶60.0時(shí)出現(xiàn)最大正組合效應(yīng)；而最優(yōu)粗飼料與 CC的 MFAEI，比例為40.0∶60.0時(shí)出現(xiàn)最大正組合效應(yīng)。出現(xiàn)上述正組合效應(yīng)的結(jié)果，原因也許是不同飼料間以適宜比例組合后，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)彼此相互作用進(jìn)而提高了底物的整體發(fā)酵程度，最大化地提高飼料的消化利用率。這與于騰飛等［35］研究結(jié)果基本類似。

4 結(jié) 論

①CS和RS最優(yōu)組合比例為60.0∶40.0。

②CS、RS與CSS的最優(yōu)比例為24.0∶16.0∶60.0。

③CS、RS、CSS與CC的適宜比例為9.6∶6.4∶24.0∶60.0。

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Associative Effects of Corn Stalk，Rice Straw，Corn Stalk Silage and Concentrate Evaluated by Gas Production Techniquein Vitro

HAN Xiaomin1CAO Yufeng1LI Qiufeng1GAO Yanxia1LI Yan2LI Jianguo1?
（1.College of Animal Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding071001，China；2.College of Veterinary Medicine，Hebei Agricultural University，Baoding071001，China）

This experiment was conducted to investigate the associative effects of corn stalk（CS），rice straw（RS），corn stalk silage（CSS）and concentrate（CC）.Single factor experiment was started with the screening for the optimal proportion of combination of CS and RS（CS-RS），which was subsequently recombined with CSS to screen the optimal proportion of combination of CS-RS and CSS（CS-RS-CSS），finally，CC was added to screen the optimal proportion of combination of CS-RS-CSS and CC.Every combination was testedin vitrowith the proportions of 100.0∶0，80.0∶20.0，60.0∶40.0，50.0∶50.0，40.0∶60.0，20.0∶80.0 and 0∶100.0 with 3 replicates，respectively.In vitrogas production method was performed to analyze 48 h gas production，dry matter disappearance rate（DMD），pH，and the concentrations of microbial crude protein（MCP），ammonia nitrogen（NH3-N）and volatile fat acids（VFAs），as well as to calculate single factor associative effects index（SFAEI）and multiply factors associative effects index（MFAEI）.The results showed as follows：1）feeds combined at different proportions had significant effects on gas production（P＜0.05 orP＜0.01），and SFAEI of gas production for CS∶RS，CS-RS∶CSS and CS-RS-CSS∶CC reached the biggest at the proportions of 60.0∶40.0，40.0∶60.0 and 20.0∶80.0，respectively；2）feeds combined at different proportions had significant effects on DMD（P＜0.05 orP＜0.01），and the optimal proportions of CS∶RS，CS-RS∶CSS and CS-RSCSS∶CC were 50.0∶50.0，40.0∶60.0 and 20.0∶80.0 according to the SFAEI，respectively；3）different proportions of CS-RS-CSS and CC had significant effects on pH（P＜0.01）；4）feeds combined at different proportions had significant effects on MCP concentration（P＜0.05 orP＜0.01），and the optimal proportions of CS∶RS，CS-RS∶CSS and CS-RS-CSS∶CC were 80.0∶20.0，40.0∶60.0 and 20.0∶80.0 according to the SFAEI，respectively；5）feeds combined at different proportions had significant effects on NH3-N concentration（P＜0.05 orP＜0.01）changing from 20.20 to 31.59 mg/dL；6）there were no significant differences in acetic acid/propionic acid among different proportions of combinations of CS and RS，and in butyric concentration among different proportions of combinations of CS-RS-CSS and CC（P＞0.05），and feeds combined at different proportions had significant effects on the rest VFA and TVFA concentrations（P＜0.05 orP＜0.01）.Using MFAEI to assess the optimal results of associative effect，it is conclude that the optimal proportions are as follows：CS∶RS is 60.0∶40.0；CS∶RS∶CSS is 24.0∶16.0∶60.0；CS∶RS∶CSS∶CC is 9.6∶6.4∶24.0∶60.0.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：699-711］

corn stalk；rice straw；corn stalk silage；concentrate；associative effects

S816

A

1006-267X（2017）02-0699-13

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.040

（責(zé)任編輯 王智航）

2016-07-12

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201503134）；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（16226604D）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金

韓肖敏（1989—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail：1031307070＠qq.com

?通信作者：李建國(guó)，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jgliauh＠sohu.com

?Corresponding author，professor，E-mail：jgliauh＠sohu.com