陳文利， 徐 婉 ， 程保平， 彭埃天， 焦 悅

(1. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院， 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室激光生命研究所， 廣州 510631；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510640)

柑橘黃龍病檢測(cè)及治療方法的研究進(jìn)展

陳文利1*， 徐 婉1， 程保平2， 彭埃天2， 焦 悅1

(1. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院， 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室激光生命研究所， 廣州 510631；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510640)

黃龍病是柑橘產(chǎn)業(yè)中的一種毀滅性病害，近年來該病害在全球多個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)爆發(fā)，對(duì)研究者和生產(chǎn)者帶來巨大挑戰(zhàn). 目前認(rèn)為柑橘黃龍病病原是一種迄今無法分離、培養(yǎng)的候選韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性細(xì)菌. 雖然目前已經(jīng)開發(fā)了多種治療黃龍病的方法，但都只能延緩黃龍病的癥狀，仍然缺乏有效的根治黃龍病的手段. 本文對(duì)近幾年來黃龍病的傳播途徑、檢測(cè)方法以及治療方法進(jìn)行概述，并對(duì)今后在納米包裹質(zhì)粒和藥物聯(lián)合起來治療黃龍病的研究方向進(jìn)行了展望.

黃龍病； 傳播途徑； 檢測(cè)方法； 治療方法

Keywords： Huanglongbing (citrus greening disease); mode of transmission; detection technology; treatment technology

柑橘生產(chǎn)是世界上最重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)之一. 柑橘類水果是世界上產(chǎn)量最大的4類水果之一. 近年來柑橘生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)損失主要是由黃龍病(Huanglongbing，HLB or crtius greening disease)造成. 柑橘感染黃龍病后，先在濃綠的樹冠中出現(xiàn)少數(shù)黃梢，以后黃梢數(shù)量不斷增加，葉片則表現(xiàn)均勻黃化、黃綠相間的斑駁或缺鋅癥狀，新樹感染該病后1～2年內(nèi)衰亡，老樹感病后3～5年內(nèi)衰亡，橘園發(fā)病后2～3年內(nèi)，可完全喪失生產(chǎn)能力，給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來致命性的打擊. 目前普遍認(rèn)為黃龍病的病原為α-薄壁菌門、變型菌綱的候選韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性細(xì)菌[1-2]. 韌皮部桿菌屬包括3個(gè)與黃龍病相關(guān)的種：亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus,Las)、非洲種(CandidatusLiberibacter africanus,Laf)和美洲種(CandidatusLiberibacter americanus,Lam)[3-4].

世界上最大的柑橘生產(chǎn)國如中國、巴西、印度、墨西哥和美國都受到黃龍病的威脅. 我國最早發(fā)現(xiàn)黃龍病可以追溯到18世紀(jì)70年代的廣東潮汕地區(qū). 而印度從18世紀(jì)即發(fā)現(xiàn)類似黃龍病癥狀的柑橘黑死病[5-6]，因此這種疾病在亞洲的存在可能已經(jīng)超過100年了. 2004年在巴西的圣保羅洲發(fā)現(xiàn)了黃龍病[7]， 2005年在美國的佛羅里達(dá)州也發(fā)現(xiàn)這種疾病[8]. 黃龍病對(duì)柑橘具有毀滅性的危害. 黃龍病不但具有較長的潛伏期，而且到目前為止也無法培養(yǎng)出任何黃龍病菌，同時(shí)也缺少已知的商業(yè)抗病品種. 這對(duì)研究者、管理機(jī)構(gòu)以及柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn). 本文對(duì)近幾年來黃龍病的傳播途徑，檢測(cè)方法以及治療方法進(jìn)行概括，提出運(yùn)用納米材料轉(zhuǎn)基因及藥物包埋藥物用于黃龍病治療的設(shè)想，希望能推動(dòng)柑橘黃龍病的治療進(jìn)程.

1 傳播途徑

目前所知的黃龍病病菌傳播方式是嫁接傳播、昆蟲媒介傳播和菟絲子傳播.

黃龍病菌可通過嫁接傳播. 王芝生等[9]的研究表明，不同嫁接組織傳病的成功率不同(多芽枝端>單芽枝段>無芽枝段>枝皮)，趙學(xué)源等[10]的研究表明不同時(shí)期的嫁接苗木染病的幾率也存在差異：5—7月嫁接的苗木發(fā)病率較其它時(shí)間低. 2009年，LOPES等[11]用美洲種和亞洲種黃龍病病菌單獨(dú)侵染和復(fù)合侵染植株后，通過PCR和qPCR檢測(cè)植株的傳病率和攜菌量發(fā)現(xiàn)：亞洲種的傳毒率顯著性高于美洲種，這可能是亞洲種發(fā)生頻率高于美洲種的原因之一.

木虱是一種重要的黃龍病傳播的昆蟲媒介. XU等[12]通過田間觀察發(fā)現(xiàn)：廣東和福建的種植園中有高達(dá)70%的柑橘樹感染了黃龍病. 該病是通過木虱的第四和第五齡木虱若蟲傳播，而不是通過第一、二、三齡若蟲傳播. 他們還發(fā)現(xiàn)：成年木虱至少在染病植株上培養(yǎng)5 h即可傳毒. 單個(gè)木虱生活史中可發(fā)生高達(dá)13次的傳毒. 每個(gè)昆蟲至少可傳播一個(gè)植株，10個(gè)成年木虱對(duì)一棵植株傳毒僅需要2天. 然而，INOUE等[13]的實(shí)驗(yàn)中，通過成年木虱取食感染植物卻都沒有傳毒；PELZ-STELINSKI 等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，取食感染時(shí)間的增加對(duì)傳毒效率沒有什么影響. 結(jié)合后2種實(shí)驗(yàn)觀點(diǎn)，木虱在不同發(fā)育階段具有不一樣的傳播黃龍病的能力這個(gè)觀點(diǎn)被推翻了.

木虱經(jīng)卵傳播病原菌這種途徑也爭論了好久. 早在1992年VAN DEN BERG[15]就已經(jīng)提到了這種傳播方式. MANN等[16]在2011年也發(fā)現(xiàn)了木虱傳播黃龍病是經(jīng)卵傳播的. 2015年LEE等[17]發(fā)現(xiàn)：成年木虱在若蟲期間感染了病菌，隨著若蟲的出生，若蟲也被細(xì)菌感染，之后細(xì)菌在木虱體內(nèi)擴(kuò)增. 當(dāng)木虱從若蟲變?yōu)槌上x后，它們繼續(xù)重復(fù)這個(gè)過程. 在條件適宜的時(shí)候雌木虱的平均產(chǎn)卵在748個(gè)，因此潛在陽性木虱的增加量是非常巨大的.

柑橘黃龍病菌還可以通過冤絲子(C.campestris和C.australis)從柑橘傳到柑橘或長春花，約3個(gè)月的時(shí)間就能在長春花上觀察到黃龍病引起的黃化癥狀[18].

柑橘黃龍病，由于其病原菌及傳播途徑的特殊，目前沒有較好的解決此問題的有效方法，尋找一些新的針對(duì)此病的防治方法，非常緊迫. 筆者認(rèn)為可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行深入研究：篩選和培育抗黃龍病的基因型，加快抗病新品種的研究；進(jìn)一步深入研究其病原、發(fā)病機(jī)理及其流行病學(xué)規(guī)律，篩選、發(fā)明針對(duì)根治黃龍病的有效殺菌藥劑及抗原；針對(duì)柑桔木虱的傳播途徑，研究其天敵生物資源.

如果能在傳播途徑上，利用納米轉(zhuǎn)基因和藥物包埋技術(shù)處理控制黃龍病的傳播，那將是一個(gè)值得研究的好課題.

2 黃龍病檢測(cè)方法

黃龍病的檢測(cè)方法主要分為田間癥狀診斷、電鏡觀察、血清鑒別法，淀粉-碘檢測(cè)法、高光譜檢測(cè)技術(shù)和PCR檢測(cè)法. 田間癥狀診斷相對(duì)簡單、快捷，但是結(jié)果卻并不準(zhǔn)確；電鏡觀察法檢測(cè)準(zhǔn)確度不高；就目前來說，比較流行的檢測(cè)方法有分子檢測(cè)法和高光譜檢測(cè)法.

2.1 分子檢測(cè)法

近年來常用的疾病檢測(cè)分子技術(shù)是ELISA，PCR和qPCR；其他分子技術(shù)包括免疫熒光(Immunofluorescence，IF)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光原位雜交(Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)和DNA微陣列[19]. 目前，植物病害的PCR技術(shù)檢測(cè)已經(jīng)較為成熟，有2種PCR系統(tǒng)已被用于黃龍病的檢測(cè). 第一種是基于16S rDNA序列的PCR系統(tǒng)，這種系統(tǒng)使用許多引物和探針序列[20]. 引物對(duì)OI1和OI2c能夠擴(kuò)增16S rDNA Las和Laf物種[21]. 序列分析表明，Las擴(kuò)增的16S rDNA具有一個(gè)XbaI限制性位點(diǎn)，在XbaI處理時(shí)產(chǎn)生2個(gè)大小為520、640 bp的片段. 來自Laf擴(kuò)增的16S rDNA具有額外的限制性位點(diǎn)，產(chǎn)生3個(gè)片段，分別為520、506、130 bp[21-22]. 第二種PCR方式以n-gpr操縱子區(qū)(引物對(duì)A2，J5以及引物對(duì)MHO353，MHO354)為中心[20]. 基因rplA和rplJ之間的基因間區(qū)域在Las中比在Laf中大34 bp. 如果2種韌皮部桿菌屬存在于同一個(gè)樣品中，使用rplA基因中選擇的正向引物f-rpl A2和來自rplJ基因的反向引物r-rpl J5，能從Las中擴(kuò)增出一個(gè)703 bp的DNA，而Laf中則獲得669 bp的DNA[23]. 目前，qPCR是比較受歡迎的檢測(cè)黃龍病菌的方法[24]. 與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，qPCR提供了更加敏感快捷的檢測(cè)病原菌的方法. 相對(duì)于巢式PCR，qPCR敏感度提高了檢測(cè)韌皮部桿菌10～100倍；而相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR，qPCR檢測(cè)病菌的敏感性提高了100～1 000倍[25]. KIM 和WANG 等[26]使用引物探針靶向16S rDNA和β操縱子DNA比較了不同檢測(cè)黃龍病的qPCR方法. 在Las菌種中，16S rDNA 的數(shù)量是β操縱子DNA的3倍，因此可以用來檢測(cè)黃龍病. 定量反轉(zhuǎn)錄酶PCR(Quantitative Reverse Transcriptase PCR，qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)表明，RT-PCR能夠通過靶向16S rRNA增加檢測(cè)的靈敏度.

GOPAL等[27]用對(duì)rDNA區(qū)域具有特異性的引物進(jìn)行PCR，成功從具有黃龍病癥狀的甜橙中擴(kuò)增出了1 160 bp DNA片段，而從健康的甜橙植物中沒有擴(kuò)增出來. 之后利用生物素標(biāo)記1 160 bp的PCR產(chǎn)物作為一種探針，在核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)中檢測(cè)黃龍病病菌，甚至把黃龍病感染的組織進(jìn)行100倍的稀釋后，黃龍病病菌依然可以被檢出來. 他們把從HLB感染的組織中提取的總DNA稀釋后點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，當(dāng)DNA稀釋到225 ng時(shí)具有高強(qiáng)度信號(hào)，而稀釋到112 ng時(shí)為中等信號(hào). 在健康樣品中沒有觀察到雜交信號(hào)，而在陽性對(duì)照中觀察到了強(qiáng)烈的信號(hào).

2.2 高光譜檢測(cè)法

利用高光譜技術(shù)檢測(cè)黃龍病也是目前一種比較流行的檢測(cè)方法. HAWKINS[28]等利用傅里葉變換紅外衰減全反射光譜將患病柑橘葉子與正常未感染的葉子進(jìn)行比較，光譜的中紅外區(qū)域顯示了感染葉片發(fā)生劇烈變化，實(shí)驗(yàn)通過正常柑橘葉子與患病柑橘葉子在900～1 180 cm-1范圍內(nèi)產(chǎn)生峰值的碳水化合物，從而將感染植物與非感染植物區(qū)分開. 在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)也使用來自已知疾病狀態(tài)的179種植物的光譜開發(fā)了基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的模型. 然后，這種模型預(yù)測(cè)被用于測(cè)量被測(cè)植物的狀態(tài)，且結(jié)果準(zhǔn)確性大于95%. 雖然感染了黃龍病的柑橘葉片具有鮮明的特征，可用于區(qū)分感染植物和健康植物，但其他許多柑橘類疾病也可顯示出類似的可見癥狀，HAWKINS等[29]使用此光譜法將黃龍病與另外幾種柑橘病(柑橘皺葉病毒，柑橘腐根病病毒，柑橘鱗皮病毒和柑橘潰瘍病毒)和營養(yǎng)缺陷(鐵、銅、鋅、錳和鎂)進(jìn)行比較，以確定是否單獨(dú)的光譜檢測(cè)可用于鑒定感染黃龍病的植物. 結(jié)果表明，一些其他患有疾病和生理缺陷的植株的光譜與表觀健康植物更為相似，而與患黃龍病的植株存在差異.

3 黃龍病的治療方法

3.1 基于分子生物學(xué)的治療方法

RAWAT等[30]利用META分析法、基因共表達(dá)和miRNA嵌套網(wǎng)絡(luò)分析了柑橘在抵抗黃龍病病菌中的候選探針組，他們使用META分析中的LIMMA和RANKPROD[30]方法研究了22份可用于柑橘與黃龍病相互作用的轉(zhuǎn)錄組研究，其中包括18個(gè)易感(S)數(shù)據(jù)集和4個(gè)抗性(R)數(shù)據(jù)集. 之后又使用Teradata內(nèi)部結(jié)構(gòu)化查詢語言(Structured Query Language，SQL)腳本生成了7 412個(gè)差異表達(dá)探針集的組合列表. 這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)確定了來自S和R數(shù)據(jù)集的不同組織中HLB疾病調(diào)控的65種最常見的探針組. 這些探針組的基因本體分析表明，碳水化合物代謝，營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物脅迫是柑橘中被韌皮部桿菌亞洲菌種感染和黃龍病發(fā)展所調(diào)節(jié)的核心途徑. 同時(shí)他們還鑒定了R特異性探針組，其編碼富含亮氨酸的重復(fù)蛋白、幾丁質(zhì)酶、組成型疾病抗性、Miraculins和凝集素. 他們又對(duì)3 499個(gè)探針組進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，并確定了21個(gè)具有主要探針組的模塊. 此外，還創(chuàng)建了一個(gè)miRNA嵌套網(wǎng)絡(luò)來檢查3 499個(gè)目標(biāo)探針組的基因調(diào)控. 最終結(jié)果表明：大多數(shù)潛在的候選中樞探針組與赤霉素途徑(Gibberellin Pathway，GA Pathway)相關(guān)的探針組共表達(dá)，這意味著GA信號(hào)在HLB抗性中具有潛在作用. 該研究結(jié)果有助于理解現(xiàn)有的柑橘HLB轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，有助于闡明柑橘與HLB相互作用的內(nèi)在機(jī)制. 該分析鑒定出的柑橘探針可進(jìn)一步用于驗(yàn)證HLB響應(yīng)基因.

WANG等[31]用RNA-Seq評(píng)估2個(gè)不同柑橘品種(HLB耐受性“Jackson”葡萄柚樣雜種樹和HLB易感的“Marsh”葡萄柚樹)感染HLB后的轉(zhuǎn)錄組差異. 結(jié)果表明：共有686個(gè)基因在2個(gè)品種間差異表達(dá). 在HLB耐受柑橘中，247個(gè)基因被上調(diào)，439個(gè)下調(diào). 在HLB耐受性和敏感型柑橘中，總共有619個(gè)基因的可變剪接出現(xiàn)顯著差異. 進(jìn)一步分析揭示了HLB耐受柑橘樹中多種信號(hào)途徑被抑制或活化，導(dǎo)致柑橘基礎(chǔ)抗性或免疫力的激活. 最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了耐受HLB的“Jackson”品種和HLB敏感的“Marsh”品種中14個(gè)上調(diào)基因和19個(gè)下調(diào)基因，結(jié)果表明：大多數(shù)基因的表達(dá)與RNA-Seq結(jié)果一致. 該研究為HLB耐受性的研究提供了新的思路，并為HLB耐受性柑橘的育種提供了有益的線索.

RAWAT[30]和WANG[31]的實(shí)驗(yàn)在分子生物學(xué)水平上對(duì)黃龍病提出了新的思路，而下面的這幾位科學(xué)家則近期在轉(zhuǎn)基因方面為柑橘黃龍病的治療帶來了新的方法.

柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)可以引起柑橘衰退病[32]. HAJERI等[33]開發(fā)了一種通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)緩解HLB的新方法. 首先利用CTV-RNAi表達(dá)了靶向柑橘八氫番茄紅素去飽和酶基因的序列，結(jié)果表明其可導(dǎo)致其光漂白表型，這證明了CTV是一種基因沉默載體. 進(jìn)一步將CTV-RNAi載體工程化為具有斷裂的翼瓣異常(Abnormal wing disc，Awd)基因的載體，結(jié)果導(dǎo)致了木虱若蟲中的Awd基因表達(dá)減少，造成成年木虱翼型畸形和死亡率增加，減少了介體傳毒.

DUTT 等[34]為了研究對(duì)黃龍病的持續(xù)的抗病性，獲得了在組成型CaMV35S啟動(dòng)子或在韌皮部特異性擬南芥SUC2(AtSUC2)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的擬南芥NPR1基因的轉(zhuǎn)基因甜橙品種“Hamlin”和“Valencia”. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：擬南芥的NPR1(ArabidopsisthalianaNPR1，AtNPR1)的過表達(dá)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)柑橘對(duì)HLB的抗性有所增強(qiáng). 最近杜克大學(xué)董欣年教授團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果為水稻安上了一種“免疫系統(tǒng)開關(guān)”，這大大增強(qiáng)植物本身的免疫系統(tǒng)，并同時(shí)對(duì)抗多種病原體[35-36]. 那么這種免疫開關(guān)是否可能應(yīng)用到黃龍病中，值得期待. 筆者課題組在與董欣年教授合作研究“自噬相關(guān)基因與NPRs之間關(guān)系”的基礎(chǔ)上嘗試將這一免疫開關(guān)應(yīng)用到黃龍病的防治中去.

HAO等[37]嘗試通過改良植物硫素的過表達(dá)來提高柑橘對(duì)HLB和柑橘潰瘍的抗性. 首先修改并合成了編碼植物硫素的序列，并克隆到二元載體pBinPlus/ARS中. 然后將構(gòu)建體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105進(jìn)行柑橘轉(zhuǎn)化,得到了表達(dá)修飾的植物硫素的轉(zhuǎn)基因植物；與非轉(zhuǎn)基因植物相比，潰瘍癥狀和細(xì)菌的生長量明顯減少了. 此外，接種實(shí)驗(yàn)表明：柑橘對(duì)黃龍病的抗性明顯增加. ZOU等[38]證明在韌皮部中特異表達(dá)殺真菌素B基因的轉(zhuǎn)基因柑橘對(duì)黃龍病的敏感性降低. 該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3個(gè)植物密碼子優(yōu)化的合成天蠶素B基因，將天蠶素B肽設(shè)計(jì)到分泌至3個(gè)特定位點(diǎn)：細(xì)胞外空間、細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng). 在韌皮部特異性啟動(dòng)子GRP1.8的控制下，將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到柑橘基因組中. 并在轉(zhuǎn)基因植物的韌皮部中表達(dá). 一年多的評(píng)估表明，轉(zhuǎn)基因品系中黃龍病的癥狀和病原菌數(shù)量明顯低于對(duì)照組.

綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)為黃龍病的治療方法帶來了新的希望.

3.2 基于藥物的治療方法

YANG等[39]開發(fā)了一種透性納米乳液制劑，可通過葉面噴霧把有效的抗生素通過柑橘角質(zhì)層滲透到韌皮部中. 結(jié)果表明，使用酶法(果膠酶和纖維素酶)的角質(zhì)層分離效率取決于柑橘栽培品種和Las-感染程度. 在所測(cè)試的8種佐劑中，Brij35使受HLB影響的角質(zhì)層的通透性增加最大，與水分控制相比，角質(zhì)層通透性提高了3.33倍. 使用偶聯(lián)抗生素的納米乳液制劑比對(duì)照更有效地降低了受柑橘中的黃龍病菌含量. 其研究表明：水包油(W/O)納米乳液制劑可用以田間控制柑橘HLB.

CROXTON等[40]測(cè)試了金屬化聚乙烯覆蓋物對(duì)成年ACP(Asian citrus psyllid)的控制作用以及對(duì)HLB和早期樹木生長的影響. 結(jié)果表明：與白面覆蓋物或裸露表面相比，金屬化覆蓋物顯著降低ACP種群和HLB發(fā)生率.

YANG等[41]將“熱”處理(45 ℃或40 ℃)和磺酰胺處理(磺胺噻唑鈉-STZ或磺胺二甲氧嘧啶鈉-SDX)的組合應(yīng)用于受HLB侵染的柑橘. 熱療和/或化療后對(duì)HLB染病柑橘的細(xì)菌微生物群的PhyloChipTMG3元代謝特征分析表明：45 ℃熱療與STZ和SDX聯(lián)合治療對(duì)HLB的療效比使用單一治療方法更為有效.

本實(shí)驗(yàn)室將利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室納米材料制作方面的強(qiáng)項(xiàng)技術(shù)，開展納米顆粒包埋藥物進(jìn)入植物體內(nèi)后有序釋放藥物治療黃龍病的研究.

3.3 其他方式

MARTINELLI等[42]測(cè)試了3種小分子化合物對(duì)黃龍病染病柑橘的修復(fù)能力，包括：(1)L-精氨酸；(2)6-芐基腺嘌呤與赤霉素組合物；(3)蔗糖與莠去津組合物. 實(shí)驗(yàn)分析了處理和未處理的成熟葉中糖和淀粉代謝相關(guān)的42個(gè)關(guān)鍵基因、激素相關(guān)途徑、生物脅迫反應(yīng)和次生代謝相關(guān)基因的表達(dá). 結(jié)果表明：TGA5被精氨酸顯著誘導(dǎo)；芐基腺嘌呤和赤霉素增強(qiáng)了生物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的2個(gè)重要基因：WRKY54和WRKY59；蔗糖與莠去津組合上調(diào)了碳水化合物代謝的關(guān)鍵基因，如蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶和α-淀粉酶；莠去津還影響涉及系統(tǒng)性獲得性抗性(SAR)的一些關(guān)鍵基因的表達(dá)，如EDS1、TGA6、WRKY33和MYC2. 數(shù)據(jù)表明：這些調(diào)節(jié)分子對(duì)黃龍病病樹的治療有一定作用. 本課題組擬在黃龍病防治研究過程中進(jìn)行SAR關(guān)鍵基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，期待篩選到標(biāo)志性的黃龍病靶基因，為黃龍病防治做出積極有益的貢獻(xiàn).

4 展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多難以解決的疾病都得到了治療. 科學(xué)家們利用meta分析、基因共表達(dá)、miRNA嵌套網(wǎng)絡(luò)[30]和RNA-seq[31]評(píng)估比較了不同柑橘物種間基因表達(dá)差異，證明了GA信號(hào)通路在黃龍病的抗性方面存在一定的作用. HAJERI[33]、DUTT[34]、HAO[37]、ZOU[38]等則在木虱和柑橘體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究表明：抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物可控制傳播蟲媒，減少黃龍病蔓延；而抗病的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)致病病原菌增殖也有一定的效果，但周期也相對(duì)較長，還需進(jìn)一步完善. 也有人從藥物方面入手治療黃龍病，CROXTON等[40]利用金屬化聚乙烯附著在亞洲木虱上，隔絕了黃龍病病菌的傳播；MARTINELLI等[42]則測(cè)試了L-精氨酸，6-芐基腺嘌呤與赤霉素組合，蔗糖與莠去津組合等小分子物質(zhì)對(duì)黃龍病的影響. YANG等[41]則利用磺胺類抗生素藥物治療結(jié)合熱治療，可顯著抑制黃龍病病菌的增殖. YANG等[39]還開發(fā)了一種透性納米乳制劑，能夠讓抗微生物藥物有效滲透到柑橘韌皮部中. 綜上所述，轉(zhuǎn)基因療法和藥劑治療是現(xiàn)在比較熱門的治療黃龍病的方法.

筆者實(shí)驗(yàn)室在自噬相關(guān)基因和植物抗病之間的關(guān)系領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)行了多年的研究，取得了一定的成績. 從2009年開始，筆者在研究植物細(xì)胞死亡的過程中陸續(xù)將焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)了自噬相關(guān)基因在植物超敏反應(yīng)初期中的功能. 筆者課題組發(fā)現(xiàn)葉綠體的降解是依賴自噬途徑的，但自噬途徑并不是葉綠體降解的唯一途徑，自噬介導(dǎo)的葉綠體降解能夠促進(jìn)增強(qiáng)RPS4介導(dǎo)的防御反應(yīng)[43]；RBOHD在介導(dǎo)依賴NADPH途徑的細(xì)胞自噬、ROS的產(chǎn)生和控制細(xì)胞死亡抵抗病原菌反應(yīng)中起到重要作用[44]；ATG5對(duì)于限制P.Syringae所誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)程序性死亡是必需的，可能是通過SA信號(hào)途徑引起的自噬作用[45]；NPR1(Nonexpressor of PR Gene)是一種錨蛋白，調(diào)控植物系統(tǒng)性獲得抗病性，NPR1基因可調(diào)控植物廣譜抗性的發(fā)生,在植物系統(tǒng)抗性中起著關(guān)鍵作用. 植物NPR1基因已成為植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑,以及植物抗病基因工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). 目前本課題組進(jìn)行了自噬相關(guān)基因與NPR1、NPR3和NPR4之間相互作用的關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)ATG7、NPR3和NPR4是植物防疫機(jī)制和衰老的負(fù)調(diào)控者，而NPR1卻具有相反的功能. NPR3和NPR4通過影響自噬的2條類泛素化途來徑調(diào)控自噬泡的形成和自噬小體在液泡中的降解[46]；EDS1通過調(diào)節(jié)“自噬流”的變化來影響自噬小體的活動(dòng)，本課題組結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDS1通過影響ATG5-ATG12連接途徑來調(diào)節(jié)自噬[47]. 這些基礎(chǔ)研究結(jié)果應(yīng)該能很好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行應(yīng)用性研究，服務(wù)于廣東農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展. 本課題組初步打算先在廣東的黃龍病的轉(zhuǎn)基因抗病性研究方面做一些有意義的嘗試. 筆者已經(jīng)從美國佛羅里達(dá)大學(xué)wen-yuan SONG教授那里拿到了甜橙的NtNPR1質(zhì)粒，打算用擬南芥NPR1及甜橙的NPR1基因，以及自噬相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于黃龍病的抗病研究.

而近期發(fā)展較為成熟的植物納米轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有：轉(zhuǎn)化效率高、實(shí)驗(yàn)周期短、受體材料限制少，便于推廣等優(yōu)勢(shì)[48]，本實(shí)驗(yàn)室希望利用相關(guān)技術(shù)手段，對(duì)比農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因柑橘，構(gòu)建攜帶自噬相關(guān)基因或者NPR同源基因質(zhì)粒的納米顆粒，同時(shí)將藥物包埋于納米顆粒里面，期望高效治療黃龍病，以期推動(dòng)黃龍病轉(zhuǎn)基因加藥物相結(jié)合的治療方法的進(jìn)一步發(fā)展.

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Research Advances in the Detection and Treatment of Huanglongbing (Citrus Greening Disease)

CHEN Wenli1*, XU Wan1, CHENG Baoping2, PENG Aitian2, JIAO Yue1

(1. MOE Key Laboratory of Laser Life Science and Institute of Laser Life Science, College of Biophotonics, South China Normal University,Guangzhou 510631, China; 2. Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640，China)

Huanglongbing (citrus greening disease) is a devastating disease in the citrus production. In recent years, the disease has occurred in many major producing areas of citrus in the world, which has aroused the concern of world researchers and citrus producers. Now, the pathogen thought to be a kind of phloem bacteria which is difficult to culture. Although there have been a variety of treatment methods against Huanglongbing, those methods only can alleviate the symptoms of the disease, we still lack effective treatments to cure it. In this article, we outlined the transmission, the detection and treatment methods of Huanglongbing, hoping to promote the study on combined treatments of nano material and drug for this disease.

2017-05-20 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31570256；31170250)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313420)

*通訊作者:陳文利，教授，Email:chenwl@scnu.edu.cn.

S436

A

1000-5463(2017)05-0009-07

【中文責(zé)編：成文 編輯助理：冷佳奕 英文審校：李海航】