唐麗媛 李 楠 繆希松 王 元 芮丹云 童 毅 王 波 李 臣 句紅萍 謝 力

(昆明學院醫(yī)學院分子醫(yī)學研究中心，昆明650214)

重組Ser17突變型hIFN-β腺病毒的構(gòu)建及其對結(jié)腸癌細胞的增殖抑制作用①

唐麗媛 李 楠 繆希松 王 元 芮丹云 童 毅 王 波 李 臣②句紅萍 謝 力

(昆明學院醫(yī)學院分子醫(yī)學研究中心，昆明650214)

目的：構(gòu)建表達突變型人源β干擾素(Ser17hIFN-β)的重組腺病毒，體外評價其對結(jié)腸癌細胞的抑制增殖作用及細胞周期的影響。方法：人工合成含Ser17突變型hIFN-β基因并克隆至穿梭載體pshuttle-CMV，pshuttle-Ser17hIFNβ與腺病毒骨架質(zhì)粒pAd同源重組后轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝重組腺病毒rAd-Ser17hIFNβ。 rAd-Ser17hIFNβ轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株HT-29，Western blot檢測rAd-Ser17hIFNβ在HT-29中的表達；MTT細胞生長實驗檢測rAd-Ser17hIFNβ對HT-29細胞的體外增殖的影響，流式細胞術(shù)檢測HT-29細胞周期改變情況。結(jié)果：重組腺病毒經(jīng)HEK293細胞擴增后滴度可達109.125CCID50/ml；Western blot檢測到外源性Ser17hIFN-β基因在HT-29細胞中的表達；rAd-Ser17hIFNβ轉(zhuǎn)染后HT-29細胞生長受到抑制(P<0.05)，細胞處于S期百分比增加。結(jié)論：表達Ser17突變型hIFN-β的重組腺病毒能抑制結(jié)腸癌細胞的增殖及誘導S期阻滯，為應用β干擾素對結(jié)腸癌進行基因治療提供了實驗基礎(chǔ)。

Ser17hIFN-β；結(jié)腸癌；重組腺病毒

干擾素(Interferon，IFN)是一類具有抗病毒,抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用的多功能細胞因子。人類體內(nèi)至少存在α、β、γ、δ、ω 5種類型的干擾素，根據(jù)干擾素的產(chǎn)生細胞、受體和活性等因素將其分為Ⅰ型和Ⅱ型[1，2]。Ⅰ型干擾素主要起抗病毒和抗腫瘤作用，包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ和IFN-ω等；Ⅱ型又稱免疫干擾素，主要起免疫調(diào)節(jié)作用,只包括IFN-γ。人源的IFN-β(human Interferon β，hIFN-β)是一種主要由成纖維細胞產(chǎn)生的糖蛋白，為單一基因產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量為23 kD。IFN-β與IFN-α具有相同的識別受體[3]，且生物學功能相似，都具有抗病毒、生長抑制和刺激免疫細胞活化等功能[4]。但兩者在氨基酸同源性上僅為30%，在核苷酸同源性上約為45%。對于多數(shù)癌細胞，人類的IFN-β顯示出比IFN-α更強的抑制腫瘤增殖的作用[5,6]。有研究表明：IFN-β可以通過促進機體免疫功能，提高巨噬細胞、NK 細胞和CTL 的殺傷水平等機制抑制和殺傷多種腫瘤細胞[7]。然而天然產(chǎn)生的hIFN-β血清中含量小，且半衰期很短，體內(nèi)難以達到發(fā)揮抗腫瘤作用的有效濃度[8]。

本實驗中我們構(gòu)建以腺病毒為載體的重組hIFN-β，并選用第17位氨基酸半胱氨酸Cys突變?yōu)榻z氨酸Ser的hIFN-β基因序列，在不影響其生物活性的情況下同時獲得更穩(wěn)定的表達產(chǎn)物。繼而以重組Ser17hIFN-β轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT-29細胞,觀察腺病毒載體表達的突變型hIFN-β對結(jié)腸癌細胞體外增殖及細胞周期的影響。旨在為重組IFN-β對結(jié)腸癌的基因治療提供臨床前的實驗參考。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞和主要試劑 E1、E3區(qū)缺陷的5型腺病毒表達系統(tǒng)pAdEasy-1、pShuttle-CMV和Ecoli BJ5183購自Stratagene公司；小鼠抗人IFN-β抗體購自Santa Cruz公司；脂質(zhì)體Lipofection2000購自Invitrogen公司；PacⅠ和PmeⅠ購自NEB公司，其余限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；人結(jié)腸癌細胞株HT-29購自中科院上海細胞庫；HEK293細胞、Ecoli DH5α、Ecoli XL10-Gold均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增Ser17hIFN-β基因 攜帶Ser17突變型IFN-β基因的質(zhì)粒合成自南京金斯瑞生物科技公司(Genebank號：GI:568815589)，序列合成時原始基因中第187位堿基由T突變?yōu)锳，即設(shè)計成熟IFN-β肽鏈中第17位氨基酸Cys突變?yōu)镾er。原始hIFN-β基因全長為840個堿基對(bp)，合成序列以編碼區(qū)(CDS)起始密碼子為起點，目的擴增編碼區(qū)長度為564 bp。轉(zhuǎn)錄生成的肽鏈中前端含21個氨基酸的信號肽，成熟的hIFN-β是信號肽切除后含166個氨基酸的蛋白分子，合成時設(shè)計其第17位氨基酸由Cys突變?yōu)镾er。

以合成質(zhì)粒pUC57-Ser17IFNβ為模板，PCR法擴增Ser17突變型IFN-β基因(表1)。反應條件：94℃預變性2 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，擴增25個循環(huán)，72℃延伸10 min，反應結(jié)束4℃保存。

1.2.2 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-Ser17hIFNβ的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收Ser17hIFN-β基因條帶，KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的Ser17hIFN-β片段和pShuttle-CMV載體，TaKaRa快速連接酶16℃連接目的片段和載體30 min。取5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，震搖45 min后涂布含卡那霉素的LB瓊脂平板，37℃倒置平板孵箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。次日挑取得到的單克隆菌落轉(zhuǎn)接入5 ml液體LB試管中，220 r/min搖床37℃孵育12～16 h增菌，取3 ml菌液小量提取質(zhì)粒后KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切陽性的質(zhì)粒經(jīng)測序確認插入的Ser17hIFNβ基因序列無誤。

1.2.3 重組腺病毒rAd-Ser17hIFNβ的構(gòu)建和鑒定 將獲得的pshuttle-Ser17hIFNβ用PmeⅠ單酶切線性化，再用CIAP進行5′去磷酸化處理，酶切產(chǎn)物與腺病毒骨架pAdEasy-1共同電轉(zhuǎn)化Ecoli BJ 5183感受態(tài)細胞進行同源重組。轉(zhuǎn)化電壓為2.5 kV，電阻200 Ω，電容25 μF，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB平板(Kan)37℃孵育18 h。PacⅠ單酶切鑒定重組質(zhì)粒pAd-Ser17hIFNβ后，挑選酶切陽性的pAd-Ser17hIFNβ轉(zhuǎn)化Ecoli XL10-Gold大量擴增質(zhì)粒。經(jīng)PacⅠ酶切線性化并純化后收獲重組質(zhì)粒(4 μg)，加入200 μl Opti-MEM后與脂質(zhì)體Lipofection2000等量混合，常溫放置20 min后轉(zhuǎn)染HEK293細胞。 轉(zhuǎn)染細胞6 h后換液，繼續(xù)37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)9～12 d，待細胞出現(xiàn)明顯病變后收獲原代重組病毒：將細胞反復凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清液。病毒液經(jīng)磷鎢酸負染后在透射電子顯微鏡下觀察病毒顆粒形態(tài)。

1.2.4 rAd-Ser17hIFNβ的傳代擴增與滴度檢測 將1 ml原代病毒液在T25培養(yǎng)瓶中接種細胞密度為80%的HEK293細胞，培養(yǎng)瓶內(nèi)換為含100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和2%FBS的高糖DMEM細胞維持液，37℃，5%CO2孵育48～72 h，待細胞充分病變后反復凍融8 000 r/min離心收獲第1代病毒。繼續(xù)在T25瓶的HEK293細胞上接種200 μl第1代病毒，48～72 h后收獲病毒。同樣方法將重組腺病毒傳代至第3代，Reed-Muench 法測定各代次重組腺病毒滴度。

表1 PCR擴增引物序列

Tab.1 Primer sequences used in PCR

GeneDirectionPrimersequences(5′?3′)RestrictionenzymesitesSer17IFN?βForwardGCGGTACCGTCACCATGACCAACAAGTGTKpnⅠReverseGCCCTCGAGGGTATCAGTTTCGGAGGTAACXhoⅠ

1.2.5 Western blot檢測rAd-Ser17hIFNβ在HT-29細胞中的表達 接種第3代重組腺病毒rAd-Ser17hIFNβ(MOI=20)至致密單層的六孔板HT-29細胞中，36 h后收獲感染細胞。RIPA裂解細胞，12 000 r/min離心3～5 min后取上清，Western blot法檢測其中目的蛋白Ser17hIFN-β的表達。10%SDS-PAGE分離蛋白樣品，重組蛋白經(jīng)4℃，40 V轉(zhuǎn)移2 h至PVDF膜。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用含3%BSA，0.05%Tween-20的PBS封閉60 min；小鼠抗人IFN-β一抗(1∶2 000稀釋)37℃搖床孵育2 h；HRP標記的山羊抗小鼠IgG多克隆二抗(1∶2 000稀釋)，37℃搖床孵育60 min，DAB顯色目的蛋白條帶。

1.2.6 MTT法檢測rAd-Ser17hIFNβ感染HT-29細胞的體外增殖情況 以100 μl/孔的體積將濃度為5 ×104ml-1的HT-29細胞接種96 孔板，待細胞貼壁后rAd-hIFNβ感染細胞(MOI=20)，同一樣本設(shè)8個復孔，并以未感染病毒的HT-29細胞作為對照。 37℃，5%CO2孵育16 h后，第1天開始每天同一時間取一塊96孔板,每孔加入濃度為5 mg/ml 的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄細胞上清,加入150 μl/孔DMSO充分溶解結(jié)晶，酶標儀測量各檢測孔在490 nm波長下的吸光度值(OD490)。同樣方法測定感染后第2～7天各樣本的OD490值。以各觀察天數(shù)的OD490值繪制細胞生長曲線。細胞生長抑制率=(1-實驗組OD490值/對照組OD490值)×100%。

1.3 流式檢測受rAd-Ser17hIFNβ感染的HT-29細胞周期 T25培養(yǎng)瓶中接種HT-29細胞,待生長至細胞密度30%～40%時，換為無血清RPMI-1640培養(yǎng)液24 h，使細胞同步靜止于G0期。用rAd-hIFNβ感染HT-29細胞(MOI=20)，4 d后收集細胞，70%乙醇4℃固定過夜，加入終濃度50 μg/ml的RNaseA 37℃作用1 h，再用終濃度100 μg/ml的熒光染料碘化丙啶(PI)室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測樣品細胞周期各時相百分比構(gòu)成情況。

2 結(jié)果

2.1 Ser17hIFN-β基因的擴增及pShuttle-Ser17-hIFNβ的鑒定 以質(zhì)粒pUC57-Ser17hIFNβ為模板，PCR擴增Ser17hIFN-β基因，1%瓊脂糖凝膠電泳在600 bp附近可觀察到與預期大小相符的清晰特異性條帶(圖1)；繼而鑒定將Ser17hIFN-β片段克隆至pShuttle-CMV后轉(zhuǎn)化生成的單克隆菌落，重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳可見接近600 bp的Ser17IFN-β基因片段和約7.5 kb大小的載體片段條帶(圖2)，證明pShuttle-Ser17hIFNβ構(gòu)建成功，酶切陽性質(zhì)粒經(jīng)測序確認插入的Ser17hIFN-β基因序列無誤。

2.2 重組腺病毒rAd-Ser17hIFNβ的構(gòu)建及電鏡下形態(tài)學觀察 線性化的pShuttle-Ser17hIFNβ穿梭質(zhì)粒與腺病毒基因組骨架pAdEasy-1進行同源重組，成功重組和一條3 kb或4.5 kb的小片段。本實驗篩選出的是電泳結(jié)果為4.5 kb 小片段的陽性克隆(圖3)。

圖1 Ser17hIFN-β基因PCR 擴增產(chǎn)物(564 bp)Fig.1 PCR amplification product of Ser17hIFN-β gene (564 bp)Note: Lane 1，2.Ser17 hIFN-β gene;Lane 3.DL 2000 marker.

圖2 重組質(zhì)粒pshuttle-Ser17 hIFN-β酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of recombinant pshuttle-Ser17 hIFN-β Note: Lane 1.DL 5000 marker；Lane 2，3.Pshuttle-Ser17 hIFN-β plasmids.

在HEK293細胞中傳代培養(yǎng)的重組腺病毒，細胞經(jīng)反復凍融后離心獲得病毒液，在透射電鏡下觀察可見無包膜，呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為80 nm的重組腺病毒顆粒(圖4)。

2.3 Ser17hIFN-β在HT-29細胞中的表達 包裝成功的原代重組腺病毒rAd-Ser17hIFNβ在HEK293細胞中連續(xù)傳代3次，微量滴定法檢測獲得了滴度為109.125CCID50/ml的病毒收獲液。用第3代rAd-Ser17hIFNβ感染HT-29細胞(MOI=20)，36 h后RIPA裂解被感染的HT-29細胞進行WB檢測，轉(zhuǎn)膜后可見約23 kD的特異性蛋白條帶，蛋白分子量與預期大小相符，證實Ser17hIFN-β可以經(jīng)重組腺病毒在結(jié)腸癌細胞HT-29中成功表達(圖5)。

2.4 rAd-Ser17hIFNβ感染HT-29后細胞生長曲線的變化 MTT法檢測rAd-Ser17hIFNβ感染HT-29后的細胞增殖情況，結(jié)果顯示：從感染后第3天開始,感染rAd-Ser17hIFNβ的HT-29細胞的OD490值顯著低于未轉(zhuǎn)染組HT-29細胞和空載體轉(zhuǎn)染組HT-29(P<0.05)，并一直持續(xù)至第7天，其中最大細胞生長抑制率出現(xiàn)于第6天，為45.7%(與未轉(zhuǎn)染組HT-29對比)。而空載體轉(zhuǎn)染組HT-29 的OD490值與未轉(zhuǎn)染組HT-29細胞相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

圖3 PacI酶切鑒定重組質(zhì)粒pAd-Ser17 hIFNβFig.3 Restriction enzyme digestion of recombinant pAd-Ser17hIFNβ by PacINote: Lane 1，2.pAd-Ser17 IFNβ plasmids;Lane 3.DL 10 000 marker.

圖4 透射電鏡觀察rAd-Ser17 hIFNβ重組腺病毒顆粒Fig.4 Morphology of recombinant rAd-Ser17hIFNβ particle observed by transmission electron microscope

2.5 Ser17hIFN-β基因?qū)T-29細胞周期的影響 流式細胞儀檢測感染rAd-Ser17hIFNβ的HT-29細胞周期各時相的分布情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染Ad-control空質(zhì)粒的HT-29細胞和未轉(zhuǎn)染外源基因的HT-29細胞周期各時相百分比分布接近(各時相百分比差異均<5%)；轉(zhuǎn)染了rAd-Ser17hIFNβ的HT-29細胞處于S期的構(gòu)成比增加(與轉(zhuǎn)染Ad-control的HT-29細胞和正常HT-29細胞相比均>10%),提示Ser17hIFN-β在細胞內(nèi)的表達可能減緩細胞DNA的復制,從而抑制結(jié)腸癌細胞的生長。

圖5 蛋白印跡檢測rAd-Ser17hIFNβ感染HT-29細胞后Ser17hIFN-β的表達Fig.5 Expression of Ser17hIFN-β in rAd-Ser17hIFNβ infected HT-29 cells detected by Western blotNote: Lane 1 prestained protein ladder;Lane 2 HT-29 cell lysis infected with rAd-Ser17hIFNβ.

圖6 HT-29細胞感染rAd-Ser17hIFNβ后的生長曲線變化Fig.6 Growth curves of HT-29 cells infected with rAd-Ser17hIFNβ by MTT assay

表2 Ser17hIFN-β基因?qū)T-29細胞周期各時相分布的影響

Tab.2 Effect of Ser17hIFN-β gene on cell cycle distribution in HT-29

CellcycleG0/G1(%)S(%)G2/M(%)HT?29621921731608HT?29(Ad?control+)580920951981HT?29(rAd?Ser17hIFNβ+)54923551957

3 討論

在腫瘤細胞因子療法中，干擾素是被應用于治療人類腫瘤最早、最廣泛的細胞因子，多項研究顯示干擾素可以延長腫瘤患者的無病生存期(DFS)，在體內(nèi)和體外試驗中均表現(xiàn)出抑制增殖和免疫調(diào)節(jié)的作用[9,10]。

天然hIFN-β前體分子由187個氨基酸組成，其中前21個氨基酸為信號肽序列，引導hIFN-β分泌出胞外。成熟的hIFN-β分子含有166個氨基酸，分別在17、31和141位氨基酸含有3個半胱氨酸。IFN-β分子還含有一個糖基鏈，尚未發(fā)現(xiàn)糖基對其生物學活性有影響。IFN-β的生物學作用有較強的種屬特異性[11]：例如小鼠IFN-β分子只有一個Cys17，分子內(nèi)無二硫鍵。而人IFN-β 31與141位半胱氨酸之間形成的分子內(nèi)二硫鍵對于IFN-β的生物學活性非常重要，Cys141被酪氨酸(Tyr)替代后完全喪失抗病毒作用，而Cys17被Ser替代后不僅不影響其生物學活性，反而可以增加IFN-β的分子穩(wěn)定性[12,13]。

在與腫瘤相關(guān)的研究中，IFN-β顯示出抑制瘤體血管生成和抗腫瘤細胞增殖的作用[14]。以IFN-β為目的基因?qū)δ[瘤進行基因治療的探索已有諸多報道：Wilderman等[15]同樣應用腺病毒載體攜帶IFN-β原位注射治療小鼠支氣管肺癌取得效果；Meijer等[16]利用腺相關(guān)病毒為載體腦室內(nèi)注射IFN-β治療小鼠腦膠質(zhì)母細胞瘤可完全抑制原位腫瘤生長并有效延長小鼠生存期；另外，重組IFN-β與化療藥物聯(lián)合使用也在不斷探索中，Streck等[17]用腺相關(guān)病毒表達IFN-β聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺治療小鼠神經(jīng)母細胞瘤；Villaverde等[18]也進一步證明IFN-β無論單獨轉(zhuǎn)染或者聯(lián)合常規(guī)抗腫瘤藥物對多種人類腫瘤細胞系都有抑制增殖的效果。

結(jié)腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，以手術(shù)為主輔助化療的策略近40年來對治療效果的提高并不顯著?！爸斡郧谐钡幕颊咝g(shù)后5年總體生存率長期停滯于50%～60%，而且約20%的患者確診時已存在轉(zhuǎn)移性病灶，這部分患者5年生存期僅10%左右。進一步擴大手術(shù)范圍并不能明顯改善預后，隨之而來的卻是更大的手術(shù)損傷和更多并發(fā)癥的風險，因此對結(jié)直腸癌的生物治療探索也越來越受到研究者的重視。

本研究以Ad5型復制缺陷型腺病毒為載體攜帶Ser17突變型hIFN-β轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞HT-29。以Ad-easy為代表的復制缺陷型腺病毒系統(tǒng)作為成熟的真核表達載體可高效方便地表達各類外源基因，且病毒載體不能自我復制，外源基因不整合入基因組，具有較高的安全性。腺病毒是唯一已獲準用于臨床的基因治療載體，被廣泛應用于各類腫瘤疫苗的研究中[19]。我們的實驗結(jié)果顯示，Ser17hIFN-β基因可以有效地在HT-29細胞內(nèi)表達，對比未轉(zhuǎn)染Ser17hIFN-β的HT-29，細胞的增殖明顯減緩，細胞周期變化受阻于S期，提示Ser17hIFN-β的導入可能誘導結(jié)腸癌細胞的生長抑制。雖然腫瘤的發(fā)生是多因素長期共同作用的結(jié)果，細胞因子對腫瘤直接或協(xié)同調(diào)節(jié)作用的復雜分子機制也尚未闡明，我們?nèi)韵Ｍㄟ^本實驗對Ser17hIFN-β重組干擾素的研究，可以為臨床腫瘤的輔助治療提供參考。

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[收稿2016-07-19 修回2016-09-05]

(編輯 張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.009

Inhibited effects of a recombinant adenovirus expressing Ser17mutant human interferon-β on proliferation of a human colon carcinoma cell line in vitro

TANGLi-Yuan,LINan,MIAOXi-Song,WANGYuan,RUIDan-Yun,TONGYi,WANGBo,LIChen,XIELi.

Kun-mingUniversity，SchoolofMedicine，Kunming650214，China

Objective:To investigate the effect of replication-defective recombinant adenovirus expressing Ser17mutant human IFN-β on the cell proliferation and cycle regulation of a human colon carcinoma cell line in vitro. Methods: Ser17mutant human IFN-β gene was inserted into a shuttle plasmid (pshuttle-CMV).The pshuttle-Ser17hIFNβ was transformed into Ecoli BJ5183 to make a homologous recombination with adenovirus skeleton genome (pAdeasy).And the recombinant plasmid pAd-Ser17hIFNβ was transfected into HEK-293 cell to produce mature adenovirus particles.The change of proliferation and cell cycle of rAd infected HT-29 were analyzed by MTT assay and FACS,respectively.Results: The recombinant adenovirus (rAd-Ser17hIFNβ) with the titer of 109.125CCID50/ml was produced.HT29 cells could be infected with the rAd-Ser17hIFNβ in 20 MOI.The expression of Ser17hIFN-β in HT-29 could be detected by Western blot.Significantly,the rAd-Ser17IFNβ inhibited the growth of HT-29 cells and prevented cell cycle progression in S phage in vitro.Conclusion: The recombinant adenovirus expressing Ser17-mutant human IFN-β could suppress the proliferation of colon carcinoma cell in vitro.It provides an experimental basis to apply the IFN-β gene therapy for colon carcinoma in the future.

Ser17hIFN-β；Colon carcinoma；Recombinant adenovirus

①本文受昆明市科技計劃重點項目(2015-1-S-00877)、昆明學院人才項目(YJ216002)和昆明學院科學研究項目資助(XJL12026)。

唐麗媛(1978年-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤的診斷及治療研究。

及指導教師：謝 力(1978年-)，男，博士，副教授，主要從事病毒疫苗與腫瘤的生物治療研究，E-mail：xieli1022@163.com。

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.007

R730.54

A

1000-484X(2017)02-0196-06

②昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院&云南省腫瘤醫(yī)院，昆明650118。