何柯新，王會敏，麥靜雯，邱萍英，徐鵬，張燁梓，洪劍浩，林裕龍

（1廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院／廣州市惠愛醫(yī)院，廣東 廣州510370；2廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院／廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

雙靶點沉默hTERT和Bi-1基因誘導人鼻咽癌細胞凋亡的初步研究

何柯新1，王會敏2，麥靜雯1，邱萍英1，徐鵬1，張燁梓1，洪劍浩1，林裕龍1

（1廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院／廣州市惠愛醫(yī)院，廣東 廣州510370；2廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院／廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

目的 利用RNA干擾阻抑hTERT和Bi－1基因的表達并誘導人鼻咽癌細胞的凋亡。方法 收集CNE-2Z細胞，設未處理組、Lip組、pcDNA3.1（+）／Lip對照組、TR／Lip組、TRs／Lip組、Bi-1／Lip組、Bi-1s／Lip組、TR-Bi-1／Lip組和TRs-Bi-1s／Lip組，采用MTT法觀察質粒載體及轉染試劑對CNE-2Z細胞生長增殖的影響；采用流式細胞術檢測CNE-2Z細胞凋亡，Hoechst 33258染色，采用熒光顯微鏡觀察鼻咽癌細胞形態(tài)學的變化。結果 TR、Bi-1和TR-Bi-1組的CNE-2Z細胞增殖能力顯著降低，且TR-Bi-1組的生長增殖能力最低 （P<0.05）；凋亡細胞有所增加。轉染TR、Bi-1和TR-Bi-1重組質粒48 h后，熒光顯微鏡下可見部分鼻咽癌細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學變化；而pcDNA3.1（+）、TRs、TRs-Bi-1s、Lip和未處理組則無明顯變化。結論 雙基因表達載體可以同時特異、有效地沉默hTERT和Bi－1兩種基因，與沉默單基因的效果相比較，雙基因沉默組鼻咽癌CNE-2Z細胞的增殖率受到明顯抑制。

RNA干擾；鼻咽癌；hTERT；Bi-1

鼻咽癌 （nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國華南地區(qū)的高發(fā)性惡性腫瘤疾病，研究［1-2］表明其發(fā)病除了與EB病毒感染、化學致癌物有關之外，與遺傳易感基因也有密切的關系。近年來，RNA干擾 （RNA interference，RNAi）的研究進展非常迅速，本課題將前期研究［3］已構建的靶向人類端粒酶末端逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriplase，hTERT）和Bax inhibitor－1（Bi－1）的siRNA雙基因表達載體轉染人鼻咽癌細胞株CNE－2Z，研究RNAi效應對人鼻咽癌細胞株CNE－2Z細胞凋亡誘導的作用，從而為鼻咽癌提供了新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器：TE 2000－E智能型倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司；8900型全自動熒光化學發(fā)光成像儀購自美國Alpha公司；Epics－XL型流式細胞儀購自美國Coulter公司；TC 2323型CO2孵箱購自美國SHELLAB公司；752型紫外光柵分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司分析儀器總廠。試劑：鼻咽癌細胞株CNE－2Z和真核細胞表達質粒pcDNA3.1（＋）由廣東醫(yī)學院生物化學和分子生物學研究所提供；真核細胞表達質粒系列（TR、TRs、Bi－1、Bi－1s、TR－Bi－1和TRs－Bi－1s）為自行構建；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；DMSO和PI購自Sigma公司；MTT購自Promega公司；細胞凋亡－Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測細胞增殖情況 設未處理組、Lip組、pcDNA3.1（＋）／Lip對照組、TR／Lip組、TRs／Lip組 （TR／Lip組陰性對照）、Bi－1／Lip組、Bi－1s／Lip組（Bi－1／Lip組陰性對照）、TR－Bi－1／Lip組和TRs－Bi－1s／Lip組（TR－Bi－1／Lip組陰性對照）。各組的質粒為0.2 μg，Lip為0.5 μL／孔，每組設4個平行孔。轉染細胞48 h后加入10 mg／mL MTT 10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μL／孔的DMSO，取出后于水平搖床上輕輕震蕩10 min，使紫色結晶物充分溶解，然后用酶標儀測定吸光度A570／630，結果取4個平行孔的均值，重復 3次實驗。腫瘤細胞抑制率 ＝ （1－各組實驗組A570／630／未處理組A570／630）×100%。

1.2.2 FCM檢測含各重組質粒誘導鼻咽癌細胞凋亡情況 設未處理組、Lip對照組、pcDNA3.1（＋）／Lip組、TR／Lip組、TRs／Lip組、Bi－1／Lip組、Bi－1s／Lip組、TR－Bi－1／Lip組和TRs－Bi－1s／Lip組。轉染CNE－2Z細胞48 h后，收集細胞，離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗三遍，然后加預冰冷的70%乙醇固定，漩渦震蕩使細胞分散開，放入4℃冰箱過夜保存。上機前離心，棄去固定液，用PBS洗三遍以徹底去除殘留的乙醇，加600 μL PI染料，室溫避光放置30 min，采用流式細胞儀檢測。

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色 實驗設未處理組、Lip對照組、pcDNA3.1（＋）／Lip組、TR／Lip組、TRs／Lip組、Bi－1／Lip組、Bi－1s／Lip組、TR－Bi－1／Lip組和TRs－Bi－1s／Lip組。收集轉染重組質粒48 h后的細胞，PBS洗3次，加入0.5 mL固定液，4℃過夜。去除固定液，PBS洗2次，3 min／次。加入0.5 mL Hoechst 33258染色5 min，去除染色液，PBS洗2次，3 min／次。加抗熒光淬滅劑于6孔板內(nèi)，紫外光激發(fā)、熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)以區(qū)分天然細胞、凋亡細胞及壞死細胞。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，預先用Homogeneity of Variances進行方差齊性檢驗，如方差齊采用LSD檢驗和S－N－K檢驗，如方差不齊采用Tamhane＇s T2檢驗。P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各干擾質粒對鼻咽癌細胞株生長增殖的影響 轉染相應質粒48 h后，用MTT比色法檢測CNE－2Z細胞增殖抑制率，結果見表1。Lip對照組、pcDNA3.1（＋）／Lip對照組、TR－Bi－1／Lip組與未處理組比較均無統(tǒng)計學差異 （P>0.05）；各干擾質粒／Lip組與未處理組比較有顯著統(tǒng)計學差異 （P<0.01），提示針對hTERT和Bi－1基因設計的siRNA序列對CNE－2Z細胞的生長增殖有一定影響。其中以 TR－Bi－1／Lip組 （雙基因表達載體組）的抑制效果最好，在CNE－2Z細胞中的抑制率達到（49.00±3.75）%，這也說明了構建的雙基因表達載體在抑制CNE－2Z細胞生長增殖方面具有更強的能力。

表1 Lip和各質粒對CNE-2Z細胞生長的抑制作用比較 （±s）

表1 Lip和各質粒對CNE-2Z細胞生長的抑制作用比較 （±s）

注：與未處理組比較，**P＜0.01。

組別 n A570／630 增長率（%） 抑制率（%）Lip組 4 1.87±0.04 97.72±2.44 2.28±2.44 pcDNA3.1（＋）／Lip組 4 1.87±0.07 96.84±3.61 3.16±3.61 TR／Lip組 4 1.14±0.14 59.11±7.14 40.89±7.14**TRs／Lip組 4 1.88±0.10 97.35±5.14 2.65±5.14 Bi－1／Lip組 4 1.23±0.16 63.88±8.13 36.12±8.13**Bi－1s／Lip組 4 1.87±0.23 96.78±12.00 3.22±12.00 TR－Bi－1／Lip組 4 0.98±0.07 51.00±3.75 49.00±3.75**TRs－Bi－1s／Lip組 4 1.89±0.14 97.89±7.15 2.11±7.15 4 1.93±0.29 100.03±6.93 －未處理組

2.2 各重組質粒誘導鼻咽癌細胞的凋亡 PI為定量細胞化學熒光染料，能插入雙鏈DNA和RNA的堿基對之間；每隔5個堿基插入一個PI分子。經(jīng)RNA酶消化后與DNA特異結合，以特定波長 （340 nm）激發(fā)，可發(fā)射紅色熒光（620 nm）。核酸分子越大，則插入的PI分子越多，熒光強度越大。流式細胞術分析就是根據(jù)這一原理，計數(shù)一定量的個體（細胞或凋亡小體），根據(jù)熒光強度推斷核酸分子大小。因此可了解細胞DNA含量變化及分布。凋亡細胞經(jīng)PI染色后，流式細胞儀檢測到G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰，此峰為凋亡峰，其峰值的高低代表凋亡細胞數(shù)量的多少。轉染CNE－2Z細胞48 h后，TR／Lip組、Bi－1／Lip組、TR－Bi－1／Lip組均可見細胞凋亡，凋亡率分別達到（13.5± 2.5）%、 （8.6±2.9）%和（17.3±2.1）%，而未處理組、Lip組和pcDNA3.1（＋）／Lip組、TRs／Lip組、Bi－1s／Lip組和TRs－Bi－1s／Lip組幾乎無凋亡峰出現(xiàn)，見圖1。

圖1 各重組質粒作用CNE-2Z細胞48h后細胞凋亡情況

2.3 Hoechst 33258熒光染色結果 Hoechst 33258能特異地與雙鏈DNA中富含AT的區(qū)域結合，因此能將細胞的胞核染色，在355 nm激發(fā)光下發(fā)出藍色熒光。經(jīng)Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡下可見對照組細胞的染色質密度均勻一致，呈彌散均勻的熒光。而轉染重組質粒后，較多細胞表現(xiàn)出典型的細胞凋亡特征性變化：熒光增強，胞核縮小碎裂，呈大小不等的不規(guī)則塊狀、圓形或花瓣狀的細胞碎片，結果見圖2。在CNE－2Z細胞中，與未處理組、Lip組、pcDNA3.1（＋）／Lip組及亂碼／Lip組細胞形態(tài)比較，TR／Lip組、Bi－1／Lip組和TR－Bi－1／Lip組在轉染48h后出現(xiàn)較為典型的凋亡形態(tài)學改變。

圖2 各重組質粒作用CNE-2Z細胞48h后的形態(tài)學改變（200×）

3 討論

基因治療作為21世紀基因組學的一個重要發(fā)展方向，正在不斷發(fā)展和完善。隨著人類基因組詳細圖譜的問世，新的治療基因不斷被發(fā)現(xiàn)，因此對靶基因的選擇將更加廣泛。

Cioca等［4］在運用RNAi技術誘導白血病細胞 （分別選用HL－60、THP－1、U937和K562細胞株）凋亡時，以c－raf和bcl－2基因為靶基因，結果發(fā)現(xiàn)單沉默c－raf基因只能阻止單核白血病細胞分化，而同時沉默 c－raf和bcl－2基因，不但誘導了HL－60、THP－1、U937白血病細胞株發(fā)生凋亡，而且還增加了這些癌細胞對抗癌藥物的敏感性。近年來，應用RNAi技術靶向hTERT、LMP－1、bcl－xL基因對鼻咽癌進行基因治療取得了一定成果［5－8］，表明運用RNAi技術阻抑某些癌基因表達在誘導某些癌細胞凋亡、抑制其復發(fā)和遠處轉移具有一定意義。研究［9－12］表明，鼻咽癌細胞中的確存在多個癌基因的異常表達，如bcl－2、survivin、bcl－xL、cyclinD1、ras和c－myc等的過度表達，因此只針對個別基因進行基因治療不可能徹底治愈腫瘤。本課題組近年來一直從事鼻咽癌研究［5,8］：分別靶向轉染bcl－xL和hTERT基因的干擾質粒能阻抑抗凋亡蛋白bcl－xL和hTERT的表達，有效引起鼻咽癌細胞株CNE－2Z生長和增殖減緩，并可誘導部分鼻咽癌細胞凋亡。因此，將pcDNA3.1（＋）系列重組質粒轉染到鼻咽癌細胞株CNE－2Z中，在細胞中經(jīng)轉錄形成shRNA，期望可誘導鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡。

MTT實驗表明，TR－Bi－1／Lip組與TR／Lip組、Bi－1／Lip組均都可抑制CNE－2Z細胞的增殖，但由于TR－Bi－1／Lip組同時沉默了hTERT和Bi－1兩種癌基因，所以抑制CNE－2Z細胞增殖的能力更強。流式細胞儀檢測CNE－2Z細胞凋亡實驗中，TR－Bi－1／Lip組的凋亡峰最高，凋亡細胞數(shù)也最多，這與MTT的結果相一致。在細胞形態(tài)學方面，CNE－2Z細胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡下觀察到，TR－Bi－1／Lip組、TR／Lip組和Bi－1／Lip組三組中的細胞都呈現(xiàn)出凋亡的形態(tài)，而TR－Bi－1／Lip組中細胞凋亡形態(tài)更明顯，數(shù)量也更多。

本研究所構建的雙基因表達載體在兩種基因互不產(chǎn)生拮抗作用的前提下能同時沉默兩個基因，與未處理組和對照組相比，所誘導的細胞增殖得到最大的抑制效果，凋亡細胞數(shù)也明顯增多，也證實了同時沉默多個基因的方案是可行的。因此在今后的研究工作中，運用RNAi技術同時沉默鼻咽癌細胞中多個不同的凋亡抑制因子，以期通過不同的凋亡途徑共同誘導鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡，增加誘導鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡的比例，使鼻咽癌的基因治療具有更加光明的前景。

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（責任編輯：常海慶）

Preliminary Study on Apoptosis of Human Nasopharyngeal Carcinoma Cells Induced by Dual Targeted Silencing GeneshTERT and Bi-1

HE Kexin1,WANG Huimin2,MAI Jingwen1,QIU Pingying1,XU Peng1,ZHANG Yezi1,HONG Jianhao1,LIN Yulong1(1The Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University/Guangzhou Huiai Hospital,Guangzhou 510370,China;2The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine/Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510120,China)

ObjectiveTo explore RNA interference inhibiting hTERT and Bi-1 gene expressions and inducing the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsCNE-2Z cells were collected and divided into untreated group,Lip group,pcDNA3.1(+) /Lip group,TR/Lip group,TRs/Lip group,Bi-1/Lip group,Bi-1s/Lip group,TR-Bi-1/Lip group and TRs-Bi-1s/Lip group.MTT assay was applied to observe plasmid vectors and proliferation of CNE-2Z cells affected by the transfection.Flow cytometry(FCM)was used to detect the apoptosis of CNE-2Z cells.The apoptosis and morphologic changes of CNE-2Z cells with Hoechst 33258 staining were analyzed with fluorescence microscope.ResultsThe proliferation significantly decreased in TR,Bi-1 and TR-Bi-1 groups,and was lowest in TR-Bi-1 group(P＜0.05).The apoptotic cells increased.After 48-hour transfection for TR,Bi-1 and TR-Bi-1 recombinant plasmids,the typical morphological apoptosis changes of some nasopharyngeal carcinoma cells were found with fluorescence microscope,but not in pcDNA3.1 (+),TRs,TRs-Bi-1s,Lip and untreated group.ConclusionsDual-gene coexpression vectors can inhibit the expressions of hTERT and Bi-1 genes specifically and effectively.Dual-gene silence groups inhibit the proliferation of CNE-2Z cells more significantly than single-gene silence group.

RNA interference;Nasopharyngeal carcinoma;hTERT;Bi-1

R739.6

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.01.0023

2016－08－12

2016－10－11

廣東省中醫(yī)藥局科研項目 “綠茶提取物靶向HIF-α的抗阿爾茨海默病Aβ生成及其機制的研究” （項目編號：20161092）

何柯新 （1982－），男，碩士研究生學歷，主管技師，研究方向：臨床生物化學與生物化學檢驗。