袁 芬

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，武漢430077)

七氟烷對(duì)新生大鼠學(xué)習(xí)記憶功能以及海馬區(qū)凋亡的影響

袁 芬

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，武漢430077)

目的：觀察并探討新生大鼠接受七氟烷麻醉后，生長至斷乳期的學(xué)習(xí)記憶功能的變化以及海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的變化。方法：健康6～8日齡新生SD大鼠100只，隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組20只：Ⅰ組大鼠吸入體積分?jǐn)?shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅱ組大鼠僅吸入25%氧氣2 h；Ⅲ組大鼠分別在出生后第6、7、8天接受一次體積分?jǐn)?shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅳ組大鼠僅吸入3次25%氧氣2 h；Ⅴ組大鼠僅放入麻醉箱，不做任何處理。麻醉后待大鼠生長至16～21 d時(shí)，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，并且取大鼠海馬區(qū)檢測caspase-3的表達(dá)，用TUNEL法觀察海馬區(qū)凋亡細(xì)胞的變化。結(jié)果：①M(fèi)orris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示：在大鼠生長至16～21 d時(shí)進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，與第Ⅳ組大鼠相比，第Ⅰ組大鼠的逃避潛伏期無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第Ⅲ組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，和其他組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②在水迷宮的空間探索實(shí)驗(yàn)中，與第Ⅳ組相比，第Ⅰ組大鼠的穿越平臺(tái)的次數(shù)無明顯的變化；第Ⅲ組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，并且較第Ⅰ組以及其他各組大鼠也顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③第Ⅲ組大鼠的游泳速度明顯慢于其他組別；④與第Ⅳ組大鼠比，Ⅰ組大鼠caspase-3的表達(dá)稍有增加，Ⅲ組大鼠caspase-3的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑤僅接受一次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細(xì)胞稍有增加，而接受三次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細(xì)胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：新生6～8 d的大鼠接受三次七氟烷麻醉后，待其生長至16～21 d，其空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受到影響，可能與海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。

七氟烷；海馬區(qū)；學(xué)習(xí)記憶功能；凋亡

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)和麻醉學(xué)的發(fā)展，越來越多的嬰幼兒甚至新生兒可以在安全無痛的條件下接受手術(shù)以及一些特殊的檢查[1,2]。并且有報(bào)道顯示，約有2%的孕婦在妊娠期需要接受全身麻醉下進(jìn)行的手術(shù)，這使得胎兒暴露于麻醉藥物中[3,4]，而這些藥物會(huì)不會(huì)對(duì)新生兒、嬰幼兒后期的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響，造成損害目前還沒有確切的定論。七氟烷是目前在嬰幼兒麻醉中應(yīng)用最為廣泛的吸入性麻醉藥之一，它對(duì)呼吸道的刺激較小，并且在麻醉的誘導(dǎo)過程平穩(wěn)、蘇醒迅速。與其他的吸入性麻醉藥相比，七氟烷的肺泡內(nèi)濃度與吸入濃度比例(FA/F1)較氟烷和恩氟烷高，且排泄迅速[5,6]。但是，在國外，麻醉藥對(duì)認(rèn)知功能的影響主要集中在氟烷以及異氟烷的領(lǐng)域[7]，在國內(nèi)七氟烷對(duì)認(rèn)知功能的影響主要是以中青年鼠或老年鼠為研究對(duì)象[8]，而七氟烷對(duì)新生兒、嬰幼兒的影響以及學(xué)習(xí)記憶功能研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，出生7 d的雄性大鼠分別給予七氟烷麻醉和異氟烷麻醉后，兩組大鼠的大腦神經(jīng)元均有凋亡的表現(xiàn)，但是在等效的濃度刺激下，異氟烷引起的神經(jīng)元損傷較七氟烷更重。那么七氟烷對(duì)發(fā)育期的大腦神經(jīng)元影響多大，僅接受一次七氟烷麻醉和接受多次七氟烷麻醉引起的神經(jīng)元損傷是否相同,就成了研究者關(guān)心的問題之一。有研究表明，阿爾茲海默病患者認(rèn)知功能障礙的最主要原因是大腦膽堿能突觸的神經(jīng)沖動(dòng)傳遞受損[9]，并且研究證實(shí)了如果給老年人使用擬膽堿藥，可以有效地增強(qiáng)老年人的認(rèn)知能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究者們也發(fā)現(xiàn)老年雄性大鼠在接受異氟醚麻醉后，其空間學(xué)習(xí)的記憶能力是下降的，可能與大腦海馬內(nèi)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的濃度下降有關(guān)[10]。當(dāng)然，由于老年人的生理特點(diǎn)決定了其麻醉后大腦神經(jīng)系統(tǒng)的影響比中青年人更為敏感，而處于生長發(fā)育期的新生動(dòng)物麻醉后大腦神經(jīng)系統(tǒng)是否會(huì)受到影響還不明確。給予正處于神經(jīng)突觸發(fā)育高峰期的大鼠以七氟烷麻醉是否影響生長發(fā)育后期的學(xué)習(xí)記憶功能值得研究。本研究主要觀察新生大鼠在接受不同濃度的七氟烷麻醉后，生長至斷乳期的學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并進(jìn)一步研究其大腦海馬區(qū)中caspase-3的改變，以期能為七氟烷影響發(fā)育期大腦學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為七氟烷更安全有效地應(yīng)用于臨床麻醉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康6～8日齡新生SD大鼠100只，體重為13～20 g，將大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，大鼠由江蘇省揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理通過了揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的審批，審批號(hào)為：IACUC-14030070,符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組20只：Ⅰ組大鼠吸入體積分?jǐn)?shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅱ 組大鼠僅吸入25%氧氣2 h；Ⅲ 組大鼠分別在出生后第6、7、8天接受一次體積分?jǐn)?shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅳ組大鼠僅吸入3次25%氧氣2 h；Ⅴ組大鼠僅放入麻醉箱，不做任何處理。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[11,12]Morris水迷宮是一個(gè)直徑為120 cm，高為50 cm的圓形水桶，其中有可移動(dòng)的水下平臺(tái)、圖像采集以及分析軟件。水池的上方設(shè)置東、南、西、北4個(gè)方向標(biāo)記，每兩個(gè)方向之間的距離相等，這4個(gè)方向在水面和水底的投影點(diǎn)將水桶分成4個(gè)均等的象限，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。在實(shí)驗(yàn)的過程中，水桶內(nèi)加入氧化鈦使得水變成不透明的乳白色，并將一個(gè)直徑為6 cm的平臺(tái)放置于水面下2 cm。水溫保持在25℃，圖像分析儀(CEFET,Curitiba,PR,Brazil)將自動(dòng)記錄大鼠從投入水桶到找到平臺(tái)的時(shí)間、速度以及游泳的距離。

在大鼠出生后第16～21天開始為期6 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)。前5 d進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，即每次將大鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找到水下平臺(tái)的時(shí)間，若大鼠超過120 s還未能找到平臺(tái)，用木棍指引其游上平臺(tái)并停留20 s，此次逃避潛伏期(Escape lantency，EL)記為120 s，每天進(jìn)行4次，第6天進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)以及空間探索實(shí)驗(yàn)，將水下平臺(tái)取出，記錄大鼠尋找水下平臺(tái)的時(shí)間以及在120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)以及原平臺(tái)象限活動(dòng)的時(shí)間，共4次。測試期間需保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境安靜、燈光昏暗并無特殊氣味，以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.2.2 檢測caspase-3的表達(dá) 在大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)后30 min，斷頸法處死大鼠，取腦組織用生理鹽水沖洗后在顯微鏡下解剖游離出雙側(cè)海馬組織并做好標(biāo)記，全過程在冰上進(jìn)行。用蛋白定量試劑盒(P0010S,Beyotime Institute of Biotechnology,China)檢測總蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，室溫放置2 h，與caspase-3的單抗(1∶1 000;Abcam ab47131) 4℃孵育過夜，用含0.05%Tween-20的TBS沖洗3次，每次10 min，用HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)1 h，用TBST沖洗3次，每次10 min，用DAB顯色，用凝膠圖像分析儀分析蛋白含量(Bio-rad,USA)。

1.2.3 TUNEL法檢測海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 取大鼠腦組織放入4%的多聚甲醛中固定24 h，采用冰凍切片機(jī)切取冠狀腦片置于載玻片上，每只大鼠5張切片，用4%多聚甲醛固定腦片15 min，用PBS溶液沖洗兩次，每次5 min，加入溶液(乙醇∶醋酸=2∶1)固定5 min，再次用PBS溶液沖洗2次，每次5 min，用3%過氧化氫溶于甲醇溶液浸洗15 min，用PBS溶液沖洗兩次，每次5 min，最后加入0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉溶液促滲2 min，再次用PBS溶液漂洗，每個(gè)樣本滴加50 μl Taq酶，充分反應(yīng)60 min后用PBS溶液漂洗，加入熒光素標(biāo)記液50 μl，再次用PBS溶液沖洗兩次后，加入DAB工作液50 μl室溫孵育顯色，PBS漂洗3次，用蘇木素復(fù)染幾秒后用自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片觀察。

在光學(xué)顯微鏡(Olympus，BX43)下觀察、計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，每只大鼠取5張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)其中的陽性細(xì)胞數(shù)量，染色陽性細(xì)胞的胞漿為棕褐色，即凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮平均逃避潛伏期的比較 各組水迷宮平均逃避潛伏期資料見圖1。結(jié)果顯示與第Ⅳ組大鼠相比，第Ⅰ組大鼠的逃避潛伏期無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第Ⅲ組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，和其他組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 各組水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)資料見圖2。結(jié)果顯示與第Ⅳ組相比，第Ⅰ組大鼠的穿越平臺(tái)的次數(shù)無明顯的變化；第Ⅲ組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，并且較第Ⅰ組以及其他各組大鼠也顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 大鼠運(yùn)動(dòng)能力的比較 第Ⅲ組大鼠的游泳速度在第1～5天均慢于其他組別。其中，第2、3、5天較第Ⅳ組明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組別的游泳速度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖1 大鼠平均逃避潛伏期Fig.1 Mean escape latency in ratsNote: *.P<0.05.

2.4 小鼠海馬區(qū)caspase-3的表達(dá) 在以上的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)接受3次七氟烷麻醉的大鼠在逃避潛伏期、空間探索實(shí)驗(yàn)以及運(yùn)動(dòng)能力均較其他組有差異，為了進(jìn)一步了解大鼠在接受七氟烷麻醉后是否發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，檢測了大鼠海馬區(qū)caspase-3的表達(dá)，見圖4。與第Ⅳ組大鼠相比，僅Ⅰ組大鼠caspase-3的表達(dá)稍有增加，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ組的大鼠caspase-3的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)Fig.2 Time of cross platform in ratsNote: *.P<0.05.

圖3 大鼠游泳速度Fig.3 Swimming speed in rats

圖4 Western blot檢測caspase-3的表達(dá)Fig.4 Expression of caspase-3 detected by Western blot

圖5 海馬區(qū)TUNEL染色Fig.5 TUNEL staining in hippocampus

圖6 TUNEL染色陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Statistical map of positive cells of TUNEL stainingNote: *.P<0.05.

2.5 Tunel染色檢測大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞 由于在上一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)接受七氟烷麻醉的大鼠caspase-3的表達(dá)增加，接下來在細(xì)胞層面上，我們用Tunel染色觀察大鼠海馬區(qū)的凋亡，發(fā)現(xiàn)，與蛋白的結(jié)果一樣，僅接受1次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細(xì)胞稍有增加，接受3次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細(xì)胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、6。

3 討論

近年來，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，吸入性麻醉藥會(huì)對(duì)未成熟大腦的神經(jīng)造成不同程度的損傷，而且在大腦發(fā)育的關(guān)鍵階段，吸入麻醉可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生退行性變和凋亡，進(jìn)而影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[13]。所以在本研究中，為了了解吸入性麻醉藥對(duì)大腦發(fā)育期的影響，我們選用健康6～8日齡新生SD大鼠作為研究對(duì)象，這個(gè)時(shí)期正是大鼠大腦神經(jīng)突觸發(fā)育的高峰期[14]。研究表明，學(xué)習(xí)和記憶的過程主要與大腦皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)、下丘腦、丘腦、海馬等腦區(qū)的參與有關(guān)，其中海馬區(qū)是由中間腦皮質(zhì)分化而來的結(jié)構(gòu)，并且被公認(rèn)為在陳述性記憶中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與學(xué)習(xí)記憶的功能有著非常密切的關(guān)系[15]，所以，在本研究中，我們選擇海馬區(qū)域來了解新生大鼠記憶功能的變化、并進(jìn)一步探究其神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡及可能的機(jī)制。

目前用于檢測動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的方法有很多，其中Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是被公認(rèn)的用來評(píng)價(jià)鼠類等嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典測試方法，其對(duì)大鼠的海馬組織的損害敏感性很高。Morris水迷宮的操作過程在水中進(jìn)行，能夠避免其他比如電刺激迷宮對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的刺激和傷害，并且能夠排除氣味對(duì)大鼠認(rèn)知的干擾，Morris水迷宮的測試指標(biāo)能夠比較全面的、系統(tǒng)的評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力，較為客觀的反映大鼠的認(rèn)知行為水平，所以在以大鼠的海馬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究中，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種具有優(yōu)越性的測試方法。大鼠的空間學(xué)習(xí)能力越好，其在實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期越短，穿越原平臺(tái)的次數(shù)越多，反之則說明大鼠的空間記憶能力差[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)接受一次七氟烷麻醉的大鼠在逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)以及運(yùn)動(dòng)能力方面與未接受麻醉組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而接受3次七氟烷麻醉的大鼠在這三個(gè)方面較未接受麻醉組均表現(xiàn)出明顯的能力降低，提示接受3次七氟烷麻醉的大鼠在早期空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。

以上的結(jié)果提示大鼠在麻醉后早期神經(jīng)元細(xì)胞可能發(fā)生變化導(dǎo)致大鼠的空間學(xué)習(xí)能力降低，而且上述結(jié)果僅是對(duì)大鼠的行為作觀察和研究，接下來，我們分別從蛋白層面和細(xì)胞層面上觀察麻醉后早期大鼠海馬區(qū)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受3次七氟烷麻醉的大鼠的海馬區(qū)caspase-3的表達(dá)明顯增加，并且觀察到明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提示接受多次七氟烷麻醉會(huì)使大鼠的大腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增多。

盡管在大鼠的模型上，我們發(fā)現(xiàn)多次七氟烷麻醉會(huì)使得大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力受損，但是七氟烷是否會(huì)對(duì)嬰幼兒產(chǎn)生同樣的影響還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究，本研究著眼于多次七氟烷麻醉對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的影響，期望能為臨床工作找到安全可靠的麻醉藥物，并為尋找較小神經(jīng)中樞毒性麻醉藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2016-08-02 修回2016-09-11]

(編輯 倪 鵬)

Effect of sevoflurane on learning and memory function and apoptosis of hippocampus in infant rats

YUANFen.

DepartmentofAnesthesiology,LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China

Objective:To explore the effect of sevoflurane on learning and memory function and apoptosis of hippocampus in infant rats.Methods: 100 SD rats aged 6-8 days were randomly divided into 5 groups(n=20),the group Ⅰinhaled 3% sevoflurane and 25% oxygen for 2 hours;the group Ⅱinhaled only 25% oxygen for 2 hours;the group Ⅲ inhaled 3% sevoflurane and 25% oxygen for 2 hours on the 6th,7th,8th day after birth;the group Ⅳ inhaled 25% oxygen for 2 hours on the 6th,7th,8th day after birth;group Ⅴ were just put into the anesthetized box without any treatment.When the rats were grown up to 16-21 days after anesthesia,the effect of learning and memory function were assessed by Morris water maze test,and activity of caspase-3 were detected by Western blot,the apoptosis of hippocampus were detected by tunnel.Results: ①Compared to group Ⅳ,the mean escape lantency of group Ⅰ showed no significant changes(P>0.05),while group Ⅲ was significant longer (P<0.05),which was significant different from other groups(P<0.05).②In the space exploration experiment,there was no difference between group Ⅰ and Ⅳ,but compared to group Ⅰ and other groups,the number of cross platform of group Ⅲ was decreased (P<0.05).③The swimming speed of group Ⅲ was significantly slower than the other groups.④Compared to group Ⅳ,the activity of caspase-3 slightly increased in group Ⅰ,and significantly increased in group Ⅲ(P<0.05).⑤The positive cells in hippocampus stained by TUNEL in group Ⅲ was significant increased (P<0.05).Conclusion: Learning and memory function of infant rats aged 6-8 days are impaired after three exposures to sevoflurane when they grow up to 16-21 days,and this may relate to the apoptosis of hippocampus.

Sevoflurane;Hippocampus;Learning and memory function;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.008

袁 芬(1978年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事麻醉方面的研究，E-mail:yuanfenfen_2007@163.com。

R392.32

A

1000-484X(2017)02-0201-05