吳志豪， 劉海斌， 鄭 敏

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科，浙江 溫州 325000)

K-ras對girdin蛋白表達的調(diào)控機制及二者在結直腸癌中的表達

吳志豪， 劉海斌， 鄭 敏△

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科，浙江 溫州 325000)

目的： 研究K-ras對COS7細胞girdin蛋白的調(diào)控機制，并檢測結直腸癌組織中k-ras和girdin的表達。方法: 通過病毒載體構建穩(wěn)定高表達K-ras的COS7細胞，采用Western blot方法檢測穩(wěn)定細胞株和結直腸癌組織中K-ras、girdin及其相關蛋白的表達。結果: 高表達K-ras的COS7細胞形態(tài)不規(guī)則。Western blot實驗結果顯示在高表達K-ras時其下游的信號蛋白p-ERK1/2和p-Stat3的蛋白水平都明顯增加，同時girdin的表達量也明顯增加；當加入K-ras siRNA后，p-ERK1/2、p-Stat3和girdin的表達量也隨之減少。對7例結直腸癌組織和相應癌旁組織用Western blot檢測結果顯示，有5例組織在K-ras高表達的同時girdin的表達量也隨之增加。結論: 通過細胞和組織實驗結果推測K-ras蛋白通過Ras-ERK1/2-Stat3信號通路實現(xiàn)對girdin蛋白的調(diào)控，并為臨床上與K-ras相關的腫瘤治療提供一定的參考。

K-ras； Girdin； 結直腸癌

K-ras是最早被發(fā)現(xiàn)的人類原癌基因之一，與H-ras、N-ras合稱為Ras基因家族。K-ras基因編碼含有189個氨基酸共21.5 kD的膜結合型K-ras蛋白[1]。正常情況下，細胞中K-ras蛋白作為一個分子開關，調(diào)控細胞的生長和增殖。但當K-ras基因出現(xiàn)變異或表達失控時，K-ras蛋白會處于持續(xù)激活狀態(tài)，進而將激活Ras-Raf-絲裂原激活蛋白激酶的激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MEK)-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)這條信號通路，導致細胞的異常增生，促使腫瘤形成。到目前為止，關于K-ras基因的突變或表達失控與胰腺癌、結直腸癌以及肺癌發(fā)生之間的相關性已經(jīng)研究得比較透徹了[2-4]。此外，對于K-ras基因上調(diào)與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力之間的聯(lián)系也有報道[5]。

Girdin蛋白是最近十年才開始被深入研究的細胞內(nèi)蛋白。目前報道表明，girdin蛋白在多種腫瘤組織中表達明顯增加，包括食管癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌及肺癌等[6-7]。而且，在高侵襲力及高轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細胞中，girdin的表達明顯增加，特別是在結腸癌和胰腺癌中更為明顯[7]。所以在本實驗開始之前，我們就提出了K-ras蛋白和girdin蛋白之間可能存在某種信號通路聯(lián)系的假設。針對這個假設我們設計了如下實驗對這兩個蛋白之間的信號通路及分子機制進行了探索和研究。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

本實驗所涉及的試劑除特意指出外均購自Sigma。抗K-ras鼠單克隆抗體、girdin兔多克隆抗體、K-ras siRNA均購自Santa Cruz ；抗p-ERK1/2、Stat3兔單克隆抗體、抗ERK1/2兔多克隆抗體、抗p-Stat3鼠單克隆抗體均購自Cell Signaling；抗GAPDH 兔單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；K-ras ORF 質(zhì)粒購自Origen；Lenti-X Lentiviral Expression Systems及pLVX-IRES-Hyg 病毒載體購自Clontech；XhoI限制性內(nèi)切酶、SpeI限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa；切膠回收試劑盒購自北京博邁德公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；ECL化學發(fā)光液購自北京康為世紀公司；ECL Plus超敏發(fā)光液購自北京索萊寶公司；抗體稀釋液購自Calbiochem。

2 細胞系和組織標本

COS7細胞株購自北京協(xié)和細胞資源中心。7例結直腸癌組織標本均來自溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科，其中的對照組織均為所對應的同一患者癌旁5 cm處的正常組織。手術中切除的組織立即放于液氮中保存。本實驗所用標本，術前均告知患者及其家屬，并簽署了知情同意書。

3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱為SANYO產(chǎn)品；半干轉(zhuǎn)膜儀為Bio-Rad產(chǎn)品；多功能成像分析系統(tǒng)為CellBioscience產(chǎn)品；Western blot灰度分析軟件為Ipwin32。

4 實驗方法

4.1 K-ras ORF序列的擴增及酶切位點的引入

K-ras isoform-a的ORF序列來自GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M54968.1)。在PCR過程中通過上、下游引物(K-ras的上游引物為5’-gcggCTCGAGatgactgaatataaac-3’，下游引物為5’-gccgcACTAGTttacattataatg-3’)分別在上、下游引入XhoI和SpeI酶切位點，PCR反應體系為 5×primer buffer 6 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Primer star 0.3 μL，K-ras ORF(400 mg/L)0.2 μL，加dH2O至總反應體系為 30 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，通過切膠回收試劑盒進行回收，整個過程完全按照試劑盒所提供的說明書操作。

4.2 K-ras病毒載體的構建及擴增 pLVX-IRES-Hyg病毒空載體使用XhoI和SpeI 2個限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切后產(chǎn)物使用純化試劑盒進行純化。將上一步純化的PCR產(chǎn)物和酶切后的空載體連接，連接過程完全按照試劑盒所提供的說明書操作。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞DH5α中進行擴增。用含有氨芐抗性的LB平板篩選陽性克隆，進行擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒。

4.3 病毒的包被、侵染及高表達K-ras蛋白的單克隆細胞株的篩選 用HEK293細胞包裝病毒，整個轉(zhuǎn)染過程完全嚴格按照Lenti-X Lentiviral Expression Systems轉(zhuǎn)染試劑盒中所提供說明書進行。收獲的病毒上清用0.45 μm的無菌濾膜過濾后馬上轉(zhuǎn)導COS7細胞。24 h后更換1次培養(yǎng)基，48 h后更換為含有500 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基。此后每48 h更換1次含有潮霉素的培養(yǎng)基，直至最后篩選出高表達K-ras蛋白的單克隆細胞株。

4.4 Western blot法檢測細胞中相應蛋白的表達 高表達K-ras蛋白的單克隆細胞株在10 cm的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，當細胞融合度達到80%左右時，在冰上用1 mL RIPA裂解液對細胞進行裂解，獲得全細胞裂解液。用BCA定量試劑盒對全細胞裂解液蛋白濃度進行測定。取35 μg(檢測girdin蛋白時上樣量增至60 μg)蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，而后采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入5%脫脂奶粉稀釋的Ⅰ抗(GADPH稀釋比例為1∶10 000，girdin稀釋比例為1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次后加入5%脫脂奶粉稀釋的Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，于多功能成像分析儀中檢測。

4.5 Western blot法檢測組織中相應蛋白的表達 取約200 mg組織于1 mL RIPA裂解(含PMSF 100 mg/L)中，在冰上剪碎并超聲裂解，每次超聲時間為3 s，暫停10 s，至組織完全裂解為止，最后離心取上清(12 000×g，4 ℃，20 min)?？紤]到組織中girdin蛋白的含量較低，所以在進行SDS-PAGE時取最大上樣體積量，各個樣品之間的差異通過內(nèi)參照GAPDH進行調(diào)整。為了增加檢測的敏感度，組織樣品孵育時采用了Calbiochem的抗體稀釋液以及北京索萊寶公司的ECL Plus超敏發(fā)光液，除此之外,其它均與細胞樣品處理過程一樣。

4.6 細胞劃痕實驗 取約5×105個細胞均勻地鋪于6孔板中，過夜培養(yǎng)，使融合率達到100%。使用10 μL的無菌槍頭在培養(yǎng)皿中輕輕的劃痕，然后用PBS洗滌，去除被劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。期間需測量原始劃痕和愈合后劃痕的寬度。

5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；人結直腸癌及其癌旁組織中girdin及K-ras的比較采用兩配對樣本的非參數(shù)檢驗方法；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 轉(zhuǎn)染K-ras基因后細胞形態(tài)學的變化

高表達K-ras蛋白的單克隆細胞株在細胞形態(tài)學上發(fā)生了明顯的變化。與正常的COS7細胞以及轉(zhuǎn)染空載體的細胞相比，高表達K-ras蛋白的單克隆細胞株細胞表現(xiàn)出不規(guī)則形態(tài)，見圖1。

Figure 1.The morphological changes of COS7 cells transfected withK-ras(×100). A: control; B: COS7 cells transfected with empty vector; C: COS7 cells transfected withK-ras.

圖1 COS7細胞在轉(zhuǎn)染K-ras基因前后細胞形態(tài)的變化

2 高表達或抑制K-ras蛋白后對下游相應信號蛋白的影響

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，高表達K-ras蛋白的細胞株中girdin蛋白的表達量明顯要比對照組高。因此,為了探究K-ras蛋白和girdin蛋白之間聯(lián)系，本實驗特意對K-ras的下游信號通路和girdin的上游信號通路進行了逐一檢測。由圖2可見，在K-ras高表達時，其下游的p-ERK1/2和p-Stat3的蛋白水平明顯增加，但ERK1/2和Stat3總量未有明顯變化。在高表達K-ras的細胞株中再次轉(zhuǎn)染K-ras siRNA以抑制K-ras的表達，其下游的p-ERK1/2和p-Stat3蛋白水平明顯減少，而且girdin也隨之減少，見圖3。

3 轉(zhuǎn)染K-ras后細胞遷移能力的變化

本次實驗采用了細胞劃痕法對高表達K-ras的COS7細胞株的遷移能力進行了檢測。如圖4所示， COS7_K-ras細胞株在18 h后的相對遷移率，要快于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的COS7細胞株，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Figure 2.The protein levels in the COS7 cells with K-ras over-expression determined by Western blot. COS7_V: COS7 cells transfected with empty vector; COS7_K-ras: COS7 cells transfected with K-ras. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCOS7;##P<0.01vsCOS7_V.

圖2 正常COS7細胞、轉(zhuǎn)染空載體的COS7細胞及高表達K-ras蛋白的COS7細胞的Western blot檢測結果

Figure 3. The effect of K-ras siRNA on the protein levels in the COS7 cells with K-ras over-expression determined by Western blot. COS7_K-ras: COS7 cells transfected with K-ras; COS7_siRNA_K-ras: COS7 cells transfected with K-ras siRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCOS7_K-ras.

圖3 高表達K-ras蛋白的COS7細胞在轉(zhuǎn)染K-ras siRNA前后的Western blot檢測結果

Figure 4. The results of scratch wound assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCOS7_V.

圖4 COS7_V和COS7_K-ras細胞株的細胞劃痕實驗結果

4 結直腸癌組織中K-ras和girdin蛋白的關系

此外，本次實驗選取了7例結直腸癌組織及其癌旁組織進行K-ras和girdin蛋白的檢測。結果顯示：其中4例癌組織K-ras和girdin的表達量都要高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義；1例癌組織K-ras的表達量都要高于癌旁組織，但是girdin沒有明顯差異；還有1例組織，其癌旁組織中K-ras的表達量要高于癌組織，同時其girdin蛋白也是如此。說明二者之間或許存在某種聯(lián)系?？傮w來說，在選取的7例組織中，癌組織的girdin及K-ras的表達要高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

討 論

在本實驗中以高表達K-ras蛋白的COS7細胞作為研究對象，對K-ras蛋白和girdin蛋白之間的信號通路進行了詳細的闡述。當K-ras蛋白高表達時其下游的p-ERK1/2是明顯增加，這與Cagnol和Miller等的研究結果一致[8-9]。根據(jù)Gough等[10]報道，當ERK1/2被激活時,其下游的Stat3也會隨之被激活，這也與本實驗的結果相符。Dunkel等[11]研究表明Stat3蛋白和girdin蛋白之間存在著一個相互作用的結合位點，并且當2個蛋白之中的任意一個激活時都可以促使另一個蛋白的上調(diào)。結合本實驗中Western blot實驗結果，我們認為K-ras對girdin的調(diào)控可能是通過K-ras-ERK1/2-Stat3-girdin這條信號通路完成。此外結腸癌組織的結果也在一定程度上說明在癌組織中二者之間存在關聯(lián)。但girdin蛋白除受K-ras蛋白調(diào)控之外肯定還是受到其它信號通路的影響，所以會出現(xiàn)組織的差異，例如Enomoto等[12]所發(fā)現(xiàn)的PI3K-AKT信號通路可能就是其中之一。

Figure 5.The protein expression of girdin and K-ras in the colorectal carcinoma and their adjacent tissues. C: colorectal cancer tissues; P: pericarcinous tissues. Mean±SD.n=7.*P<0.05vspericarcinous tissues.

圖5 人結直腸癌及其癌旁組織Western blot結果

本實驗發(fā)現(xiàn)，在高表達K-ras后COS7細胞四周出現(xiàn)了明顯不規(guī)則形狀，而且細胞的遷移能力也明顯增加。Jiang等[6]通過動物模型研究發(fā)現(xiàn)，girdin在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程中起到了關鍵的作用，此外也有研究也表明在具有高度轉(zhuǎn)移能力的結腸癌和胰腺癌中girdin蛋白的表達量是明顯增加的[7]，這些都與細胞劃痕實驗結果相一致。所以我們認為本實驗中girdin蛋白的上調(diào)是細胞遷移能力增強的原因之一。

本實驗首次將K-ras蛋白和girdin蛋白之間的信號通路進行了搭建，也比較明確地闡述了K-ras蛋白、girdin蛋白以及細胞遷移能力之間的聯(lián)系，可以為臨床上結腸癌、胰腺癌以及乳腺癌等一些與K-ras相關的腫瘤的治療提供一定的參考。在本實驗的基礎上深入研究K-ras基因的突變與girdin蛋白之間的聯(lián)系以及這2個蛋白之間的相關性將是我們以后的目標。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Regulatory mechanisms of K-ras to girdin in COS7 cells and expression of K-ras and girdin in colorectal carcinoma

WU Zhi-hao, LIU Hai-bin, ZHENG Min

(DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:1018885905@qq.com)

AIM: To investigate molecular regulatory mechanism of K-ras to girdin protein in COS7 cells and expression of K-ras and girdin in colorectal carcinoma tissues. METHODS: The lentiviral vector carryingK-rasgene was constructed and transfected in the COS7 cells. The expression of K-ras, girdin proteins and other related proteins in COS7 cells and colorectal carcinoma tissues was observed by Western blot. RESULTS: The COS7 cells with K-ras over-expression showed an irregular cell morphology. The results of Western blot indicated that the downstream signal protein levels of p-ERK1/2, p-Stat3 and girdin were significantly increased in the COS7 cells with K-ras over-expression. Transfection with the K-ras siRNA into the COS7 cells significantly reduced the protein levels of p-ERK1/2, p-Stat3 and girdin. In the colorectal carcinoma tissues (7 cases), 5 cases had higher expression of K-ras and girdin compared with pericarcinous tissues. CONCLUSION: K-ras regulates girdin expression through the signal pathway of K-ras-ERK1/2-Stat3-girdin.

K-ras; Girdin; Colorectal cancer

1000- 4718(2017)02- 0297- 05

2016- 04- 15

2016- 10- 31

R730．23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.017

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△通訊作者 Tel: 15967431898； E-mail: 1018885905@qq.com