曹 玲 李桉棋 李 峰 黃 波 張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心，鄭州450052)

合成免疫學(xué)①

曹 玲 李桉棋 李 峰 黃 波②張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心，鄭州450052)

合成免疫學(xué)是合成生物學(xué)和免疫學(xué)的綜合。合成免疫學(xué)是一門新興的科學(xué)領(lǐng)域，它是免疫學(xué)和合成生物學(xué)的交叉學(xué)科，目的是利用生物技術(shù)手段來合理調(diào)節(jié)及控制免疫反應(yīng)從而使患者獲益(圖1)。 在出現(xiàn)免疫系統(tǒng)紊亂時需要校正免疫反應(yīng)，例如，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中應(yīng)用免疫細胞來抑制促炎介質(zhì)。同時也可以利用免疫細胞來治療疾病，例如，利用免疫細胞的細胞毒作用來清除腫瘤。干擾免疫系統(tǒng)可以通過使用重組細胞因子或重新編程免疫細胞來實現(xiàn)，重組細胞因子和生長因子或治療性抗體已經(jīng)應(yīng)用于患者，但更多的基于合成免疫學(xué)原理的治療藥物和治療手段尚處于臨床前測試或臨床研究階段。在分子水平上，研究人員通過改造和修飾抗體衍生物和抗體模擬物等新的治療藥物以提高其治療的安全性和有效性。在細胞水平上，人們則通過工程化免疫細胞改變其效應(yīng)目標、從而提高免疫細胞的功能。合成免疫學(xué)一種可以合理設(shè)計并構(gòu)建復(fù)雜免疫反應(yīng)功能的合成系統(tǒng)，可以最大限度的實現(xiàn)調(diào)控免疫反應(yīng)的目的，它主要通過人工合成的成分來控制免疫反應(yīng)，如納米材料、免疫佐劑和疫苗等。這些技術(shù)目前仍處于探索階段，為化學(xué)家、生物學(xué)家和臨床醫(yī)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

在本綜述中，我們討論了免疫系統(tǒng)調(diào)控的方法和途徑以及帶來的挑戰(zhàn)，并且展望了未來的治療策略。我們認為，合成免疫學(xué)的應(yīng)用必將成為一種越來越強大的治療途徑。

1 免疫系統(tǒng)的分子工程化

多種治療性分子可以用來干擾免疫系統(tǒng)，在這篇綜述中，我們僅討論基于人源成分的工程化分子，例如治療性抗體、嵌合蛋白、抗體衍生物和抗體類似物。第一代內(nèi)源工程化分子包括重組人細胞因子和生長因子。

1.1 治療性抗體 20世紀中期，研究人員開始利用治療性抗體治療人類疾病。20世紀70年代，Milstein 和Kohler報道了第一個工程化的單克隆抗體，莫羅單抗CD3(OKT3)，它通過干擾T細胞的激活應(yīng)用于移植排斥，在1986年被美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市。目前，約30種治療性抗體已被批準，并且超過300種化合物正在進行臨床試驗[1]。這些治療性抗體可在體外合成(人抗體)，或者通過小鼠產(chǎn)生，然后被工程化以生產(chǎn)更多的模擬人源分子(嵌合和人源化抗體)。

圖1 合成免疫學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Diagram of synthetic immunologyNote: Chemistry,biology and clinical disciplines were combined together,various treatment approaches such as synthetic molecules,cells or other products were applied to promote the development of synthetic immunology

抗體的主要優(yōu)點是其突出的親和力和特異性以及較長的血漿半衰期(表1)。此外，抗體與配體結(jié)合時可以通過多種機制起作用，第一，抗體的結(jié)合可以中和配體的功能。第二，抗體可以被改造從而向靶向位置遞送有毒物質(zhì)。第三，抗體可介導(dǎo)ADCC效應(yīng)(抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性)。第四，抗體與細胞的結(jié)合可介導(dǎo)CDC效應(yīng)(補體依賴性細胞毒性)，通過補體因子誘導(dǎo)凋亡。

然而，使用治療性抗體也有局限性。因其體積較大和空間構(gòu)象的限制，治療性抗體不能穿過細胞膜，只能與細胞外的分子相互作用，而且組織滲透性較低。相對較高的價格也是限制治療性抗體廣泛應(yīng)用的原因。

下面我們將討論幾種干擾人類免疫系統(tǒng)的抗體，包括針對免疫細胞上促炎性分子或表面受體的抗體以及可以介導(dǎo)免疫細胞效應(yīng)功能的抗體。

1.1.1 單克隆抗體 單克隆抗體從非人類物種制備，并且不需人源化便可以直接使用。例如，OKT3是一種針對CD3的單克隆抗體，已經(jīng)被用于阻斷器官移植后T細胞的活化。新一代單克隆抗體已實現(xiàn)可以雙重特異性地與目標相互作用，例如，卡妥索單抗是三功能性抗體，可以雙特異性地靶向過度表達在多種實體癌的上皮細胞黏附分子(EpCAM)的兩個跨膜糖蛋白，同時可以結(jié)合T細胞特異性表面蛋白CD3，因而卡妥索單抗可借助其Fc區(qū)吸引免疫細胞，同時可以通過抗CD3抗體招募T細胞和ADCC[2]。這種由小鼠IgG2a，大鼠IgG2b雜交產(chǎn)生的抗體在2009年被批準用于EpCAM陽性腫瘤惡性腹水的治療。

治療性抗體的安全性不僅僅是免疫原性的問題；非人源抗體成分形成的人抗藥物抗體帶來的風(fēng)險尤其值得重視。研究發(fā)現(xiàn)，在卡妥索單抗藥代動力學(xué)第Ⅱ階段研究中，接受治療的所有患者體內(nèi)都可以檢測到抗藥物抗體[3]。

1.1.2 嵌合單克隆抗體 嵌合單克隆抗體，是由小鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)結(jié)合，形成含有約75%人源序列的蛋白[4]。與非人源的單克隆抗體相比，使用人源的恒定區(qū)序列作為鉸鏈區(qū)能夠減少人體抗藥抗體的形成。

幾種治療性抗體(Ximab)已成功進入臨床應(yīng)用。靶向抗腫瘤壞死因子(TNF)的嵌合單克隆抗體英利昔單抗(Infliximab)用于治療幾種嚴重型的自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸疾病。 利妥昔單抗(Rituximab)，抗CD20嵌合人鼠單抗，不僅用于治療B細胞惡性腫瘤，而且還可用于治療常規(guī)療法治療失敗的自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)小血管炎。機制是抗體結(jié)合CD20陽性B細胞，引起ADCC，CDC，進而激活CD20導(dǎo)致B細胞凋亡耗盡[5]。巴利昔單抗(Basiliximab)，一種針對T細胞表面白細胞介素2受體α鏈的抗體，通過阻斷T細胞活化從而防止器官移植的排斥反應(yīng)。

1.1.3 人源化單克隆抗體 一種新的治療性抗體，由鼠源的抗原結(jié)合序列(又稱為互補決定區(qū))與人類抗體鉸鏈區(qū)連接構(gòu)成。非人源的序列減少到抗體序列的5%，進一步降低了免疫原性[4]。其中，阿侖單抗(Alemtuzumab)可以結(jié)合淋巴細胞表面CD52分子，通過ADCC作用清除這些細胞。另一種人源化單克隆抗體，那他珠單抗(Natalizumab)，可以結(jié)合整合素α4(α4 integrin)，從而阻斷淋巴細胞的遷移，用于多發(fā)性硬化和克羅恩病的治療[6]。盡管這種抗體的免疫原性已經(jīng)明顯降低，但可以激活一些高致敏反應(yīng)[7]，有證據(jù)表明那他珠單抗會增加感染的風(fēng)險，治療過程中并發(fā)進展性多病灶性腦白質(zhì)病。具體說來，因為免疫細胞遷移受限，在中樞神經(jīng)的免疫監(jiān)視系統(tǒng)減少，從而使病毒變得活躍。

表1 基于合成免疫學(xué)的治療手段

Tab.1 Therapies based on synthetic immunology

方法疾病種類優(yōu)勢劣勢重組蛋白免疫缺陷、自身免疫疾病經(jīng)濟、安全、低免疫原性、良好的組織滲透性體內(nèi)半衰期短合成蛋白自身免疫疾病高親和性和特異性有產(chǎn)生免疫原性的危險，體內(nèi)半衰期短，價格高人源性抗體自身免疫疾病高親和性和特異性、ADCC、CDC、攜帶毒性產(chǎn)物價格高，組織滲透性低雙特異性單克隆抗體腫瘤免疫治療高親和性和特異性、雙特異性、ADCC、CDC、攜帶毒性產(chǎn)物有產(chǎn)生免疫原性的危險，體內(nèi)半衰期短，價格高抗體衍生物腫瘤免疫治療高親和性和特異性、良好組織滲透性、比抗體便宜體內(nèi)半衰期短抗體模擬物自身免疫疾病經(jīng)濟、高親和性和特異性體內(nèi)半衰期短同源造血干細胞基因治療免疫缺陷治療疾病有惡變的危險過繼性免疫治療腫瘤免疫治療效能好、持久性治療價格高、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性導(dǎo)致的低效率

1.1.4 人單克隆抗體 近年來研究比較多的人單克隆抗體全部為人源序列，是由表達人源免疫球蛋白或雜交瘤的噬菌體、轉(zhuǎn)基因小鼠制備而成[8]。例如來自噬菌體并靶向腫瘤壞死因子(TNF)的阿達木單抗，以及FDA批準應(yīng)用于黑色素瘤的Ipilimumab 和Nivolumab兩種人單克隆抗體。

免疫治療最大的挑戰(zhàn)是要克服腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境。Ipilimumab 和Nivolumab兩種抗體通過激活T細胞來對抗惡性腫瘤，在 免疫治療領(lǐng)域取得了重大突破。當(dāng)CTLA-4與抗原提呈細胞表面的B7結(jié)合時會導(dǎo)致T細胞無能，而Ipilimumab通過與T細胞表面共刺激分子CTLA-4結(jié)合而阻斷兩者的結(jié)合，從而影響了CTLA-4的抑制作用(圖2)。用Ipilimumab治療惡性黑色素瘤可以延緩腫瘤生長，延長病人平均生存期9到12個月[9]。Nivolumab 是一種人源IgG4 抗體，通過靶向T細胞表面程序性死亡分子-1(PD-1)促進T細胞的激活(圖2)，從而延長惡性黑色素瘤病人的生存期[10,11]。 研究發(fā)現(xiàn)，PD-1單抗免疫治療通過修復(fù)T細胞免疫反應(yīng)而達到清除腫瘤的目的[12]。兩種T細胞調(diào)節(jié)劑Ipilimumab 和Nivolumab在臨床上的聯(lián)合應(yīng)用可快速清除惡性黑色素瘤病人的腫瘤，并延長他們的生存期，并且副作用未增加，仍在可耐受的范圍[13]。Nivolumab是第一個靶向PD-1的單克隆抗體且對無法手術(shù)或者轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)、轉(zhuǎn)移性腎癌都有良好的臨床療效[10,14]。Nivolumab的臨床實驗顯示，在黑色素瘤入組患者中可達到30% 到40%的持續(xù)客觀反應(yīng)率(Objective response rates，ORR)(NCT00730639,NCT01721772,NCT01844505)[15,16]。

另一種PD-1通路上的單克隆抗體 anti-PD-L1 BMS-936559 (MDX-1105)已經(jīng)在臨床一期試驗中顯示出良好的療效(NCT00729664) (圖2)[17]。有文獻報道，anti-CTLA4與anti-PD-1相比，臨床療效較差[18]，原因可能在于anti-CTLA4誘導(dǎo)的是T細胞對腫瘤抗原的非特異性識別[19-24]。因此，臨床應(yīng)用時應(yīng)該優(yōu)先考慮使用靶向PD-1的單克隆抗體[25]。

臨床中常使用促炎性細胞因子來增強對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)。多種細胞因子已經(jīng)被批準用于治療惡性腫瘤。由于這些細胞因子是全身用藥，并且這些細胞因子代謝比較慢，所以經(jīng)常導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)。因此，可將細胞因子融合到靶向腫瘤的抗體中，在提高癌癥免疫療法療效的同時也可以降低不良反應(yīng)發(fā)生率[26]。一些融合了Fc結(jié)構(gòu)域或抗體不同區(qū)域的細胞因子，已經(jīng)進入腫瘤免疫治療的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗[27]。

正在臨床研究測試的治療性單克隆抗體逐年在增加，許多公司正在生產(chǎn)靶向促炎性細胞因子或免疫細胞表面受體的單克隆抗體來治療自身免疫性疾病。但這些抗體靶向的細胞因子和免疫細胞是機體對病原體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)所必需的，在使用這些抗體時雖然能夠治療自身免疫病，卻抑制了機體對病原體的免疫應(yīng)答，因此容易合并感染[28]。總之，單克隆抗體有著出色的特異性和親和性，但與傳統(tǒng)免疫制劑相比不良反應(yīng)并沒有減少。

1.2 嵌合蛋白 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的主要機制是結(jié)合或者中和促炎細胞因子，因此我們可以使用治療性抗體，也可以設(shè)計出能夠結(jié)合炎性細胞因子的嵌合蛋白質(zhì) 。當(dāng)工程化的嵌合蛋白與靶向的細胞因子結(jié)合后，因嵌合蛋白中主要為免疫球蛋白(圖3A)或白蛋白發(fā)揮作用，因此具有較高的親和性和特異性。

例如，為了阻斷炎癥因子TNF的作用，研究者將TNF受體2(TNFR2)與人源IgG1的Fc區(qū)相連設(shè)計出了嵌合蛋白依那西普(Etanercept)，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫性疾病(圖3B)。

圖2 用于免疫檢查點阻斷的單克隆抗體Fig.2 Human monoclonal antibodies for immuno-check-point blockade

1.3 抗體衍生物 抗體衍生物是一種新的抗體樣分子，從免疫球蛋白的可變區(qū)分離得到的抗體衍生物，具有生產(chǎn)成本低、組織穿透性強、免疫原性較低[29]、血清半衰期較短等優(yōu)點，目前已在免疫紊亂疾病及惡性腫瘤中開展臨床試驗?？贵w衍生物通過接頭序列可以連接多個可變結(jié)構(gòu)域，因此可以包含幾個獨立的抗原結(jié)合位點，在體內(nèi)可結(jié)合多個化合物，目前多用于招募毒性免疫細胞進入腫瘤組織并靠近靶細胞。

1.3.1 雙特異性T細胞結(jié)合(BiTE)抗體 BiTE抗體是一種由可變結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈組成的單鏈多肽，重鏈和輕鏈通過柔性接頭序列連接[30](圖4A)，可以將抗CD3可變結(jié)構(gòu)域連接到任何靶點的可變區(qū)。因此，BiTE 抗體可以招募細胞毒性T細胞直接攻擊目標靶點。

1.3.2 雙親和力重定向(DART)技術(shù) 像BiTE一樣，DART抗體可以結(jié)合兩個目標。然而，DARTs與BiTE在結(jié)構(gòu)上不同：DARTs包含兩個多肽鏈，重鏈針對一個目標，輕鏈針對另一個目標，重鏈和輕鏈通過鏈間二硫橋相連(VLa-VHb或VLb-VHa)(圖4B)[31]。

圖3 嵌合蛋白Fig.3 Chimeric proteinsNote: A,bispecific IgG1;B,Synthetic protein etanercept is chimeric molecules linking IgG1 to target TNF-binding protein TNFR2.

圖4 抗體衍生物 Fig.4 Antibody derivatives

1.3.3 四價串聯(lián)抗體(TandAbs) TandAbs包括兩個二聚化的多肽鏈和四個抗原結(jié)合位點(圖4C)，分子量為110 kD(VLa-VHb-連接體 -VLb-VHa)[31]。

1.3.4 納米抗體 納米抗體是從由重鏈組成的單域抗體，這些分子包括抗體重鏈(VHH)可變域(圖4D)，分子量僅為12～15 kD。多種人源化和序列優(yōu)化的納米抗體已進入臨床藥物研究階段。目前已有3個納米抗體正在自身免疫性疾病的治療中進行功能評估[32]，有報道指出，2%接受納米抗體治療的受試者出現(xiàn)了抗藥物抗體，但是這些抗體并沒有影響療效。

目前已經(jīng)出現(xiàn)納米抗體工程結(jié)合促炎細胞因子的研究，例如 Ozoralizumab，它是一種雙特異性抗體衍生物，由3個 VHH組成，有兩個TNF的結(jié)合位點。此納米抗體在RA的治療中進行臨床試驗[33]。有效性和安全性試驗將進一步證實納米抗體是否優(yōu)于治療性單克隆抗體。

多特異性抗體和抗體衍生物使得效應(yīng)細胞向靶細胞的遷移不依賴于ADCC效應(yīng)，這將為更多的干擾免疫反應(yīng)的方法提供研究基礎(chǔ)。主要的問題還是在于找到合適的腫瘤抗原作為有效的治療靶點。

1.4 抗體模擬物 抗體模擬物是包含了抗原結(jié)合位點的合成蛋白，這些分子包含的單個多肽序列來源于現(xiàn)有的人源支架蛋白?？贵w模擬物也是高效的蛋白質(zhì)，分子量低但可提供高特異性。在過去的20年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約50個不同的蛋白支架[31]，其中一些已經(jīng)用于過敏性疾病和自身免疫性疾病的臨床前和臨床研究。

1.4.1 設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins) 3～5個完整設(shè)計的錨蛋白重復(fù)支架決定了DARPins的結(jié)合特異性，這些中央基序側(cè)翼的N、C端帽基序遮擋了疏水區(qū)域，從而增加了DARPins的溶解度(圖5A)。 DARPins 缺乏T 細胞表位， 因此其免疫原性較低，并且在臨床試驗中已觀察到這種現(xiàn)象。

圖5 抗體模擬物Fig.5 Antibody mimeics

1.4.2 親和多聚體(Avimers) Avimer的結(jié)構(gòu)是基于所謂的A區(qū)，A區(qū)主要存在于各種細胞表面受體的胞外部分，它以低親和力與同一靶點的不同表位相結(jié)合(圖5B)。A結(jié)構(gòu)域的親和力可以通過單一域多聚化而增加，這是由遺傳的低聚化來實現(xiàn)的。事實上，組合A結(jié)構(gòu)域已由外顯子洗牌產(chǎn)生[34]。目前研究最多的Avimer，稱為AMG220，是一個12 kD的腳手架蛋白，其中包含低密度脂蛋白受體的三個A域，可以高親和力結(jié)合IL-6，這個Avimer正在克羅恩病中進行Ⅰ期臨床試驗[35]。

2 免疫細胞的工程化

除了合成蛋白調(diào)控免疫系統(tǒng)之外，大量研究關(guān)注于利用基因工程手段體外改造免疫細胞。因此在本部分中我們將討論免疫細胞工程化及其臨床應(yīng)用。合成免疫學(xué)也包括調(diào)節(jié)其他細胞和機體來干擾人體免疫系統(tǒng)，如間充質(zhì)干細胞(MSC)治療、工程化細菌用于腸道慢性炎癥、白介素-2(IL-2)、HIV融合抑制肽等[36-39]。

免疫細胞工程化目前已經(jīng)應(yīng)用于在原發(fā)免疫缺陷患者中對功能缺陷的免疫細胞進行體外重組，在獲得性免疫缺陷患者中通過造血干細胞(HSC)基因治療來抑制HIV感染，或者利用免疫細胞的特性通過過繼性免疫治療來對抗腫瘤。工程化自體免疫細胞療效持久，可以達到治愈疾病的目的。

2.1 細胞表面工程化——在細胞膜上添加成分 現(xiàn)今有多種改造策略將某些分子或化合物負載至免疫細胞表面可以調(diào)節(jié)效應(yīng)細胞的功能。自分泌因子可以用脂質(zhì)納米顆粒包裝，通過共價鍵連接到細胞表面，從而實現(xiàn)低濃度介質(zhì)持續(xù)刺激細胞的目的。細胞表面工程改造還包括通過細胞因子介導(dǎo)體內(nèi)T細胞的大量擴增，從而增強T細胞的殺傷作用[40]。

2.2 自體HSC基因治療——治療免疫缺陷 在自體HSC基因治療中，對基因缺陷的細胞群通過基因添加、修改、敲除等來恢復(fù)這些基因的表達，從而緩解患者的臨床癥狀，使病情不再進展，甚至可能達到治愈。當(dāng)前，免疫缺陷的主要治療方法是通過負載野生型基因序列的載體，以及通過基因修正或者基因敲除來治療HIV感染患者。

2.2.1 基因添加 在3種HSCs治療的方法中，目前臨床試驗及臨床前應(yīng)用最多的是基因添加，第一個成功的案例發(fā)生在2000年，一個患有X染色體遺傳的嚴重免疫缺陷的兒童患者通過自體骨髓移植恢復(fù)了免疫系統(tǒng)的功能，移植的骨髓細胞中帶有小鼠白血病載體負載的野生型IL-2Rα受體[41]。

2.2.2 基因修正 由于基因修正能在不影響表達調(diào)控的前提下改變基因，所以近來受到了極大的關(guān)注。利用這種方法，可以使用鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶，歸巢內(nèi)切酶，轉(zhuǎn)錄激活因子來糾正基因突變或制造新的突變基因。由于采用了不同的修復(fù)手段，結(jié)果可能造成基因的破壞，重構(gòu)或剪切。

例如，在CCR5中引入突變，使得T細胞能抵抗HIV的感染[42]。將人類HSCs通過鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶技術(shù)設(shè)計突變轉(zhuǎn)入到CCR5，將這些細胞移植到免疫功能不全的小鼠后，接種HIV病毒后，病毒滴度明顯低于未突變小鼠[43]。HIV感染者使用自體轉(zhuǎn)導(dǎo)的鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶CD4+T細胞的初步研究剛剛完成，研究顯示這種方法是安全的[44]。

2.2.3 基因敲除 沉默單基因及復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)逐漸應(yīng)用于基因治療。主要手段是利用發(fā)卡RNA(shRNAs)來沉默目的基因。目前，沉默CCR5的免疫細胞正在艾滋病患者中進行臨床試驗[45]。其策略是利用自體轉(zhuǎn)導(dǎo)帶有編碼CCR5-shRNA慢病毒載體的CD4+T細胞和CD34+造血干細胞，同時聯(lián)合HIV抑制劑來治療HIV患者。Ⅰ期臨床試驗的評估目標首先是安全性和可行性，然后是CD4+T細胞劑量以及病毒載量。

2.3 過繼免疫治療 現(xiàn)有的過繼性免疫治療主要用于腫瘤細胞的清除，具體來說，從患者體內(nèi)分離出免疫細胞，在體外進行擴增和基因修飾使得它們重定位自己的效應(yīng)功能，隨后回輸至患者(圖6)，基因工程化的效應(yīng)細胞將識別它們的新靶點并沉默或者殺死腫瘤。

盡管過去的10年已經(jīng)在臨床試驗中應(yīng)用了不同的治療策略，但工程化免疫細胞過繼性免疫治療到目前為止僅顯示了溫和的效應(yīng)。CAR(嵌合抗原受體)修飾T細胞在白血病和淋巴瘤中顯示了鼓舞人心的療效，但在靶向?qū)嶓w瘤時仍有局限性。主要問題是要克服實體瘤腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境，同時要實現(xiàn)回輸至宿主體內(nèi)后有足夠的持久性[46]。目前臨床試驗中應(yīng)用的CAR只有單克隆特異性，已有研究發(fā)現(xiàn)由于發(fā)生了抗原逃逸而導(dǎo)致CAR-T無法發(fā)揮長期的抗腫瘤效應(yīng)[47]。此外，這種技術(shù)成本比較高，而且有可能發(fā)生致命的不良反應(yīng)[48,49]。

圖6 基因工程化T細胞的制備及回輸流程Fig.6 Preparation and infusion process of gene-modified T cells

與單克隆抗體免疫制劑相比，過繼性免疫治療的主要優(yōu)點是利用了免疫細胞自身的抗腫瘤免疫效應(yīng)，單次回輸后即可主動遷移至腫瘤部位，發(fā)生抗原特異性擴增后在一定時間內(nèi)可以持續(xù)存在。

2.3.1 工程化T細胞 研究人員可以使用多種技術(shù)對T細胞進行基因修飾，使其表達高親和力TCRs(T細胞受體)，從而獲得對靶抗原的特異性。研究人員最常使用逆轉(zhuǎn)錄病毒來介導(dǎo)T細胞的基因修飾，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和mRNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)同樣可以成功將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)至T細胞?，F(xiàn)有臨床試驗使用的TCRs主要有以下幾個來源：一是從對過繼細胞治療有反應(yīng)的患者中分離得到編碼TCR的DNA序列，這種技術(shù)可以從腫瘤微環(huán)境中分離出自體T細胞，然后在體外進行擴增，得到的TCR序列隨后被克隆進逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并轉(zhuǎn)染至HLA匹配患者的T細胞上。第二，TCR的遺傳信息可以從人源化小鼠中(表達MHCⅠ/Ⅱ分子并可以識別腫瘤抗原)分離得到。表達小鼠TCRs的人源工程化T細胞已被成功用于靶向腫瘤抗原CEA和PMEL蛋白。第三，利用測序技術(shù)鑒定出腫瘤特異性突變，然后體外合成這些突變基因或者肽并表達于患者自體抗原提呈細胞(APC)，然后將自體T細胞或者健康供者來源的T細胞與這些表達了患者自身腫瘤突變的APC共培養(yǎng)，將獲得能夠識別患者自身所有突變的TCR-T細胞[50，51]。第四，設(shè)計并構(gòu)建CAR的結(jié)構(gòu)并通過病毒載體或其他方法轉(zhuǎn)染至患者來源的T細胞中。這種情況下，抗體的單鏈可變區(qū)(scFv)被嵌合至TCR的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，下游串聯(lián)了可以激活T細胞的共刺激分子。因此，CARs可以識別靶細胞表面非MHC限制性抗原，而TCRs主要識別被APC(抗原提呈細胞)處理后以肽的形式與MHC分子形成復(fù)合物的胞內(nèi)抗原。

靶向CD19陽性白血病和淋巴瘤的CAR-T細胞在臨床試驗中已經(jīng)取得了良好的療效，首批4例患者的病情得到了完全緩解[52,53]，但是在另外一例使用同樣CAR-T細胞治療的患者中出現(xiàn)了CD19陰性白血病的復(fù)發(fā)[54]近兩年來，CAR-T細胞免疫治療在B細胞惡性腫瘤中取得了很好的療效。Maude等[55]報道了30例急性淋巴細胞白血病(ALL)患者入組靶向CD19的CAR-T細胞(CTL019)治療的臨床試驗結(jié)果，完全緩解率達到了90%，最長生存時間超過了2年，而且入組患者均為多次復(fù)發(fā)或者對兩個或更多再次誘導(dǎo)方案無效者，其中60%患者為自體干細胞移植后復(fù)發(fā)，這樣的療效無疑非常振奮人心。Porter等[56]報道了14例復(fù)發(fā)或難治慢性淋巴細胞白血病患者CAR-T治療的效果，雖然總的緩解率僅為56%，但觀察到了長達53個月的無病生存期，這樣顯著的療效用傳統(tǒng)療法基本是不可能實現(xiàn)的。TCR-T細胞免疫治療也在臨床試驗中顯示了可觀的療效，Rapoport等[57]報道的NY-ESO-1特異性TCR-T細胞在治療20例多發(fā)性骨髓瘤患者時，臨床有效率高達80%(16/20)，完全緩解率(CR)也達到了70%(14/20)，而且中位無疾病進展生存期(PFS)長達19.1個月。

盡管如此，Zhang等[58,59]對近年來CAR-T細胞免疫治療在B細胞惡性腫瘤中的臨床試驗進行Meta分析后發(fā)現(xiàn)，CAR-T細胞免疫治療可將ALL患者總的緩解率提高至90%，而在CLL(慢性淋巴細胞白血病)中僅提高至42%，并指出ALL患者效果優(yōu)于CLL可能源于CLL患者的體內(nèi)免疫抑制更強，因此有必要聯(lián)合其他治療以提高CAR-T的療效。

近年來研究人員開發(fā)出多種方法與CAR聯(lián)合，來增加CAR-T免疫治療的療效和安全性。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-1阻斷聯(lián)合CAR-T治療可以明顯延長CAR-T細胞在實體瘤中的存活時間并增強抑制PD-L1+腫瘤細胞的能力并在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中增加CAR-T細胞的持久性從而提高CAR-T細胞的抗腫瘤效應(yīng)[60]，或者采用基因工程手段將PD-1構(gòu)建進CAR-T細胞中從而增強CAR-T細胞在腫瘤部位的浸潤[61]。一種提高CAR-T細胞特異性的方法是設(shè)計出僅能靶向和殺傷表達兩種抗原靶細胞(例如腫瘤細胞)的CAR，這種新型的CAR不會識別表達一種或者不表達抗原的細胞(例如正常組織細胞)，因此提高了特異性和治療的安全性[62]。此外，還出現(xiàn)了將抗體scFv區(qū)與免疫抑制受體CTLA-4或PD-1嵌合的抑制性CARs[63]。研究人員還利用基因工程使T細胞異位表達T細胞刺激因子IL-12，IL-12/CAR的組成性內(nèi)源分泌在沒有化療預(yù)處理的情況下即可引起表達靶向抗原的腫瘤細胞的凋亡，并且可以抵抗Treg細胞介導(dǎo)的免疫抑制[64]。最近發(fā)表在Science上的一篇報道更是提出了通過一個小分子開關(guān)來控制CAR-T功能的新方法[65]。這些新的合成免疫學(xué)的產(chǎn)物在優(yōu)化T細胞功能及減少不良反應(yīng)方面有重要的意義。

2.3.2 應(yīng)用經(jīng)過工程改造的NK細胞(自然殺傷細胞)根除腫瘤 自體或異體NK 細胞已廣泛用于多種惡性腫瘤治療的臨床試驗中[66]。NK 細胞最早在血液中發(fā)現(xiàn)，回輸NK細胞的免疫療法在惡性血液系統(tǒng)腫瘤中已經(jīng)獲得了成功[67]。首先，NK 細胞被分離出來(主要來自外周血單核細胞)，然后，在體外用細胞因子刺激并擴增至治療劑量后回輸至患者體內(nèi)。盡管臨床試驗數(shù)據(jù)表明自體NK細胞移植是安全的，但是臨床效率卻差強人意[66]。相反，異體NK細胞在腫瘤治療中相對比較成功，包括轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤、腎癌、霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病[68]。

基因工程改造的NK細胞和NK細胞系的抗腫瘤效果已在臨床前研究中被廣泛證實，多項研究表明，聯(lián)合細胞因子 (IL-2、IL-15、SCF)基因修飾NK細胞和用CAR (CD19、CD20、ErbB2、CD33、CEA、GD2)來定向NK靶細胞的新技術(shù)能夠提高NK細胞的殺傷功能、增強NK細胞的擴增能力、生存能力及其靶向特異性，從而增強NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)[66]。這些新技術(shù)在臨床試驗中能否成功有待更多臨床試驗來驗證。

3 未來治療策略

基于合成免疫學(xué)的理念，近年來出現(xiàn)并上市了多種新的分子水平上的多特異性抗體、抗體衍生物和抗體模擬物，而且可以通過重新編程免疫效應(yīng)細胞來改變效應(yīng)細胞的功能。目前，過繼免疫療法主要應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，目的是通過基因工程手段增強T細胞的抗腫瘤能力。現(xiàn)有免疫治療存在的主要問題就是免疫應(yīng)答的特異性較低從而有可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，例如，靶向CD19/CD20來殺傷白血病細胞在清除腫瘤細胞的同時也會大幅度的抑制正常B細胞功能從而干擾人體正常免疫系統(tǒng)。在不久的將來，研究者必定會更多關(guān)注于蛋白復(fù)合體如何與特異性更強的細胞亞群聯(lián)合應(yīng)用，以及如何通過CAR技術(shù)來整合多重特異性。在未來，工程化分子和工程化細胞在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域?qū)㈤_展更大規(guī)模的研究，在其他領(lǐng)域也必將有越來越廣泛的應(yīng)用。

致謝：衷心感謝中國工程院楊勝利院士在本文書寫過程中給予的指導(dǎo)和幫助。

[1] McEnaney PJ,Parker CG,Zhang AX,etal.Antibody-recruiting molecules:an emerging paradigm for engaging immune function in treating human disease[J].ACS Chem Biol,2012,7(7):1139-1151.

[2] Chelius D,Ruf P,Gruber P,etal.Structural and functional characterization of the trifunctional antibody catumaxomab[J].MAbs,2010,2(3):309-319.

[3] Ruf P,Kluge M,Jager M,etal.Pharmacokinetics,immunogenicity and bioactivity of the therapeutic antibody catumaxomab intraperitoneally administered to cancer patients[J].Br J Clin Pharmacol,2010,69(6):617-625.

[4] Clark M.Antibody humanization:a case of the ′Emperor′s new clothes′?[J].Immunol Today,2000,21(8):397-402.

[5] Amoroso A,Hafsi S,Militello L,etal.Understanding rituximab function and resistance:implications for tailored therapy[J].Front Biosci (Landmark Ed),2011,16:770-782.

[6] Rudick R,Polman C,Clifford D,etal.Natalizumab:bench to bedside and beyond[J].JAMA Neurol,2013,70(2):172-182.

[7] Hansel TT,Kropshofer H,Singer T,etal.The safety and side effects of monoclonal antibodies[J].Nat Rev Drug Discov,2010,9(4):325-338.

[8] Vincent KJ,Zurini M.Current strategies in antibody engineering:Fc engineering and pH-dependent antigen binding,bispecific antibodies and antibody drug conjugates[J].Biotechnol J,2012,7(12):1444-1450.

[9] Wolchok JD,Hodi FS,Weber JS,etal.Development of ipilimumab:a novel immunotherapeutic approach for the treatment of advanced melanoma[J].Ann NY Acad Sci,2013,1291:1-13.

[10] Topalian SL,Hodi FS,Brahmer JR,etal.Safety,activity,and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer[J].N Engl J Med,2012,366(26):2443-2454.

[11] Ott PA,Hodi FS,Robert C.CTLA-4 and PD-1/PD-L1 blockade:new immunotherapeutic modalities with durable clinical benefit in melanoma patients[J].Clin Cancer Res,2013,19(19):5300-5309.

[12] Sznol M,Chen L.Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer[J].Clin Cancer Res,2013,19(5):1021-1034.

[13] Wolchok JD,Kluger H,Callahan MK,etal.Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma[J].N Engl J Med,2013,369(2):122-133.

[14] Brahmer JR,Drake CG,Wollner I,etal.Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors:safety,clinical activity,pharmacodynamics,and immunologic correlates[J].J Clin Oncol,2010,28(19):3167-3175.

[15] Topalian SL,Sznol M,McDermott DF,etal.Survival,durable tumor remission,and long-term safety in patients with advanced melanoma receiving nivolumab[J].J Clin Oncol,2014,32(10):1020-1030.

[16] Robert C,Long GV,Brady B,etal.Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation[J].N Engl J Med,2015,372(4):320-330.

[17] Brahmer JR,Tykodi SS,Chow LQ,etal.Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer[J].N Engl J Med,2012,366(26):2455-2465.

[18] Robert C,Schachter J,Long GV,etal.Pembrolizumab versus Ipilimumab in Advanced Melanoma[J].N Engl J Med,2015,372(26):2521-2532.

[19] Karandikar NJ,Vanderlugt CL,Walunas TL,etal.CTLA-4:a negative regulator of autoimmune disease[J].J Exp Med,1996,184(2):783-788.

[20] Perrin PJ,Maldonado JH,Davis TA,etal.CTLA-4 blockade enhances clinical disease and cytokine production during experimental allergic encephalomyelitis[J].J Immunol,1996,157(4):1333-1336.

[21] Luhder F,Hoglund P,Allison JP,etal.Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) regulates the unfolding of autoimmune diabetes[J].J Exp Med,1998,187(3):427-432.

[22] Tarhini A.Immune-mediated adverse events associated with ipilimumab ctla-4 blockade therapy:the underlying mechanisms and clinical management[J].Scientifica (Cairo),2013,2013:857519.

[23] Maker AV,Attia P,Rosenberg SA.Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA-4 blockade[J].J Immunol,2005,175(11):7746-7754.

[24] Jacobs JF,Nierkens S,Figdor CG,etal.Regulatory T cells in melanoma:the final hurdle towards effective immunotherapy?[J].Lancet Oncol,2012,13(1):e32-42.

[25] Chen L,Han X.Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer:past,present,and future[J].J Clin Invest,2015,125(9):3384-3391.

[26] Ortiz-Sanchez E,Helguera G,Daniels TR,etal.Antibody-cytokine fusion proteins:applications in cancer therapy[J].Expert Opin Biol Ther,2008,8(5):609-632.

[27] Kontermann RE.Antibody-cytokine fusion proteins[J].Arch Biochem Biophys,2012,526(2):194-205.

[28] Sathish JG,Sethu S,Bielsky MC,etal.Challenges and approaches for the development of safer immunomodulatory biologics[J].Nat Rev Drug Discov,2013,12(4):306-324.

[29] Teillaud JL.From whole monoclonal antibodies to single domain antibodies:think small[J].Methods Mol Biol,2012,911:3-13.

[30] Frankel SR,Baeuerle PA.Targeting T cells to tumor cells using bispecific antibodies[J].Curr Opin Chem Biol,2013,17(3):385-392.

[31] Wurch T,Pierre A,Depil S.Novel protein scaffolds as emerging therapeutic proteins:from discovery to clinical proof-of-concept[J].Trends Biotechnol,2012,30(11):575-582.

[32] Unciti-Broceta JD,Del Castillo T,Soriano M,etal.Novel therapy based on camelid nanobodies[J].Ther Deliv,2013,4(10):1321-1336.

[33] Coppieters K,Dreier T,Silence K,etal.Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis[J].Arthritis Rheum,2006,54(6):1856-1866.

[34] Silverman J,Liu Q,Bakker A,etal.Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains[J].Nat Biotechnol,2005,23(12):1556-1561.

[35] Beck A,Wurch T,Bailly C,etal.Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies[J].Nat Rev Immunol,2010,10(5):345-352.

[36] Stagg J,Galipeau J.Mechanisms of immune modulation by mesenchymal stromal cells and clinical translation[J].Curr Mol Med,2013,13(5):856-867.

[37] Bermudez-Humaran LG,Aubry C,Motta JP,etal.Engineering lactococci and lactobacilli for human health[J].Curr Opin Microbiol,2013,16(3):278-283.

[38] Farrar MD,Whitehead TR,Lan J,etal.Engineering of the gut commensal bacterium Bacteroides ovatus to produce and secrete biologically active murine interleukin-2 in response to xylan[J].J Appl Microbiol,2005,98(5):1191-1197.

[39] Rao S,Hu S,McHugh L,etal.Toward a live microbial microbicide for HIV:commensal bacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(34):11993-11998.

[40] Stephan MT,Moon JJ,Um SH,etal.Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles[J].Nat Med,2010,16(9):1035-1041.

[41] Kay MA.State-of-the-art gene-based therapies:the road ahead[J].Nat Rev Genet,2011,12(5):316-328.

[42] Perez EE,Wang J,Miller JC,etal.Establishment of HIV-1 resistance in CD4+T cells by genome editing using zinc-finger nucleases[J].Nat Biotechnol,2008,26(7):808-816.

[43] Holt N,Wang J,Kim K,etal.Human hematopoietic stem/progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo[J].Nat Biotechnol,2010,28(8):839-847.

[44] Tebas P,Stein D,Tang WW,etal.Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV[J].N Engl J Med,2014,370(10):901-910.

[45] Burke BP,Boyd MP,Impey H,etal.CCR5 as a natural and modulated target for inhibition of HIV[J].Viruses,2014,6(1):54-68.

[46] 曹 玲,張 毅.嵌合抗原受體修飾T細胞治療惡性腫瘤的研究進展[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,41(1):1-8.

[47] Kalos M,June CH.Adoptive T cell transfer for cancer immun-otherapy in the era of synthetic biology[J].Immunity,2013,39(1):49-60.

[48] Brentjens R,Yeh R,Bernal Y,etal.Treatment of chronic lymphocytic leukemia with genetically targeted autologous T cells:case report of an unforeseen adverse event in a phase I clinical trial[J].Mol Ther,2010,18(4):666-668.

[49] Morgan RA,Yang JC,Kitano M,etal.Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2[J].Mol Ther,2010,18(4):843-851.

[50] Stronen E,Toebes M,Kelderman S,etal.Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires[J].Science,2016，352(6291)：1337-1341.

[51] Rosenberg SA,Restifo NP.Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer[J].Science,2015,348(6230):62-68.

[52] Porter DL,Levine BL,Kalos M,etal.Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia[J].N Engl J Med,2011,365(8):725-733.

[53] Kalos M,Levine BL,Porter DL,etal.T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia[J].Sci Transl Med,2011,3(95):95ra73.

[54] Grupp SA,Kalos M,Barrett D,etal.Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia[J].N Engl J Med,2013,368(16):1509-1518.

[55] Maude SL,Frey N,Shaw PA,etal.Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia[J].N Engl J Med,2014,371(16):1507-1517.

[56] Porter DL,Hwang WT,Frey NV,etal.Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia[J].Sci Transl Med,2015,7(303):303ra139.

[57] Rapoport AP,Stadtmauer EA,Binder-Scholl GK,etal.NY-ESO-1-specific TCR-engineered T cells mediate sustained antigen-specific antitumor effects in myeloma[J].Nat Med,2015,21(8):914-921.

[58] Zhang T,Cao L,Xie J,etal.Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials:a meta-analysis[J].Oncotarget,2015,6(32):33961-33971.

[59] Zhang Y,Zhang T,Cao L,etal.Review of cancer immunotherapy:application of chimeric antigen receptor T cells and programmed death 1/programmed death-ligand 1 antibodies[J].Cancer Translational Med,2015,1(2):43.

[60] Gargett T,Yu W,Dotti G,etal.GD2-specific CAR T cells undergo potent activation and deletion following antigen encounter but can be protected from activation-induced cell death by PD-1 blockade[J].Mol Ther,2016，24(6)：1135-1149.

[61] Liu X,Ranganathan R,Jiang S,etal.A chimeric switch-receptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors[J].Cancer Res,2016,76(6):1578-1590.

[62] Kloss CC,Condomines M,Cartellieri M,etal.Combinatorial antigen recognition with balanced signaling promotes selective tumor eradication by engineered T cells[J].Nat Biotechnol,2013,31(1):71-75.

[63] Fedorov VD,Themeli M,Sadelain M.PD-1-and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses[J].Sci Transl Med,2013,5(215):215ra172.

[64] Pegram HJ,Lee JC,Hayman EG,etal.Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning[J].Blood,2012,119(18):4133-4141.

[65] Wu CY,Roybal KT,Puchner EM,etal.Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor[J].Science,2015,350(6258):aab4077.

[66] Cheng M,Chen Y,Xiao W,etal.NK cell-based immunotherapy for malignant diseases[J].Cell Mol Immunol,2013,10(3):230-252.

[67] Ames E,Murphy WJ.Advantages and clinical applications of natural killer cells in cancer immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63(1):21-28.

[68] Lundqvist A,McCoy JP,Samsel L,etal.Reduction of GVHD and enhanced antitumor effects after adoptive infusion of alloreactive Ly49-mismatched NK cells from MHC-matched donors[J].Blood,2007,109(8):3603-3606.

[收稿2016-06-07]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.028

①本文受國家自然科學(xué)基金項目( 81171986，81271815，81502689)、河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目(省部共建項目2015010004)、國家重點研發(fā)計劃“重大慢性非傳染疾病防治研究”重點專項(2016TFC1303500)和河南省重大專項(22130001)。

曹 玲(1985年-)，女，在讀博士，主要從事惡性腫瘤的免疫治療研究，E-mail：caoling@gs.zzu.edu.cn。

及指導(dǎo)教師：黃 波(1969年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫、腫瘤生物學(xué)、腫瘤代謝等方面的研究，E-mail: tjhuangbo@hotmail.com。 張 毅(1964年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用相關(guān)研究，E-mail: yizhang@zzu.edu.cn。

R392-33

A

1000-484X(2017)02-0288-09

②中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)暨分子生物醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，北京100005。